鸭疫里默氏菌噬菌体宿主谱的拓宽

为建立一种拓宽鸭疫里默氏菌噬菌体噬菌谱的方法,将6株噬菌体混合液分别与6株宿主菌、18株多重耐药鸭疫里默氏菌(不能被6株噬菌体中的任何1株裂解)培养,收获培养液中的噬菌体,混合后同样进行30次传代。噬斑分析法测定30代混合液及混合液中单一噬菌体的噬菌谱。结果表明,30代噬菌体混合液可裂解79.2%(19/24)的鸭疫里默氏菌试验菌株;30代噬菌体混合液中分离出的单一噬菌体能裂解的试验菌株数量为2~9株;裂解数最多的5株单一噬菌体,以各自宿主菌传代10次,噬菌谱没有发生变化;将裂解谱互补的单一噬菌体混合,4株噬菌体即可裂解19株试验菌株,与30代噬菌体混合液相同。说明建立的方法可以拓宽噬菌体混合液、单一噬菌体的噬菌谱,为噬菌体鸡尾酒制剂的毒株选择奠定了基础。

宽谱鸭疫里默氏菌噬菌体筛选及生物学特性研究

【目的】筛选宽谱鸭疫里默氏菌噬菌体,作为治疗用噬菌体组合的候选毒株。【方法】以不同含量的噬菌体进行噬斑分析测定35株噬菌体的噬菌谱;利用透射电镜观察、热与酸碱稳定性评估、最佳感染复数(MOI)测定、一步生长试验、杀菌试验分析噬菌体的形态结构和部分生物学特性。【结果】35株噬菌体中vB_RanS_202的裂解谱最宽,能裂解42%(42/100)的鸭疫里默氏菌,包括血清1、2、6、10、11和13型共6种血清型菌株。该噬菌体由直径约60 nm的截面为六边形的头部和长约220 nm的尾部组成,不耐热,效价为1.0×10^(7)PFU/mL的噬菌体,经50℃水浴80 min或60℃水浴20 min,即降为1.8×10^(7)~2.6×10^(7)PFU/mL。在pH 5.0~9.0的环境中能维持活性。以RAf488为宿主菌测得其最佳MOI为0.01。一步生长曲线显示,其潜伏期和暴发期分别为60和75 min,平均裂解量约为150 PFU/cell。在宿主菌RAf488中的杀菌试验结果显示,MOI在0.004~0.016时,vB_RanS_202均具有杀菌作用。【结论】噬菌体vB_RanS_202具有宽裂解谱的特点,具备在液体培养基中的杀菌能力。本研究结果为后续噬菌体治疗用毒株的筛选提供参考。

治疗用噬菌体的优点、问题与对策

细菌耐药性对人和动物机体的健康造成了严重威胁。噬菌体是可以裂解细菌的病毒,可作为抗生素替代品用于细菌疾病的预防和治疗。噬菌体以其独特的优点受到广大研究者的青睐。但是,噬菌体作为一种独特类型的微生物,应用时也存在一些问题,从而可能限制噬菌体的应用。因此,要采取一些方法以规避这些问题。文章主要就细菌性疾病治疗用噬菌体的优点、问题及可能的对策作了简要介绍,希望为治疗用噬菌体的开发与应用提供帮助。

噬菌蛭弧菌对206株伤寒杆菌裂解作用的研究

本文报道了噬菌蛭弧菌(Bdellovibrio bacteriovorus,以下简称蛭弧菌)Bd81、Bd98对江苏省15个县市201株伤寒杆菌及5株标准伤寒杆菌裂解作用的研究结果。发现蛭弧菌在含有伤寒杆菌宿主的自来水双层琼脂平板上,经25℃48小时培育,可形成透明噬菌斑。蛭弧菌Bd81裂解199株,占总数96.60％,包括86年68株,87年74株,5株标准菌株全部被裂解,89年59株其中被裂解52株,阳性率为88.14％;Bd98裂解204株,占总数的99.03％,

