携带肾上腺髓质素基因腺病毒体外转染骨髓间充质干细胞及其蛋白的表达

背景:肾上腺髓质素具有促进骨髓间充质干细胞增殖、生长及减少凋亡等作用。目的:观察携带肾上腺髓质素基因的腺病毒体外转染骨髓间充质干细胞及其蛋白的表达。方法:培养293A细胞,并扩增携带肾上腺髓质素基因的腺病毒(Ad-ADM),实验分为对照组、空载体组和Ad-ADM转染组,3组分别于细胞长满至50%～60%时加入等量的无血清L-DMEM、Ad-lacZ和Ad-ADM,噬斑法检测扩增后腺病毒的滴度;贴壁法体外分离、扩增培养大鼠骨髓间充质干细胞;Ad-GFP体外感染骨髓间充质干细胞后检测转染效率;RT-PCR检测Ad-ADM转染后肾上腺髓质素mRNA的表达。结果与结论:病毒扩增后噬斑试验测定Ad-ADM的病毒滴度为1.1×109pfu/mL。Ad-ADM感染骨髓间充质干细胞后,肾上腺髓质素mRNA的表达明显增加,对照组、空载体组未见ADMmRNA表达;量化结果表明其表达量从第1天开始逐渐增加,第7天达高峰,在11d时仍可检测其表达。提示腺病毒对骨髓间充质干细胞有较高的转染效率。感染Ad-ADM后,骨髓间充质干细胞可有效表达肾上腺髓质素。

福氏志贺菌临床分离株毒力基因的研究

目的研究在一种快速、特异的mPCR方法在检出福氏志贺菌的同时对其毒力进行监测。方法选取福氏志贺菌三种毒力基因ipaH,ial,set1B作为扩增目标,在同一mPCR体系中对86株福氏志贺菌临床分离株进行了检测,并选取12株进行了噬斑形成试验,观察了扩增产物不同的福氏志贺菌对Hela细胞的毒力作用。结果86株福氏志贺菌临床分离株均检测到ipaH基因,阳性率为100%;45株检测到ial基因,阳性率为52%;69株检测到set1B基因,阳性率为80%。噬斑形成试验证明,mPCR结果不同的菌株对Hela细胞的感染能力存在明显差异。结论应用上述mPCR体系在检出福氏志贺菌的同时能够对菌株的毒力进行初步判别,对于临床诊断及治疗具有重要意义。

鸭肠炎病毒gD基因胞外区的原核表达及在感染鸭胚成纤维细胞中的定位

以本实验室获得的鸭肠炎病毒(DEV)C-KCE株US区基因序列(GenBank登录号EU714267)为基础PCR扩增出gD基因胞外区(gDw),将其定向克隆至原核表达载体pET-30a(+)并转化至大肠杆菌RosettaTM(DE3)pLys。经IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析表明gD基因胞外区在大肠杆菌中获得与预期大小相符的表达蛋白。重组蛋白纯化后免疫家兔制备多克隆抗体,血清琼扩效价达1∶16,噬斑减数中和试验测定血清中和抗体效价达1∶64。通过免疫荧光技术首次对gD进行亚细胞定位检测,结果表明DEV感染鸭胚成纤维细胞(DEF)后4h近核区域细胞质内首先开始出现荧光,12h以后显著增加,明显的点状绿色荧光广泛存在于胞质中。本研究为进一步开展DEV gD的功能研究提供了重要数据和材料。

蓝舌病毒1型灭活疫苗的制备与免疫效果

比较了二乙烯亚胺(BEI)、甲醛和β-丙内酯(BPL)3种灭活剂对蓝舌病毒1型(BTV-1)的灭活效果,利用免疫印迹法检测灭活病毒蛋白,选择BEI作为疫苗灭活剂制备BTV-1灭活疫苗并免疫绵羊,通过竞争ELISA法和噬斑减少中和试验(PRNT)测定抗体效价评价疫苗免疫效果。结果显示,BEI、BPL和甲醛均能在48 h内完全灭活BTV-1,且在BPL和BEI灭活处理的病毒样品中均可以检测到VP6、VP7、NS1和NS2四种病毒蛋白,而在甲醛处理的病毒样品中仅检测到了VP7蛋白,表明BEI和BPL在灭活病毒过程中对病毒蛋白抗原影响较小。血清抗体检测显示,与对照组相比,疫苗免疫组绵羊血清中抗BTV非中和抗体和中和抗体均显著升高。本研究制备的BTV-1灭活疫苗具有很好的免疫原性,这也为研制其他血清型蓝舌病疫苗奠定了基础。

库蚊黄病毒的病毒滴度测定方法建立

目的建立我国分离库蚊黄病毒(Culex flavivirus,CxFV)毒株(SDDM06-11)的病毒滴度测定方法。方法在6孔细胞培养板中培养C6/36细胞,感染库蚊黄病毒,加入甲基纤维素培养4 d,结晶紫进行染色,通过统计空斑数量计算病毒的噬斑形成单位。结果使用甲基纤维素-结晶紫空斑方法观察,发现CxFV(SDDM06-11)毒株感染C6/36细胞后形成清晰的圆形噬斑,大小如针尖,成功测定CxFV(SDDM06-11株)滴度在106.85 pfu/ml。结论甲基纤维素-结晶紫空斑法可用于测定CxFV滴度。

2018年甘肃省东南部地区健康人群乙型脑炎病毒中和抗体调查

目的通过调查甘肃省东南部地区健康人群乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)中和抗体水平,评价人群乙型脑炎(Japanese encephalitis,JE)免疫屏障,为制定JE防控策略提供依据。方法2018年在甘肃省东南部4个市(平凉市、庆阳市、陇南市、天水市),选择0~14岁组、15~39岁组、≥40岁组共3个年龄组健康人群,采集血清标本,采用噬斑减少中和试验检测JEV中和抗体。不同组间JEV中和抗体阳性率的比较采用χ^(2)检验。结果共调查1590人,JEV中和抗体总阳性率为28.81%,几何平均滴度(geometric mean titer,GMT)为1:27.09。0~14岁组、15~39岁组、≥40组健康人群的抗体阳性率依次为32.96%、20.32%、30.63%,各年龄组抗体阳性率差异具有统计学意义(χ^(2)=22.29,P<0.001)。平凉市、庆阳市、陇南市、天水市的抗体阳性率分别为29.62%、22.22%、33.00%、30.30%,各市抗体阳性率差异具有统计学意义(χ^(2)=12.39,P=0.006)。结论甘肃省东南部地区健康人群JEV中和抗体阳性率低,存在JE流行风险。