儿童嘌呤核苷磷酸化酶缺乏症1例报告并文献复习

目的分析总结儿童嘌呤核苷磷酸化酶缺乏症(PNPD)的临床特征。方法回顾分析1例PNPD患儿的临床资料,并复习相关文献。结果男性患儿,1岁9月龄,因面色苍白伴发热、咳嗽入院,既往有反复上呼吸道感染史,运动发育迟缓。血红蛋白88 g/L,网织红细胞11.35%,直接抗人球蛋白试验阳性,CD^(4+)/CD^(8+)T细胞比值低,尿酸水平低。胸部CT示胸腺发育不良。基因测序发现患儿PNP基因存在c.722T>C(p.I 241T)纯合变异,其父母均为该变异携带者。患儿确诊为PNPD,于2岁3月龄死于多脏器严重感染。文献检索到78例PNPD病例,发病无性别差异,发生反复感染53例,神经功能障碍51例,自身免疫病21例,继发肿瘤性疾病6例。结论对反复感染、神经功能障碍、自身免疫性疾病、CD^(4+)/CD8+T细胞比值降低、血尿酸水平低的患儿,需考虑基因缺陷致免疫缺陷病可能,基因序列分析可协助早期诊断。

嘌呤核苷磷酸化酶缺乏症患儿1例的临床及遗传学分析

目的本研究旨在探讨1例嘌呤核苷磷酸化酶缺乏症患儿的临床特征与遗传学病因。方法选取2021年4月至浙江大学医学院附属妇产科医院生殖遗传门诊就诊的1例嘌呤核苷磷酸化酶缺乏症患儿为研究对象。对患儿及父母进行家系全外显子组测序和生物信息学分析,并通过Sanger测序以及SNP-Array进一步验证变异。结果患儿存在PNP:c.150C>A变异和14q11.2拷贝数变异的复合杂合变异,Sanger测序和SNP-Array验证了这两个变异分别遗传自患儿的父亲和母亲。此变异类型在gnomAD、ClinVar及HGMD等数据库均未见收录。结论PNP基因的c.150C>A变异与14q11.2拷贝数变异形成的复合杂合变异可能是该患儿的遗传学病因。这些发现为患儿父母提供了遗传咨询和产前诊断的依据,并进一步拓宽了PNP基因的变异谱。

嘌呤核苷磷酸化酶/嘧啶核苷磷酸化酶共表达及固定化催化合成阿糖核苷

将嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)和尿苷磷酸化酶(UP)进行共表达和双酶固定化,提高生物法合成阿糖核苷过程中底物转化率和催化剂稳定性。首先,构建大肠杆菌内源(PNP)和(UP)过表达工程菌,考察工程菌催化不同阿糖核苷之间转化的效率。将PNP和UP双酶固定化,并对固定化双酶进行回收利用,考察重复使用过程中固定化双酶的催化效率。结果表明:工程菌催化阿糖尿苷和腺嘌呤生成阿糖腺苷的反应最高转化率可达93.6%。固定化双酶催化合成阿糖2,6-二氨基嘌呤核苷的最高转化率可达99.8%。重复回收使用固定化双酶19次后对底物的转化率达到60.6%,累计有效催化时长可达684 h。PNP和UP的双酶耦合体系能高效催化阿糖核苷之间的转化,固定化修饰有利于延长酶的使用寿命,为生物法生产核苷类似物提供重要科学参考。

嘌呤核苷磷酸化酶基因的克隆及原核表达载体的构建

通过PCR方法从产气肠杆菌、胡萝卜软腐欧文氏菌、大肠杆菌扩增嘌呤核苷磷酸化酶(PNPase)基因,然后将扩增的约720bp的基因片段克隆到pET-28b表达载体上,构建重组PNPase的表达载体。核苷酸及推导的氨基酸序列分析表明,该基因在三个菌株之间有很高的同源性。SDS-PAGE电泳结果显示出明显的特异性蛋白质条带,其分子量约为29.8kDa.该载体的构建为进一步研究核苷及其类似物的生物合成奠定基础。

嘌呤核苷磷酸化酶检测体系优化及芒果苷对其活性的影响

目的优化体外嘌呤核苷磷酸化酶(purine nucleoside phosphorylase,PNP)活性检测体系,研究芒果苷及芒果苷元对PNP活性的影响。方法采用紫外分光光度法,通过考察酶浓度、底物浓度、二硫苏糖醇(DTT)浓度对酶促反应的影响,确定检测酶活性的最适反应条件,以此为基础研究芒果苷和芒果苷元对PNP活性的影响。结果成功建立并优化了体外PNP活性检测体系,反应温度为25℃时,在磷酸钾盐缓冲液中,当PNP浓度为250 U·L-1、底物鸟苷为400μmol·L-1、DTT为0.5 mmol·L-1的反应条件下于波长258nm处动态监测15 min,芒果苷及其代谢产物苷元在浓度高达100μmol·L-1时,对PNP活性无明显抑制作用。结论以优化的PNP活性检测体系研究发现芒果苷及芒果苷元体外对PNP活性无影响。