噬菌蛭弧菌对荷斯坦公犊牛生长性能及粪便微生物区系的影响

在我国的牛场,犊牛腹泻是犊牛死淘的第一大原因。腹泻不仅可以在短期内造成犊牛直接死淘,而且发生腹泻的犊牛最终生产性能也会显著下降。由于犊牛腹泻在感染初期不易被发现,导致犊牛因腹泻营养缺乏生长受阻,免疫力降低进而并发多种疾病。疾病一旦发生就不可避免产生损失,因而畜牧产业对于疾病的态度始终是防大于治。

新型噬菌粒展示载体pCANTAB5L的构建

目的 :将柔性多肽接头和多克隆位点引入噬菌粒载体 pCANTAB5X中 ,构建适用于展示各种随机肽库、功能靶蛋白、功能靶蛋白变异体库和大分子量 (>30 0个氨基酸 )功能蛋白的新型噬菌粒展示载体。 方法 :应用 5′端含XbaⅠ、StuⅠ、SalⅠ、KpnⅠ识别序列的引物 ,PCR扩增获得XbaⅠ StuⅠ SalⅠ KpnⅠ [G4S]3 NotⅠ衔接片段 ,将该PCR产物克隆到pMD 18T中 ,再将该片段插入 pCANTAB 5X中构建成新型噬菌粒展示载体 pCANTAB5L。 结果 :限制性内切酶酶谱及DNA序列分析证明[G4S]3多肽接头和限制性内酶切位点XbaⅠ、StuⅠ、SalⅠ、KpnⅠ序列被引入到新构建的噬菌粒载体pCANTAB 5L中。 结论 :成功构建了新型噬菌粒展示载体 pCANTAB5L ,并能有效展示功能靶蛋白。

噬菌蛭弧菌BDF-H16长期简易保藏方法研究

实验使用自来水双层检测法与平板计数法,研究了不同的保护液、保藏温度和保藏载体的选择对蛭弧菌长期保藏的影响,以及对优化保藏条件下的蛭弧菌复苏率和复苏蛭弧菌的噬菌能力检测,并且对保藏期限内宿主菌的存活情况与蛭弧菌的存活情况的相互影响做了首次的报道。结果表明:以1/100 NB等低营养液体为保护液、琼脂为载体、加入适量宿主菌于4℃,蛭弧菌保存可达2年以上,保存期内蛭弧菌的复苏率和出斑数目较对照组都有极其显著的提高(P<0.01)。宿主菌与蛭弧菌浓度在保藏期内呈下降趋势,在宿主菌浓度下降到106cfu/mL之前,蛭弧菌浓度下降至103pfu/mL;在宿主菌的浓度下降到104cfu/mL之后,蛭弧菌的数目下降至1.0×102pfu/mL。实验结束时,二元保藏中宿主菌/蛭弧菌浓度比保持在104/102。

宽噬菌谱肠炎沙门氏菌噬菌体的生物学特性

以肠炎沙门氏菌为宿主菌,对从鸡场粪尿污水中分离到的肠炎沙门氏菌噬菌体PSA-6a进行生物学特性鉴定。利用双层平板法分离裂解性噬菌体,并采用噬菌斑形态观察、透射电镜分析、噬菌谱测定、最佳感染复数和一步生长曲线等试验对分离到的噬菌体进行生物学特性鉴定。结果表明该噬菌体在宿主菌ATCC 13076平板上形成的噬菌斑为透亮的空斑,直径为0.5～1.0 mm,边缘清晰,无晕环;它具有宽噬菌谱的特性,不仅可强裂解宿主菌ATCC 13076,还可裂解其他4株沙门氏菌和1株大肠杆菌K88;透射电镜观察显示此噬菌体头部呈圆形,直径约81 nm,有一长尾,尾长约200 nm;一步生长曲线显示PSA-6a潜伏期为60 min,爆发期为50 min,裂解量为22;最佳感染复数为1。

