用于大容量噬菌体抗体库的表达载体的构建及鉴定

目的:构建一个适用于大容量抗体库的噬菌体抗体表达载体。方法:通过插入人工合成寡核苷酸、PCR介导的定位突变等技术,将载体p3MH进行改造,使之更适于构建大容量抗体库。通过噬菌体抗体的表达、ELISA及细胞内重组试验鉴定所获得的表达载体。结果:通过插入loxp511和loxp序列,将Lac启动子更换为阿拉伯糖启动子、改造抗体基因克隆位点等,将p3MH改造成pAL。经检测pAL可以表达具有功能的Fab噬菌体抗体,其表达调控更为严密,可以在cre+细菌胞内发生预期的loxp-cre介导的定位重组。结论:所获得的表达载体pAL适用于构建大容量Fab噬菌体抗体库。

^(131)I标记抗Peroxiredoxin I肺腺癌噬菌体抗体在荷瘤裸鼠体内的分布及其对肿瘤生长的抑制作用

目的研究抗Peroxiredoxin I(PrxI)肺腺癌相关单链抗体体外对肺腺癌细胞的增殖抑制;观察131I标记抗体在肺腺癌裸鼠模型体内分布、靶向显像及体内抑瘤作用。方法放射性核素计数法测定单链抗体细胞内摄水平;MTT法及流式细胞仪检测单链抗体抑制肺腺癌A549细胞生长情况;免疫印迹法检测单链抗体作用于A549细胞后对细胞内PrxI表达水平的影响。放射性核素131I标记纯化抗体,进行荷瘤裸鼠体内分布、SPECT放免显像及病理切片观察抑瘤作用。结果单链抗体干预后细胞PrxI蛋白表达水平较对照组下降(P<0.05)。体内分布研究表明单链抗体与肺腺癌组织有效结合。荷瘤裸鼠尾静脉注射131I标记抗体48h后,瘤/血和瘤/肌肉放射性比值均达到最大值4.06±0.13和5.17±0.97。SPECT示抗体注射后48hT/NT值明显高于12h、24h和72h(F均>86,P均<0.01)。治疗4周后,131I标记抗体治疗组肿瘤体积为(0.68±0.17)cm3,质量为(1.58±0.21)g,抑瘤率56.8%,与对照组比较有统计学差异。结论抗PrxI肺腺癌单链抗体能有效抑制肺腺癌细胞生长,131I标记单链抗体在体内能抑制肿瘤生长。

噬菌体展示肽表位的免疫原性研究

目的研究模拟表位TAPDLRP的噬菌体展示肽的免疫原性。方法用我们筛选获得的展示MUC1抗原模拟表位的噬菌体阳性克隆免疫小鼠。以最大OD450值之纯化血清做为一抗行蛋白印迹分析。检测小鼠脾脏淋巴细胞增殖率。结果3次免疫小鼠后,血清(1∶1 000)中能检测到较强的MUC1抗体阳性。纯化血清可识别MUC1蛋白。噬菌体展示肽表位可在无佐剂存在情况下,大大促进小鼠的脾淋巴细胞的增殖。结论噬菌体是一种较好的生物载体。该模拟抗原免疫小鼠后能激发体液及细胞免疫应答,具有良好的免疫原性。

噬菌体裂解法与BACTEC-460法检测结核分支杆菌的应用比较

目的 :比较研究噬菌体裂解法与BACTEC - 46 0法在结核分支杆菌快速检测及鉴定中的价值。方法 :应用噬菌体裂解法和BACTEC - 46 0法检测 3株结核分支杆菌标准株、13株非结核分支杆菌和 7株非分支杆菌以及 2 70份临床确认的肺结核患者的痰标本。结果 :噬菌体裂解试验 3株结核分支杆菌标准株均为阳性 ,而 13株非结核分支杆菌和 7株非分支杆菌均为阴性 ;BACTEC - 46 0法 3株结核分支杆菌和 13株非结核分支杆菌均可生长 ;2 70份肺结核患者的痰标本应用噬菌体裂解法和BACTEC - 46 0法进行检测两者的阳性率相近 ,分别为 4 4.4 % (12 0 / 2 70 )和 4 6 .7% (12 6 / 2 70 ) ,二者差异无显著性 (p >0 .0 5 )。噬菌体裂解法检测的报告时间为 2d ;BACTEC - 46 0培养的阳性报告时间 2～2 7d、平均为 8.7d ,阴性报告时间为 4 2d。结论 :噬菌体裂解法与BACTEC - 46 0法相比 ,可以简便、快速地检测结核分支杆菌 ,全程只需 2d ,并且具有较高的敏感性和特异性 ,是一种崭新的结核分支杆菌快速检测方法。

用相应噬菌体快速鉴定鼠伤寒沙门氏菌的报告

用自已分离的鼠伤寒沙门氏菌(STM)噬茵体 L_1对136株 STM 和20余株非 STM 进行了裂解试验,结果130株 STM 被裂解,裂解率为95.6%。其它伤寒、痢疾杆菌20余株均不裂解。证明噬菌体裂解试验具有特异、快速、简易等特点,适合各种环境的检验。