嘌呤核苷磷酸化酶活性和外源性透明质酸吸收率对大鼠肝脏缺血再灌注损伤的研究

目的:探讨嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)活性和外源性透明质酸(HA)吸收率对大鼠肝脏低温保存及常温缺血再灌注损伤的作用。方法:将大鼠肝脏在UW﹑Celsior和HTK3种不同保存液中低温保存16、24h后,用37°CKrebs-Henseleit液连续循环灌注90min,分别于不同灌注时间检测灌洗液中PNP活性和外源性HA吸收率的变化。结果:低温保存16h和24h,UW和Celsior组再灌注60min与15min比较,PNP活性明显增高(P<0.05),而HTK组再灌注30min则显著增高;低温保存16h,UW和Celsior组再灌注60min与15min比较外源性HA吸收率明显下降(P<0.05),而HTK组再灌注30min出现外源性HA吸收率明显下降;低温保存24hUW组再灌注60min外源性HA吸收率明显下降,而Celsior和HTK组30min即出现外源性HA吸收率明显下降。结论:PNP和HA吸收率可作为评价肝脏缺血再灌注损伤的指标。

大肠杆菌嘌呤核苷磷酸化酶基因真核表达载体的构建及其在MKN-45细胞中的表达

目的克隆大肠杆菌嘌呤核苷磷酸化酶(EPNP)基因并构建真核表达载体pcDNA3.1-EPNP,将重组质粒转染MKN-45细胞获得高表达大肠杆菌PNP基因的MKN-45细胞克隆。方法根据Gen-bank中大肠杆菌PNP基因的核苷酸序列,设计并合成了一对引物,以大肠杆菌基因组DNA为模板,进行PCR扩增,并将扩增产物定向插入pMD-18T克隆载体中进行序列测定,测序正确后将其亚克隆至表达载体pcDNA3.1,利用脂质体将重组质粒转染MKN-45细胞。结果PCR扩增出716bp大小的片段,测序结果与已报道的EPNP基因序列一致;亚克隆经酶切鉴定正确;RT-PCR证明经G418筛选得到的转基因MKN-45细胞克隆中存在大量EPNPmRNA,前体药MePdR对转染EPNP的MKN-45细胞有较强的细胞毒作用。结论成功构建了大肠杆菌PNP基因的真核表达载体,获得了稳定表达大肠杆菌PNP基因的MKN-45细胞克隆,为PNP/MepdR自杀基因系统在胃癌基因治疗中的应用奠定了良好的基础。

大肠杆菌嘌呤核苷磷酸化酶自杀基因对人胃癌细胞的作用

目的:探讨大肠杆菌嘌呤核苷磷酸化酶自杀基因对胃癌细胞MKN-45的抑制及杀伤作用,并证实旁观者效应。方法:构建真核表达载体pcDNA3.1-ePNP,将重组载体转染MKN-45细胞获得高表达大肠杆菌嘌呤核苷磷酸化酶基因(ePNP)的MKN-45细胞克隆。在MKN-45/ePNP细胞培养物中加入前体药物MePdR,观察MePdR对该细胞的杀伤作用及旁观者效应。结果:随MePdR浓度的增大,MKN-45/ePNP细胞的生存率逐步下降,在MePdR浓度达到1 mg.L-1时MKN-45/ePNP细胞全部被杀灭,而未经转染的MKN-45细胞的生存率则不受影响,MePdR对MKN-45/ePNP有显著的抑制及杀灭作用;当MKN-45/ePNP细胞占总细胞的10%时,全部细胞被杀死。结论:ePNP/MePdR自杀基因系统对胃癌细胞有生长抑制及杀伤作用并具有旁观者效应。

枯草芽孢杆菌TM903嘌呤核苷磷酸化酶的纯化及酶学性质研究

目的:对枯草芽孢杆菌TM903嘌呤核苷磷酸化酶进行分离纯化及酶学性质研究。方法:经加热、硫酸铵盐析和SephadexG-100凝胶过滤,对枯草芽孢杆菌TM903中的嘌呤核苷磷酸化酶进行分离纯化,并对其酶学性质进行研究。结果:酶的最适反应温度为65℃,最适反应pH值为7.5,在30～50℃时热稳定性较好;K+对该酶有激活作用,而Na+、Ca2+、Mg2+、Mn2+等金属离子对该酶有抑制作用;Km值为2.11mmol/L,Vmax值为0.84mmol/(min·L)。结论:分离纯化了枯草芽孢杆菌TM903嘌呤核苷磷酸化酶,并研究了其酶学性质,为利巴韦林的发酵工艺优化提供了重要的酶学理论基础。