噬菌弧菌H2的分离鉴定与噬菌活性分析

以霍乱弧菌作为宿主菌，从南美白对虾养殖水体中分离到一株具有噬菌特性的菌株H2，通过对其形态观察、特异性聚合酶链式反应（PCR）鉴定与系统发育分析，证实菌株H2为噬菌弧菌（Bacteriovoraxsp．）（GenBank登录号：JXl22409），其16SrRNA序列与GenBank基因库中噬菌弧菌属菌株的16SrRNA序列有94％～98％的同源性，而且与噬菌弧菌菌株NE1（GenBank登录号：EF092445）的亲缘关系最近。此外，菌株H2对溶藻弧菌、哈维氏弧菌、创伤弧菌、副溶血弧菌、鳗弧菌等其他弧菌也具有良好的噬菌活性，在pH=7．5、亚硝酸盐氮为0．2mg／L时具有良好的噬菌活性，在氨氮≥0．2mg／L时的噬菌活性降低。确定了噬菌弧菌H2的分类地位，分析了噬菌弧菌H2对常见弧菌的噬菌效果以及水环境因子对其噬菌活性的影响，不仅丰富了弧菌寄生菌的微生物资源，而且为其在养殖水体弧菌消除中的应用奠定了基础。

嗜热链球菌抗噬菌体菌株的选育

研究以酸奶生产菌株嗜热链球菌S2为出发菌株。采用自然选育的方法筛选出其抗噬菌体突变株。获得4株生产性能较好的抗噬菌株KS21、KS22、KS23、KS24,溶源性检测其为非溶源菌。对4株抗性菌株进行20次传代和酸奶发酵实验,结果表明抗性稳定,其中KS23发酵酸奶产酸达109°T,凝乳时间与出发菌株相当。细胞全蛋白SDS-PAGE电泳分析显示突变菌株与出发菌株在某些蛋白表达上有所差异,可能是抗性产生的原因。

1株宽噬菌谱鸡白痢沙门氏菌噬菌体的分离及生物学特性分析

本研究采用双层琼脂平板法从现代化肉鸡养殖场采集的粪便、污水和垫料样品中分离宽噬菌谱鸡白痢沙门氏菌烈性噬菌体,并通过透射电子显微镜观察、噬菌谱分析、热稳定性、pH稳定性、最佳感染复数及一步生长曲线等对分离纯化的噬菌体进行生物学特性分析。结果显示,试验成功分离纯化出一株鸡白痢沙门氏菌噬菌体,命名STP98-a。该噬菌体噬菌斑直径4~5mm,圆形透明,无晕圈,其头部偏椭圆形,长径约61nm,横径约67nm,尾长约112nm,直径约10nm,属于长尾噬菌体科;能裂解不同血清型鸡白痢沙门氏菌和肠炎沙门氏菌肠亚种,噬菌谱宽;在30~60℃保持高活性;在pH 3.0~12.0稳定;最佳感染复数为0.001;一步生长曲线结果显示,其感染宿主菌潜伏期为5min,裂解期为135min,裂解量为93。综上所述,STP98-a为一株宽噬菌谱鸡白痢沙门氏菌烈性噬菌体,可用于鸡白痢沙门氏菌噬菌体制剂的研发。

