一种改良的快速筛选重组DNA噬菌体噬斑的原位杂交技术

报道了一种从表达型噬菌体载体——λgt11构建的基因文库中筛选重组DNA噬菌体噬斑的改良蛋白质-蛋白质原位杂交枝术。此法可使噬菌体在硝酸纤维素薄膜上增殖至原噬斑大小,经适当处理后,即可用特异性抗体探针进行原位筛选,以 获得含目的基因编码的特异抗原蛋白的阳性克隆株。与己报道的筛选方法相比,此法具有简便快速、灵敏可靠的特点;也可试用于由表达型质粒载体构建的基因文库之菌落原位筛选。

人VEGF基因昆虫杆状病毒表达载体的构建

为了在昆虫杆状病毒表达系统表达人血管内皮细胞生长因子 (VEGF)基因 ,用HindⅢ对 pcDNA3 .1 /VEGF进行酶切 ,回收 5 75bp的VEGF片段 ,与 pFastBacI载体连接 ,得到含VEGF基因的转座载体 pFast/VEGF ,NcoI酶切鉴定方向 ;将其转化到含有穿梭载体杆粒 (Bacmid)的DH1 0Bac感受态细胞 ,得到重组杆状病毒穿梭载体Bacmid/VEGF ,采用琼脂糖凝胶电泳、PCR扩增对重组转座载体、穿梭载体进行鉴定。将Bacmid/VEGF转染sf 9细胞 ,进行病毒重组及噬斑筛选。结果 :琼脂糖电泳得到杆粒 (Bacmid)DNA条带 ,PCR扩增得到 5 75bp的VEGF片段 ,病毒液在 1 0 - 7稀释度时出现噬斑 ,约 5 0个 /孔。说明已成功构建了重组杆状病毒穿梭载体并重组出杆状病毒。

表达重组鸡新城疫病毒免疫原蛋白基因的研究

以 Ｎ Ｄ Ｖ Ｈ Ｎ 基因重组禽痘病毒载体与禽痘病毒转染液为材料，以载体质粒的 Ｌａｃ Ｚ报告基因为筛选标记，在含有 Ｘｇａｌ的培养基上筛选蓝色空斑的阳性重组子，对初次筛选到的蓝色空斑经过三轮蚀斑纯化（蓝斑形成率达９０％ 以上），得到了能稳定增殖的病毒子；再分别提取病毒子感染细胞、正常对照细胞基因组 Ｄ Ｎ Ａ， Ｂａｍ ＨⅠ酶切后，以 Ｄ Ｉ Ｇ 标记的探针进行 Ｓｏｕｔｈｅｒｎ 杂交检测，发现重组病毒感染的细胞基因组 Ｄ Ｎ Ａ 在７ ｋｂ 处有一 Ｄ Ｎ Ａ 片段，能与 Ｈ Ｎ 特异性探针呈阳性反应，而对照细胞没有，从而利用 Ｌａｃ Ｚ报告基因、 Ｈ Ｎ 探针杂交检测，我们成功地筛选并获得了 Ｎ Ｄ Ｖ Ｈ Ｎ 基因重组禽痘病毒，为下一步的研究工作奠定了基础。