嘌呤核苷磷酸化酶/氟达拉滨(PNP/fludarabine)自杀基因系统对人肝癌细胞系BEL7402体外杀伤效应的研究

背景:肿瘤细胞内表达的自杀基因可将无毒性的前药转化为高毒性代谢产物以杀伤肿瘤细胞,嘌呤核苷磷酸化酶/氟达拉滨(PNP/fludarabine)自杀基因系统具有目前已知最强的旁观者效应,成为基因治疗领域中的研究热点。目的:研究PNP/fludarabine自杀基因系统对人肝癌细胞系BEL7402的体外杀伤效应。方法:应用聚合酶链反应(PCR)从大肠杆菌K12菌株基因组DNA扩增PNP基因,通过8个甘氨酸的接头克隆至真核表达载体pEGFP鄄N1。将pEGFP鄄N鄄PNP以Lipofectamine2000转染BEL7402细胞,G418筛选,直至出现抗性克隆,命名为BEL7402/PNP。应用逆转录(RT)鄄PCR和RNA印迹法(Northernblotting)鉴定PNP基因的表达。分别应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法和AnnexinV鄄FITC凋亡检测试剂盒检测PNP/fludarabine自杀基因系统对BEL7402细胞的细胞毒效应、旁观者效应和诱导凋亡作用。结果:RT鄄PCR和RNA印迹法证实转染的PNP基因能在BEL7402和BEL7402/PNP细胞中表达。低浓度fludarabine对经PNP基因转染的BEL7402细胞具有明显的细胞毒效应;旁观者效应检测显示,10%的BEL7402/PNP细胞与90%的BEL7402细胞混合,经低浓度fludarabine处理,90%的细胞可被杀死;细胞凋亡检测显示,PNP/fludarabine自杀基因系统对BEL7402细胞具有明显的诱导凋亡作用。结论:PNP/

大肠杆菌嘌呤核苷磷酸化酶基因的克隆与真核表达载体的构建

根据Ｇｅｎｂａｎｋ中大肠杆菌嘌呤核苷磷酸化酶（ＰＮＰ）基因的核苷酸序列，设计并合成了一对引物，以大肠杆菌基因组ＤＮＡ为模板，进行ＰＣＲ扩增，并将扩增产物定向连接到克隆、测序及真核表达载体ＰＣＤＮＡ３中，进行酶切鉴定、测序及序列分析。结果表明ＰＣＲ扩增出７４１ｂｐ大小的片段，通过酶切和序列分析证明含完整的ＰＮＰ基因序列且基因插入方向正确，此序列与文献报道的ＰＮＰ基因的同源性为９９．７％。说明克隆的ＰＮＰ基因与文献报道的基本一致，ｐｃＤＮＡ３－ＰＮＰ的构建成功为今后用其进行基因转染来研究ＰＮＰ／Ｍｅｐ－ｄＲ自杀基因系统在肿瘤基因治疗中的应用打下了基础。

心肌缺血预处理对嘌呤释放和嘌呤核苷磷酸化酶活性的影响

【目的】研究心肌缺血预处理对离体大鼠心脏嘌呤代谢与嘌呤核苷磷酸化酶的影响。【方法】将24只大鼠随机分为2组,采用Langendorff离体心脏灌注模型。缺血预处理组心脏经每次3 min缺血+3 min再灌注,循环3次,而后保持持续工作状态10 min;对照组心脏保持持续工作状态10 min。使用高效液相色谱技术测定嘌呤代谢产物(尿酸、黄嘌呤、次黄嘌呤、次黄苷)及嘌呤核苷磷酸化酶的活性。比较对照组与缺血预处理组嘌呤碱基的释放速率与嘌呤核苷磷酸化酶的活性。【结果】心肌缺血预处理组嘌呤碱基的释放降低(P<0.05),并且尿酸为嘌呤释放的主要成分;与总嘌呤释放减少相反,次黄苷的释放有所增加(P<0.05);遭受缺血处理后嘌呤核苷磷酸化酶的活性降低(P<0.05)。【结论】实验结果表明心肌缺血预处理调节离体心脏嘌呤代谢速率,修饰嘌呤核苷磷酸化酶成为导致次黄苷间接生成增加的原因。