从抗TNF抗体的CDR肽库中获得拮抗TNF的短肽

为设计来自抗体的短肽 ,以抗肿瘤坏死因子 (TNF)嵌合抗体 (cA2 )CDRs为模板 ,在其两侧各加 3个随机氨基酸残基 ( X3 CDR X3 ) ,构建了 6个以CDR为基础的肽库 .经过 3轮亲和选择 ,挑取单克隆 ,进一步经ELISA检测TNF阳性噬菌体克隆 ,分离得到 7个ELISA阳性较好的噬菌体肽克隆 ,分别命名为CDR2L1、CDR2L2、CDR2L3、CDR1L1、CDR2H1、CDR3H1、CDR3H 2 .应用MTT方法 ,检测 7个克隆对TNF生物学活性的拮抗作用 .结果显示 :来自CDR2L ,CDR3H肽库中的CDR2L2、CDR2L3,CDR3H2噬菌体肽具有明显的拮抗TNF诱导L92 9细胞的细胞毒作用 ,其中以CDR2L2噬菌体肽的拮抗活性最强 .而来源于CDR1L ,CDR2H肽库的CDR1L1和CDR2H1噬菌体肽和来自CDR2L ,CDR3H肽库中的CDR2L1和CDR3H1噬菌体肽没有明显的拮抗TNF作用 .研究结果初步表明 :从cA2抗体CDR肽库中筛选得到的噬菌体CDR模拟肽具有亲本抗体相似的结合活性和生物学效应 ,从而为开发已知抗体 (特别是治疗用抗体 )

抗hTNF-α中和抗体识别表位的筛选和鉴定

目的:对噬菌体随机线性7肽库进行筛选,得到能与抗hTNF -α中和抗体特异性结合的表位肽. 方法: 以抗hT NF- α中和抗体为靶,筛选噬菌体线性7肽库,双夹心ELISA,竞争抑制ELISA及MAP点杂交鉴定阳性噬菌体克隆. 结果:经3轮筛选后随机挑取50个噬菌体克隆,经ELISA检测其中15个克隆显示与抗hTNF- α抗体有较强的结合能力,DNA测序结果得到的结构相似群为:WTFKMQP, WPFKMSP, WPYK MIP和WNYKMLP, 竞争性ELISA结果显示四个序列均能与TNF竞争性结合抗hTNF -αmAb,MAP点杂交结果显示筛选得到的多肽是能与抗hTNF -α抗体特异性结合的多肽. 结论:列具有很高的同源性,并能与抗hTNF -α中和抗体特异性结合,为hTNF -α相关多肽疫苗的研究提供依据.

从噬菌体随机十二肽库中筛选NF-κB(p65)亲和肽的研究

目的:采用噬菌体展示技术筛选核转录因子-κB(nuc lear factor-κB,NF-κB)亚基p65亲和肽。方法:以p65亚基为靶分子,利用噬菌体随机十二肽库进行亲和筛选,用ELISA法进行阳性克隆结合特异性验证。结果:经过3轮亲和筛选后,随机挑选15个噬菌体克隆,对其亲和力做ELISA试验,其中6个克隆显示较强的阳性结果。将上述6个阳性克隆DNA测序,序列均为CGTCAGCCTCGGCGAATAAGTATCCGAAGGAGTAAA,相应的氨基酸序列为FTPSDTYSPRLT。竞争性ELISA的结果显示,抑制率随p65亚基浓度的增大而升高。结论:从噬菌体随机肽库中筛选到能与NF-κB p65亚基特异性结合的克隆,并确定了其核心序列。

应用噬菌体空斑法快速检测金霉素发酵的研究

探讨噬茵体空斑法快速鉴定技术在金霉素发酵中的应用。采用双层琼脂平板法检测噬菌体,观察空斑数。对所有经噬茵体空斑法检测的样品进行电镜检测,其重复符合率为87%。噬茵体空斑法具有灵敏度高、特异性强、重复性好的特点,而且方法简单、快速,无需贵重仪器,可以应用于金霉素发酵噬菌体的常规检查。

从婚宴发生食物中毒的检材中检出一株鼠伤寒沙门氏菌的报告

本文报告一起因婚宴引起细菌性食物中毒的案例,经流行病学调查、采集可疑检材培养,分离以及系统生物学特性鉴定,证实为鼠伤寒沙门氏菌。

问号钩端螺旋体属特异性外膜蛋白OmpL1和LipL21抗原表位预测及鉴定

目的筛选问号钩端螺旋体（简称钩体）属特异性外膜蛋白OmpL1和LipL21有效T和B细胞联合抗原表位，为研制多抗原肽（multiple antigenic peptide，MAP）疫苗提供基础。方法采用生物信息学方法预测OmpL1和LipL21分子中T和B细胞联合抗原表位。采用PCR扩增候选联合抗原表位片段并分别构建其噬菌体展示系统。分别以rOmpL1或rLipL21、黄疸出血群赖株、钩体患者抗血清为一抗，采用Western blot检测各抗血清与目的表位的免疫反应性及其强度。结果通过抗原表位预测，选择了高分值的4个OmpL1和2个LipL21联合表位。经扩增获得了预期的各抗原表位片段，各目的表位序列均准确插入噬菌体PⅢ蛋白N端并有效表达。各抗血清均能识别上述6个联合表位。其中LipL21的97-112和176-184表位对任-抗血清均显示相似强度的杂交条带。综合4个OmpL1表位对3种抗血清的不同Western blot结果及其实际意义，杂交信号从强到弱依次为173-191、87-98、297-320和59-78表位。结论所研究的6个联合表位均分别为LipL21和OmpL1的有效抗原表位，其中LipL21的97-112、176-184和OmpL1的87-98、173-191表位可应用于钩体MAP疫苗研制。