利用甲基纤维素改良的病毒噬斑技术

目的探究病毒噬斑实验的方法寻找其改良之处,为实验操作提供方便。方法用甲基纤维素代替琼脂糖覆盖病毒感染后的细胞。结果改良后的新方法在进行登革病毒滴度检测时相较于传统方法,可形成均匀、清晰的噬斑,复孔重复性好,而且噬斑在实验后2年内仍保存完好,与背景形成明显对比,便于复查。结论利用甲基纤维素的病毒噬斑技术,省时省力节约成本且便于操作,是一个值得推广的有价值的实验方法。

一种改良的快速筛选重组DNA噬菌体噬斑的原位杂交技术

报道了一种从表达型噬菌体载体——λgt11构建的基因文库中筛选重组DNA噬菌体噬斑的改良蛋白质-蛋白质原位杂交枝术。此法可使噬菌体在硝酸纤维素薄膜上增殖至原噬斑大小,经适当处理后,即可用特异性抗体探针进行原位筛选,以 获得含目的基因编码的特异抗原蛋白的阳性克隆株。与己报道的筛选方法相比,此法具有简便快速、灵敏可靠的特点;也可试用于由表达型质粒载体构建的基因文库之菌落原位筛选。

滴定痘苗病毒的噬斑血吸附法的优化

目的对滴定痘苗病毒的噬斑血吸附法进行优化,克服该方法稳定性差、结果数据偏差大的问题。方法通过预试验确定痘苗病毒的最佳稀释倍数、病毒吸附温度及鸡血球加入方法等参数。采用优化的噬斑血吸附法,对天坛株痘苗病毒的原始种子批、主种子批、工作种子批和参考苗进行滴定,计算变异系数(CV),确定试验内、试验间和不同实验人员间的精密度。利用Qstat软件分析本次与以往滴定结果之间的关系。结果病毒的最佳稀释度为10-6,最佳吸附温度为25～30℃,加入鸡血球的最佳方法为病毒吸附72h后,弃去部分培养液,再加入鸡血球。4种样品测定结果的试验内、试验间和不同实验人员间的变异系数均小于5%,病毒滴度分别为(7.12±0.18)LgPFU/ml、(7.79±0.21)LgPFU/ml、(7.88±0.17)LgPFU/ml和(7.64±0.14)LgPFU/ml,均高于以往滴定结果。本次与以往滴定结果之间存在线性相关性。结论优化了滴定痘苗病毒滴度的噬斑血吸附法,确定了天坛株痘苗病毒的原始种子批、主种子批、工作种子批和参考苗的滴度,为天花疫苗多项检定试验提供了可靠依据。

乙型脑炎减毒活疫苗噬斑实验的影响因素分析

为基础医学专业开设分子病毒学实验课程,开展系列创新性综合教学实验项目,其中包括乙型脑炎减毒活疫苗噬斑实验,现拟分析该实验的影响因素。利用含甲基纤维素的最低必需培养液(MEM)培养基覆盖感染乙型脑炎减毒活疫苗SA14-14-2株的Vero细胞,培养数日后,以结晶紫染色,计数噬斑并计算病毒滴度。结果显示Vero细胞对乙型脑炎减毒株易感性强,易形成噬斑,操作简单,结果可重复性好。本实验可有效提升基础医学专业学生的综合实验能力,培养科研素质,使学生初步具备独立开展科学研究的能力。

狂犬病毒滴度检测噬斑法(PFU)的建立及应用

目的 建立狂犬病毒滴度的快速、经济的检测方法-噬斑法（PFU）,验证其与小鼠脑内攻击法（计算LD50）的相关性,并用于PM株狂犬病毒的滴度测定. 方法 狂犬病毒做10倍系列稀释,然后接种于单层BHK21细胞上, 37℃、5%CO2吸附1h后,加入覆盖液, 33℃、5%CO2培养7～10天后用1.5%的结晶紫染色.用建立的噬斑法和小鼠脑内攻击法同时测定狂犬病毒的滴度,以比较两种方法的相关性和重复性.结果 两种方法测定狂犬病毒滴度的结果差异无统计学意义,相关系数为0.939,两种方法的检测结果呈良好的正相关性.结论 噬斑法可替代小鼠脑内滴定法检测狂犬病毒滴度.

