表达EGFP重组猪繁殖与呼吸综合征病毒的构建与鉴定

RT-PCR获得猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)XZ06a株基因组,在基因组5’末端、3’末端分别添加锤头样核酶、丁型肝炎病毒核酶序列,并插入改造的pCAGEN表达载体中,构建DNA-launched感染性克隆,然后在病毒基因组ORF1b与ORF2间引入ORF6 TRS序列、酶切位点及EGFP基因,转染Marc-145细胞拯救表达EGFP的重组病毒并噬斑克隆纯化,Western blot检测EGFP表达并对获得的表达EGFP的重组病毒进行TCID50测定与分析。结果显示:PRRSV基因组大小为15145 nt,转染后5~7 d即可观察到重组病毒所致特异性病变灶,经过噬斑纯化,能够观察到携带EGFP基因的重组病毒在对应病变灶均有绿色荧光,最终获得稳定表达EGFP的重组病毒,且重组病毒感染16 h时即可检测EGFP表达;与亲本病毒相比,表达EGFP重组病毒致细胞出现病变时间有所延长,增殖滴度有所降低。本研究成功构建了表达EGFP的重组PRRSV,为开展PRRSV病毒复制机制、感染特性、致病机制、疫苗开发等研究奠定了基础。

两株猪伪狂犬病病毒变异株的分离鉴定及gB、gC和gE基因的分子特征分析

为探明近年来河南省猪伪狂犬病病毒(PRV)的遗传变异情况,本研究于2017年采集河南漯河和中牟地区疑似伪狂犬病发病养殖场送检的脑组织病料,通过细胞盲传、噬斑纯化、间接免疫荧光试验、Western blotting和透射电镜技术进行病毒分离鉴定。TCID_(50)法测定分离毒株的病毒滴度、生长曲线,通过小鼠感染试验测定分离毒株对小鼠的致死性。对gB、gC和gE基因进行PCR扩增、测序,并与参考毒株序列进行比对分析。结果显示,对PCR鉴定阳性的病料在PK-15细胞盲传后,两份病料在6代内均出现细胞病变,通过间接免疫荧光试验、噬斑纯化和透射电镜技术,成功分离鉴定了两株PRV,分别命名为HeN-LH株及HeN-YM株。分离毒株在PK-15细胞上的生长曲线显示,HeN-LH和HeN-YM株在感染后36 h病毒滴度分别可达10^(8.35)和10^(6.63) TCID_(50)/mL。用不同浓度的病毒接种小鼠,结果显示,HeN-LH和HeN-YM株LD_(50)分别为10^(2.13)及10^(3.25) TCID_(50)。对gB、gC和gE基因全长扩增测序后构建遗传进化树,结果显示,两株PRV毒株与Bartha、Fa和Ea等经典株的亲缘关系相对较远,而与2011年以来国内不同省份分离的PRV变异株亲缘关系较近。氨基酸序列比对分析显示,与其他变异株相似,gB、gC和gE基因均发生了多个氨基酸的变异,且在特定的位点存在特征性的氨基酸插入和缺失。本研究成功分离鉴定了两株PRV变异株,分离株对小鼠均表现出一定的致病性,本试验结果可为河南省伪狂犬病的防控工作和疫苗株的选择提供科学依据。

鸭瘟重组病毒穿梭载体的构建及分析

目的本研究目的为构建重组穿梭载体,拯救带有增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein,EGFP)重组病毒,为重组二联苗的研制奠定基础。方法选择已经证实的US区域的US2-SORF3、US7-US8和UL区域中的UL15-UL18的非编码区作为插入位点构建穿梭载体P-US2-SORF3-EGFP,P-UL15-UL18-EGFP,P-US7-US8-EGFP。在已感染疫苗毒的鸡胚成纤维细胞(chicken embryo fibroblasts,CEFs)中转染穿梭载体,经细胞同源重组,收集细胞上清,进行噬斑筛选及纯化。结果成功构建了三个带有EGFP标签的穿梭载体,p Blusecript II SK构建的穿梭载体未成功筛选到重组噬斑而用p UC18构建的穿梭载体成功筛选到重组噬斑。结论拯救鸭瘟重组毒的研究中,p Blusecript II SK载体可能不是最佳的适用载体,也可能是插入位点为病毒复制的必须区。

Ⅰ型登革病毒D06063株人二倍体细胞适应株的筛选及纯化

目的筛选Ⅰ型登革病毒(Dengue virus,DV)中国株D06063人胚肺二倍体细胞KMB17的适应株,经噬斑纯化后,分析其生物学特性。方法将Ⅰ型DV中国株D06063在C6/36细胞上进行扩增,采用微量滴定法测定病毒的感染性滴度;RT-PCR法鉴定DV型别;病毒连续以4.0 MOI的量感染KMB17细胞,传代至病毒完全适应在细胞内扩增,再连续传10代,筛选出KMB17细胞适应株,并进行3轮噬斑纯化;免疫荧光法检测纯化病毒,电镜观察病毒颗粒的形态。结果在C6/36细胞上扩增的Ⅰ型DV D06063株的滴度为6.0 lg CCID50/ml,经RT-PCR可扩增出511 bp的DV特异基因和482 bp的Ⅰ型DV型特异性基因;病毒感染KMB17细胞后,可产生明显的细胞病变,至第10代,病毒的感染性滴度达峰值,为6.75 lg CCID50/ml;纯化的病毒经免疫荧光检测呈阳性,电镜观察显示病毒形态正常。结论成功筛选出传代稳定性好、病毒扩增量高的Ⅰ型DVKMB17细胞适应株,纯化的病毒株保持了原始毒株的基本生物学特性。

流行性腮腺炎疫苗株S79全基因序列测定与分析

目的 腮腺炎疫苗株S79工作种子噬斑纯化及全基因组测序,针对国内已经分离出的毒株,从分子生物学角度探讨疫苗保护力相关问题.方法 噬斑纯化S79疫苗株,利用RT-PCR分段扩增S79株两种亚株的全基因并测序,比较S79株与其来源株Jeryl Lynn（JL）核酸序列差异;从GenBank中获得WHO各基因型参考株和中国腮腺炎流行株疏水蛋白（SH）序列,分析病毒株和疫苗株遗传距离,并构建基因亲缘性关系树.结果 S79疫苗株由两种亚株构成,比例为2∶5（major∶minor）,获得全基因序列并递交GenBank;与相应的JL株相比,核苷酸序列同源性分别为99.7%和100%.亚株序列中存在散在区段异源重组.S79疫苗株为A基因型,中国的流行株为F基因型,遗传距离为11.2%～20.0%.结论 S79疫苗株由两种亚株构成,两亚株的全基因序列与JL株基本一致,但亚株的比例与国际上应用的其他JL疫苗株存在较大差异.疫苗株与中国流行株不属于同一基因型,遗传距离较远.S79疫苗免疫保护效果的差异可能主要与疫苗株和流行株不属于同一基因型有关.