测定人红细胞嘧啶5′核苷酸酶含量的双抗体夹心ELISA方法

为了进一步探讨嘧啶 5′核苷酸酶 (P5′N)缺乏症的发病机制 ,我们利用P5′N的特异性底物尿苷一磷酸 (UMP)作为配基 ,制备尿苷一磷酸 己二酰肼 琼脂糖 4B(UMP ADH Sepharose 4B)亲和层析柱 ,结合硫酸铵分级分离和沉淀、离子层析及亲和层析等方法提纯人红细胞P5′N。将所得P5′N免疫家兔 ,获得兔抗人抗体。以兔抗人P5′N抗体为包被抗体 ,辣根过氧化物酶 (HRP) 兔抗人P5′N抗体为显示抗体 ,经方阵法、抗原阻断试验及抗原替代试验后 ,建立定量测定人红细胞的P5′N双抗体夹心酶联免疫吸附实验。实验结果显示 ,所得兔抗人红细胞P5′N抗体效价为 1∶4 ,所建双抗体夹心ELISA法灵敏度为 5ng ml,其阻断率大于 95 %,而取代率小于 30 %。同时 ,测定正常人红细胞P5′N含量为 (71.77± 10 .98)ng mgNHP。该法特异性强 ,敏感性高 ,可检测最低含量为 5 - 2 0ng ml的P5′N含量 ,在临床上能适应大样本测定。

双抗体夹心ELISA法测定正常人红细胞中的嘧啶5′核苷酸酶含量

我们在提纯嘧啶5′核苷酸酶(P5′ Nase)的基础上,建立了双抗体夹心ELISA法定量测定正常人红细胞P5′ Nase的含量,并与其酶活性作对比,以期为P5′ Nase缺陷症的诊断和研究提供一种新方法.……