G6P[1]型牛轮状病毒的分离培养及鉴定

目的从轮状病毒阳性的牛粪便标本中,分离出一株G6P[1]型牛轮状病毒(Bovine Rotavirus,BRV),对其进行培养和鉴定。方法用PBS溶液重悬粪便标本并离心,将其上清过滤除菌和胰酶处理后,利用MA104细胞进行分离培养;通过逆转录-聚合酶链式反应(Reverse Transcription-polymerase Chain Reaction,RT-PCR)对样本VP4和VP7基因进行扩增和测序,与GenBank上的参考序列进行同源性分析,构建进化树,分析确定其G/P基因分型。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳法(Polyacrylamine Gel Electrophoresis,PAGE)、噬斑实验和电镜(Transmission Electron Microscope,TEM)等技术对分离到的病毒进行鉴定和纯化。绘制病毒生长动力学曲线。结果分离培养了1株BRV毒株,将其命名BLL。VP7和VP4基因测序结果显示此毒株为G6P[1]型轮状病毒。PAGE胶结果显示分离株电泳型为长型,条带呈现A组轮状病毒排列电泳图谱;通过噬斑实验将毒株进行了纯化。电镜检测到典型的轮状病毒颗粒。病毒生长动力学曲线可发现病毒在感染后6 h已经开始复制。结论本研究成功分离到G6P[1]型牛型轮状病毒,为研究G6P[1]型轮状病毒的病原学特征提供实验基础和技术参考。

蓝细菌病毒A-4L在鱼腥藻(Anabaena variabilis)藻苔中形成同心圆噬斑的成因

【目的】分析蓝细菌病毒A-4L在鱼腥藻(Anabaena sp.)PCC 7120藻苔中形成同心圆噬斑的原因,阐明A-4L的一个重要生物学特征,为分离、鉴定和筛选新的水华蓝藻病毒提供借鉴。【方法】用初始滴度为2.8×1010PFU/mL的A-4L悬液感染鱼腥藻,在不同时间点收集裂解液绘制一步生长曲线,获得A-4L对鱼腥藻的潜伏期和释放量。将适量A-4L悬液感染不同培养时间的藻苔,逐日观察和记录藻苔病变情况。培养藻苔并接种适量A-4L悬液,分别置于完全持续光照(Light∶Dark=24 h∶0 h,L∶D=24 h∶0 h)条件;完全周期光照(L∶D=14 h∶10 h)条件;或前3 d周期光照转后3 d持续光照的条件下,比较不同光照条件对同心圆噬斑形成的影响。然后挑取单个噬斑进行扩大培养,纯化后,负染电镜观察A-4L的超微形态。【结果】A-4L的潜伏期为0.5-2 h,释放量约为247 IU/cell(Infectious Units)。在周期光照条件下,藻苔接种A-4L 3-4 d后,出现同心圆噬斑,且同心圆数量与攻毒后的天数(n)有相关性,为"n-1";同心圆间距约为3 mm。与周期光照条件相比,在持续光照条件下未形成同心圆噬斑。而在周期光照条件转持续光照条件下,由先周期光照时所形成的同心圆在转持续光照后逐渐消失,证实同心圆噬斑的形成依赖于周期光照。负染电镜观察显示A-4L具有一个近似球形的头部,直径约为50 nm以及长度约为10 nm的尾部,形态与短尾蓝细菌病毒相似。【结论】A-4L是一株能形成同心圆噬斑的蓝细菌病毒,并揭示其同心圆噬斑形成的关键条件是周期光照。

不同固定液对Vero E6细胞形态和染色的影响及在病毒噬斑分析中的应用

病毒噬斑形成实验是确定病毒滴度的重要方法,其中噬斑染色是非常关键的步骤,而良好的固定液不仅能够维持细胞形态,也能起到助染作用,是有效识别病毒噬斑的关键因素。为了研究不同固定液对Vero E6细胞形态和结晶紫染色效果的影响,本研究采用五种固定液对Vero E6细胞进行固定(100%甲醇、4%甲醛、10%甲醛、75%乙醇和95%乙醇)。以只加PBS缓冲液的细胞作为对照组。细胞固定30 min后利用1%结晶紫进行染色。利用光学显微镜和肉眼观察细胞形态,从而评价固定和染色效果。结果显示,10%甲醛的细胞固定效果最佳,细胞形态良好,细胞染色均匀且着色深,利用该固定剂能在病毒噬斑实验中很好的识别噬斑,是Vero E6较为理想的固定剂。

