白色噬琼胶菌QM38 β-琼胶酶基因agaD02的克隆与表达

从白色噬琼胶菌(Agarivorans albus)QM38基因组中扩增到一段编码β-琼胶酶的DNA序列,命名为agaD02。序列相似性分析的结果表明,基因agaD02和弧菌Vibrio sp.JT0107及Vibrio sp.PO-303的琼胶酶基因具有同源性,其相似性程度分别为98.7%和97.4%,而同GenBank中的其他序列同源性很低。对此基因的序列进行了分析,结果表明,其开放阅读框长度为2 868 bp,编码的蛋白质包含955个氨基酸,在蛋白数据库中的编号为ABM90422,推测其分子质量为106 ku,等电点为4.87。利用网上数据库资源和生物学软件对预测的琼胶酶蛋白序列进行了同源性分析和结构分析。设计两端含酶切位点的特定引物,克隆agaD02基因,构建入表达载体pET24a(+),转化大肠杆菌BL21(DE3),转化后提取质粒进行酶切和电泳验证,转化后的大肠杆菌经诱导可产生胞外琼胶酶。

白色噬琼胶菌QM38发酵产琼胶酶条件优化

采用正交试验法优化白色噬琼胶菌(Agarivorans albus)菌株QM38产琼胶酶的发酵条件,研究结果初步表明:蛋白胨5.0 g/L、酵母粉1.0 g/L、柠檬酸铁0.01 g/L、装液量1/4(150 ml三角瓶)、培养基琼脂浓度0.4%是其最适发酵条件,发酵48 h时产酶活性达到最高,为0.61μmol/(L.min);23 h时菌种生长最旺盛,OD值为0.543。

噬琼胶菌产新琼二糖热稳定琼胶酶的酶学性质及酶解产物的抗氧化活性

利用PCR从噬琼胶菌AL1中扩增琼胶酶基因,将其克隆至表达载体p ET-28a;表达产物用亲和层析纯化,研究重组酶的酶学性质;利用薄层色谱和质谱鉴定酶解产物,并测定酶解产物的还原能力和清除DPPH、ABTS+和·OH自由基的能力,分析酶解产物的抗氧化活性。结果表明,来自噬琼胶菌AL1重组琼胶酶的分子质量为105 ku。该琼胶酶能专一地降解琼脂,为β-琼胶酶。重组琼胶酶在50℃和p H 7.0表现出最大酶活力,在50℃以下,p H 5.00~11.00宽p H范围内稳定性良好,说明该重组酶具有良好的热稳定性和p H稳定性。经薄层色谱和质谱鉴定酶解产物为新琼二糖,该酶解产物对·OH、ABTS和DPPH自由基的半数抑制剂量IC50分别为1.28 mg/mL、3.46 mg/mL和9.87 mg/mL,还原能力较强,说明该酶解产物具有良好的抗氧化活性。

4株琼胶降解菌的分离、鉴定及产酶条件分析

从海藻及海参中分离筛选得到4株琼胶降解菌HD、JL、QJ和HS,均为革兰氏阴性菌,确定了它们发酵产酶的最佳条件均为:2216E海水培养基、初始Ph 7.5、琼胶底物浓度0.30%、培养温度28℃、培养时间36 h。大部分酶分泌到细菌细胞外。生理生化检测、16SrDNA序列同源性及聚类分析结果表明,HD、JL、HS为白色噬琼胶菌(Agarivorans albus);QJ的16SrDNA序列与Simiduia sp.,糖噬胞菌属(Sac charophagus sp.)和船蛆杆菌(Teredinibacter sp.)的相似性为93%～94%,在进化树上单独形成一个分支,但生理生化特征与它们有所不同,分类地位需要进一步确定。从HD、JL和HS中能克隆到β-琼胶酶基因,它们与其他物种的β-琼胶酶基因序列的相似性为97%～98%。

海洋细菌来源β-琼胶酶的生物信息学分析与高效制备

为丰富优质琼胶酶品类,充分利用海藻资源,实现功能性琼胶寡糖的高效制备,采用基因组挖矿技术挖掘得到一个来源于海洋细菌——淡黄色噬琼胶菌(Agarivorans gilvus)WH0801的β-琼胶酶(β-AGA酶),利用生物信息学分析对该酶的理化性质和结构特征进行预测,发现该酶为非分泌性蛋白。在此基础上,采用分子生物学手段引入信号肽,实现了该酶在大肠杆菌(Escherichia coli)中的胞外表达,并通过发酵调控策略优化提高其生产效率。结果表明,采用种龄5 h的种子培养液进行发酵,发酵出发培养基为TB(pH 7.0),碳源为6 g·L^(-1)的果糖,氮源为30 g·L^(-1)的酵母提取液Ⅱ,于25℃培养2 h后加入终浓度为0.025 mmol·L^(-1)的IPTG诱导48 h,此条件下发酵所得酶活为16.72 U·mL^(-1),相比初始酶活提高了约5倍,证明β-AGA酶具有良好的工业应用潜力。