嘌呤核苷磷酸化酶温敏型表达载体的构建、表达及应用于腺苷转化的研究

通过双酶切方法将重组质粒上大肠杆菌嘌呤核苷磷酸化酶(PNPase)基因克隆到pBV220表达载体上,构建了温敏型PNPase的表达载体pBV 220-PNP,转化大肠杆菌DH5α并使之表达.SDS-PAGE电泳结果显示出明显的特异表达条带,其分子量约为26 kDa.在此基础上研究了不同诱导条件对蛋白表达量的影响.分别以肌苷和尿苷为核糖供体研究重组菌转化腺苷的条件,发现肌苷最适合作为核糖供体,在30 mmol.L-1pH 7.5的Na2HPO4-KH2PO4缓冲液中,以30 mmol.L-1肌苷和10 mmol.L-1腺嘌呤作底物,加入0.5%基因工程湿菌体60℃反应3 h,腺苷的转化率为85.57%.

合成利巴韦林的关键酶嘌呤核苷磷酸化酶的原核表达及活性分析

目的:在枯草芽孢杆菌中表达嘌呤核苷磷酸化酶(PNPase)并分析其活性。方法:将PNPase的编码基因deoD克隆入pDG148表达载体,构建原核穿梭型表达载体pDG148-deoD,采用电转化方法将表达载体转入枯草芽孢杆菌WB600后诱导表达重组PNPase;研究重组PNPase的活性。结果与结论:获得的重组PNPase活性较对照提高了193.9%,其最适催化条件为65℃、pH7.5、500μmol/L底物浓度和1%1,2,4-三氮唑-3-羧甲酰胺;对重组菌的发酵条件进行了初步优化,IPTG诱导6h后在发酵液中添加0.5%的Tween-80能大幅度提高重组PNPase的酶活力。

relA基因在重组大肠杆菌BL21合成嘌呤核苷磷酸化酶作用研究

利用Red同源重组技术敲除大肠杆菌BL21中relA基因,获得△relA突变株。进一步研究表明在LB复合培养中relA基因对大肠杆菌的生长几乎没有明显影响,但是对其重组蛋白的合成有着较大的影响:降低了25%。结果表明,relA基因在大肠杆菌表达重组蛋白方面有着较重要的作用。

嘌呤核苷磷酸化酶与嘧啶核苷磷酸化酶的融合表达及酶法合成嘌呤核苷类产物

将嘌呤核苷磷酸化酶与嘧啶核苷磷酸化酶进行融合,提高生物酶法催化合成克拉屈滨等嘌呤核苷类产物的产率。设计不同的刚性、柔性连接短肽(Linker),将嘧啶核苷磷酸化酶EcUP与嘌呤核苷磷酸化酶AmPNP连接融合,考察酶融合蛋白的可溶性表达与活性情况。使用EEEEEEKKK短肽连接的融合蛋白EcUP-L4-AmPNP可溶性表达水平较高,并对嘌呤核苷与嘧啶核苷均具有反应活性,对嘌呤核苷的水解率远小于嘧啶核苷。研究发现:融合酶EcUP-L4-AmPNP催化合成克拉屈滨等嘌呤核苷类产物的产率70.4%~98.3%,合成产率比分别加入酶EcUP和酶AmPNP的游离双酶体系提高了约1.5~2.0倍。核苷磷酸化酶的融合蛋白有利于实现高效催化合成嘌呤核苷产物,生物催化合成克拉屈滨等几种嘌呤核苷类产物的产率显著提高。

参环毛蚓体内核苷磷酸化酶的活性测定及动力学分析

目的建立参环毛蚓体内嘌呤核苷磷酸化酶（PNP）的检测方法,以肌苷为底物,评价该酶的活性。方法采用HPLC法,色谱条件：Ecosil C18-AQ柱（250 mm×4.6 mm,5μm）,流动相为10 mmol·L^-1磷酸二氢铵缓冲液（p H4.5）和甲醇,梯度洗脱,流速为0.8 m L·min^-1,柱温为室温,检测波长254 nm,用底物肌苷与组织粗蛋白提取液在室温孵育30 min,沸水煮5 min终止反应,12000 r·min^-1离心10 min,取上清过滤后进行HPLC分析,以Origin Pro 8.5软件作图,计算酶动力学参数。结果酶反应中产物次黄嘌呤在0.5-40μmol·L^-1范围内呈良好的线性关系（r=0.9996）;精密度小于3.5%,回收率大于80%。PNP酶动力学参数：Vmax为0.015nmol·min^-1·mg^-1,Km为19.8μmol·L^-1。结论成功构建了参环毛蚓体内次黄嘌呤代谢酶活性测定相关的实验体系,该法所得数据稳定可靠,可准确反映关键酶活性的动态变化。