成都市主要河流水中噬菌蛭弧菌的调查

本文对成都市５条主要河流水中的噬菌蛭孤菌进行了调查，结果表明，所查的５条河流中均有噬菌蛭弧菌存在，其平均含量为２．１×１０４ＰＦＵ／ｍｌ，最高达１．０×１０６ＰＦＵ／ｍｌ，最低为４．０×１０２ＰＦＵ／ｍｌ，且噬菌蛭弧菌的含量与河流的污染程度有关，污染越严重则本菌含量越高，同时，根据噬斑特征的差异，从水样中分纯了五株蛭弧菌，不同的菌株其噬菌能力不同。

大豆根瘤菌蛭弧菌的发现

从我国的一些大豆产区土壤中分离出四种大豆根瘤菌的噬菌蛭弧菌,对它们的培养特征、宿主范围以及其它生物学特性进行了初步研究,发现:大豆根瘤菌蛭弧菌具有典型的蛭弧菌特征,有极广泛的寄主范围和很强的裂解大豆根瘤菌的能力。它是影响结瘤效果和降低大豆产量的主要生物因子之一。

表达EGFP重组猪繁殖与呼吸综合征病毒的构建与鉴定

RT-PCR获得猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)XZ06a株基因组,在基因组5’末端、3’末端分别添加锤头样核酶、丁型肝炎病毒核酶序列,并插入改造的pCAGEN表达载体中,构建DNA-launched感染性克隆,然后在病毒基因组ORF1b与ORF2间引入ORF6 TRS序列、酶切位点及EGFP基因,转染Marc-145细胞拯救表达EGFP的重组病毒并噬斑克隆纯化,Western blot检测EGFP表达并对获得的表达EGFP的重组病毒进行TCID50测定与分析。结果显示:PRRSV基因组大小为15145 nt,转染后5~7 d即可观察到重组病毒所致特异性病变灶,经过噬斑纯化,能够观察到携带EGFP基因的重组病毒在对应病变灶均有绿色荧光,最终获得稳定表达EGFP的重组病毒,且重组病毒感染16 h时即可检测EGFP表达;与亲本病毒相比,表达EGFP重组病毒致细胞出现病变时间有所延长,增殖滴度有所降低。本研究成功构建了表达EGFP的重组PRRSV,为开展PRRSV病毒复制机制、感染特性、致病机制、疫苗开发等研究奠定了基础。

福氏志贺菌临床分离株毒力基因的研究

目的研究在一种快速、特异的mPCR方法在检出福氏志贺菌的同时对其毒力进行监测。方法选取福氏志贺菌三种毒力基因ipaH,ial,set1B作为扩增目标,在同一mPCR体系中对86株福氏志贺菌临床分离株进行了检测,并选取12株进行了噬斑形成试验,观察了扩增产物不同的福氏志贺菌对Hela细胞的毒力作用。结果86株福氏志贺菌临床分离株均检测到ipaH基因,阳性率为100%;45株检测到ial基因,阳性率为52%;69株检测到set1B基因,阳性率为80%。噬斑形成试验证明,mPCR结果不同的菌株对Hela细胞的感染能力存在明显差异。结论应用上述mPCR体系在检出福氏志贺菌的同时能够对菌株的毒力进行初步判别,对于临床诊断及治疗具有重要意义。

肠道病毒71型在RD细胞和Vero细胞中的增殖动力学特征

目的:利用噬斑法比较肠道病毒71型(EV71)在RD细胞和Vero细胞中的增殖动力学特征。方法:首先探讨培养基类型、羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、胎牛血清(FBS)、牛血清白蛋白(BSA)及甲基纤维素(MC)含量对EV71噬斑形成的影响,得到最适营养覆盖物配比;进一步,EV71以感染复数(MOI)为0.1分别接种RD细胞和Vero细胞,收集接种后不同时间点的细胞培养液,噬斑法测定各时间点培养液上清中的病毒滴度,并绘制log2(病毒滴度)-时间图,对比分析EV71在2种细胞中的增殖动力学特征。结果:终浓度含1%MC和2%FBS的MEM(1×)或DMEM(1×)为EV71噬斑形成的最适营养覆盖物;EV71在RD细胞和Vero细胞中的增殖周期均约为12 h,MOI=0.1时,EV71在RD细胞中的增殖活动较Vero细胞中活跃,增殖效率比Vero细胞中高2个数量级。结论:用RD细胞扩增EV71比Vero细胞更具优势。

人VEGF基因昆虫杆状病毒表达载体的构建

为了在昆虫杆状病毒表达系统表达人血管内皮细胞生长因子 (VEGF)基因 ,用HindⅢ对 pcDNA3 .1 /VEGF进行酶切 ,回收 5 75bp的VEGF片段 ,与 pFastBacI载体连接 ,得到含VEGF基因的转座载体 pFast/VEGF ,NcoI酶切鉴定方向 ;将其转化到含有穿梭载体杆粒 (Bacmid)的DH1 0Bac感受态细胞 ,得到重组杆状病毒穿梭载体Bacmid/VEGF ,采用琼脂糖凝胶电泳、PCR扩增对重组转座载体、穿梭载体进行鉴定。将Bacmid/VEGF转染sf 9细胞 ,进行病毒重组及噬斑筛选。结果 :琼脂糖电泳得到杆粒 (Bacmid)DNA条带 ,PCR扩增得到 5 75bp的VEGF片段 ,病毒液在 1 0 - 7稀释度时出现噬斑 ,约 5 0个 /孔。说明已成功构建了重组杆状病毒穿梭载体并重组出杆状病毒。

表达重组鸡新城疫病毒免疫原蛋白基因的研究

以 Ｎ Ｄ Ｖ Ｈ Ｎ 基因重组禽痘病毒载体与禽痘病毒转染液为材料，以载体质粒的 Ｌａｃ Ｚ报告基因为筛选标记，在含有 Ｘｇａｌ的培养基上筛选蓝色空斑的阳性重组子，对初次筛选到的蓝色空斑经过三轮蚀斑纯化（蓝斑形成率达９０％ 以上），得到了能稳定增殖的病毒子；再分别提取病毒子感染细胞、正常对照细胞基因组 Ｄ Ｎ Ａ， Ｂａｍ ＨⅠ酶切后，以 Ｄ Ｉ Ｇ 标记的探针进行 Ｓｏｕｔｈｅｒｎ 杂交检测，发现重组病毒感染的细胞基因组 Ｄ Ｎ Ａ 在７ ｋｂ 处有一 Ｄ Ｎ Ａ 片段，能与 Ｈ Ｎ 特异性探针呈阳性反应，而对照细胞没有，从而利用 Ｌａｃ Ｚ报告基因、 Ｈ Ｎ 探针杂交检测，我们成功地筛选并获得了 Ｎ Ｄ Ｖ Ｈ Ｎ 基因重组禽痘病毒，为下一步的研究工作奠定了基础。

犬2型腺病毒SY株的致弱驯化

作者对分离和系统鉴定的一株犬传染性喉气管炎病毒 (犬 2型腺病毒 ) SY(沈阳 )株 ,用犬肾传代细胞 MDCK进行了致弱驯化 ,每驯化 1 5代做一次初步的犬的安全性试验 ,用大剂量不同代次病毒对易感犬进行人工感染试验 ,每天观察犬的临床症状及白细胞总数 ,并于接毒后的第 5 d安乐死 ,作病理解剖学和病理组织学检查。易感犬的感染试验结果表明 ,SY株在犬肾细胞上传 1 5代时对犬的致病力已降低 ,3 0代时对犬已不引起发烧、精神沉郁和厌食等症状 ,仅引起轻度的鼻炎、中度的咽炎 ,剖检肺表现正常 ,仅见支气管淋巴结肿大 ,45代时无临床症状 ,剖检除扁桃体肿大外没有见到其它症状 ,6 0代毒已完全失去致病力 ,未见任何临床症状及病理变化。

噬菌体研究的历史与现状

噬菌体是一类侵染细菌,放线菌等微生物的病毒。由于它结构简单,遗传背景清晰而成为很好的研究材料。我国主要是由于50年代噬菌体对发酵工业的危害而开始对它的研究,目前它广泛的用在基因工程和其它领域。一、噬菌体的发现与分子生物学前奏1915年英国Twort在葡萄球菌中首次发现噬菌体,当时他以简短的笔记形式发表了这一发现.但未引起人们的注意。1917年加拿大人F.d′Herelle在法国巴斯德研究所又独立发现痢疾杆菌噬菌体。

鸭肠炎病毒gD基因胞外区的原核表达及在感染鸭胚成纤维细胞中的定位

以本实验室获得的鸭肠炎病毒(DEV)C-KCE株US区基因序列(GenBank登录号EU714267)为基础PCR扩增出gD基因胞外区(gDw),将其定向克隆至原核表达载体pET-30a(+)并转化至大肠杆菌RosettaTM(DE3)pLys。经IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析表明gD基因胞外区在大肠杆菌中获得与预期大小相符的表达蛋白。重组蛋白纯化后免疫家兔制备多克隆抗体,血清琼扩效价达1∶16,噬斑减数中和试验测定血清中和抗体效价达1∶64。通过免疫荧光技术首次对gD进行亚细胞定位检测,结果表明DEV感染鸭胚成纤维细胞(DEF)后4h近核区域细胞质内首先开始出现荧光,12h以后显著增加,明显的点状绿色荧光广泛存在于胞质中。本研究为进一步开展DEV gD的功能研究提供了重要数据和材料。

一种改进的重组腺病毒载体的包装和克隆纯化方法

目的:重组腺病毒载体是目前使用最多的病毒载体之一。常用的AdEasyTM包装系统在制备条件复制型腺病毒时易混有野生型腺病毒或可复制型腺病毒(RCA),在HEK293细胞中包装出的重组腺病毒必须经过2～3轮噬斑的筛选,费时费力。本实验拟对常规包装方法进行改进。方法:将腺病毒载体质粒转染至HEK293细胞过程中的液体培养基更换为琼脂糖凝胶的混合培养液,因为凝胶形成的阻碍,包装出的病毒不能通过细胞-培养液-细胞的方式进行扩散,只能依靠细胞-细胞的方式来扩展而形成病灶(噬斑);然后随机挑选单个噬斑进行PCR鉴定,筛选出特异的目标病毒。结果:采用常规方法在HEK293细胞中初包装出的腺病毒,同源重组产生的RCA已被检测到。采用改进方法制备的重组腺病毒,能排除背景病毒的干扰,使重组腺病毒载体的包装和克隆纯化一步完成;利用此病毒初步在体外实现了对人肝癌细胞的特异性杀伤。结论:改进的方法是一种高效、简便、快捷地包装并纯化重组溶瘤腺病毒的方法,采用该方法包装的重组溶瘤腺病毒能满足实验的需要。

腺病毒55型在A549细胞中的增殖动力学特征

目的：利用噬斑法研究人呼吸道腺病毒55型（HAd V-B55）在A549细胞中的增殖动力学特征。方法：以正交法得出HAd V-B55的最佳噬斑条件;HAd V-B55以感染复数（MOI）为10感染A549细胞,噬斑法测定接种后3、6、9、12、15、18、21、24、36、48、60和72 h培养液上清中的病毒滴度,绘制log2（病毒滴度）-时间图,分析HAd V-B55在A549细胞中的增殖动力学特征。结果：终浓度含0.5%琼脂糖、2%胎牛血清和1640（2×）细胞培养液为HAd V-B55噬斑形成的最佳条件;MOI=10时,HAd V-B55感染A549细胞后12～15 h培养液中开始出现病毒,接种后15～36 h培养液中病毒量呈指数大量增加,接种后48～60 h病毒量出现小幅上升,接种后60 h细胞完全病变,病毒量增加达到平台期,最终病毒量增加约225 000倍。结论：A549细胞能有效地扩增HAd V-B55,其增殖周期为12～15 h;为研究HAd V-B55的感染致病机制,以及指导后期抗HAd V-B55的药物研发奠定了基础。