鼠源噬菌体抗体展示库的构建及初步应用

构建可用于特异性单链抗体(ScFv)筛选和应用的大容量鼠源噬菌体抗体展示库,获得拥有自主知识产权的抗体库材料。从小鼠脾脏细胞中提取总RNA,反转录成c DNA后,分别扩增抗体的重链基因、轻链基因,并设计2条互补的Linker基因。采用重叠延伸PCR(SOE-PCR)法将重链-Linker和Linker-轻链拼接为完整的ScFv基因,酶切、酶连后,将ScFv基因克隆到pCANTAB-5E噬菌粒载体上,经电穿孔导入E.coli TG1感受态细胞中,过夜培养获得初级噬菌体展示库。以单克隆菌落数计算库容量大小,通过比对随机挑取的单克隆噬菌体ScFv可变区序列的差异,分析库的多样性。以Bt毒素(Cry1B、Cry1C、Cry1F)为包被抗原,从库中筛选具有结合活性的ScFv验证库的实用性。经检测,提取的总RNA条带清晰,浓度为2.76μg/μl,扩增的抗体重链基因、轻链基因条带清晰,且2条互补的Linker基因成功添加到重链基因和轻链基因上。经SOE-PCR法扩增,重链-Linker与Linker-轻链成功拼接为ScFv基因。电转化后,经PCR(Polymerase chain reaction)扩增和凝胶电泳检测,证实ScFv基因克隆成功,测得初级噬菌体抗体展示库的库容为3.67×10~8。随机挑取12个单克隆菌种进行测序和比对,证实ScFv基因为鼠源抗体基因,且12个单克隆菌种的ScFv基因可变区均有一定差异,说明ScFv基因具有多样性。以3种Bt毒素(Cry1B、Cry1C、Cry1F)为抗原,经4轮特异性富集筛选后均获得了具有抗原结合活性的噬菌体ScFv菌种,表明该库的实用性较强。

噬菌蛭弧菌防治犊牛细菌性腹泻的潜力分析

犊牛细菌性腹泻是困扰犊牛饲养的普遍问题,致病菌耐药性使犊牛细菌性腹泻的预防和治疗更困难,成本更高。噬菌蛭弧菌是一种捕食革兰氏阴性菌的细菌,其捕食范围广,捕食原理使其不受猎物耐药能力影响,有望成为防治犊牛细菌性腹泻的新途径。本文收集近5年国内犊牛腹泻致病菌及其耐药性研究及近10年国内外噬菌蛭弧菌捕食、安全性和应用研究,从犊牛腹泻防治的角度进行综述,为噬菌蛭弧菌在犊牛细菌性腹泻的防治和研究提供理论依据和新思路。

基于噬菌体展示技术的赭曲霉毒素A高密度模拟表位的表达研究

通过噬菌体展示技术展示赭曲霉毒素A(ochratoxin A,OTA)模拟表位。将带有OTA模拟表位序列的寡核苷酸双链克隆至载体pC89-COTA。利用噬菌体展示技术,通过优化辅助噬菌体感染复数、IPTG加入的时间与剂量等培养条件获得表达有高密度OTA模拟表位的噬菌体。再通过酶联免疫吸附检测(ELISA)方法比较不同的条件下的表达效果,探索最优表达条件。结果表明:成功获得高密度表达OTA模拟表位的噬菌体,辅助噬菌体感染复数与IPTG加入量对模拟表位表达量影响不大,IPTG加入时间对模拟表位表达量有较大影响,优化后模拟表位表达量大大高于优化前。

鼠疫噬菌体试纸方法的研究

目的观察鼠疫噬菌体试纸替代常规噬菌体试验方法的效果。方法采用不同性质及规格的鼠疫噬菌体试纸与常规噬菌体试验方法进行比较。结果鼠疫噬菌体试纸与常规噬菌体试验方法一样,可以裂解鼠疫菌。结论本试验所用不同规格鼠疫噬菌体试纸,对不同浓度鼠疫菌的噬菌效果无差别,表明此方法可用于鼠疫诊断。

新型噬菌体表面呈现载体的构建

作为抗体库筛选的一个有效方法,噬菌体表面呈现技术在单链抗体的研制中得到广泛的应用。以噬菌粒pCANTAB5E和pHB为基础,利用PCR和DNA重组方法,构建了一个新型的用于单链抗体噬菌体表面呈现的噬菌粒载体。随后用一株对大肠杆菌细胞有毒性的人源化单链抗体(1HSCFV)对其呈现单链抗体的效果进行了初步的评价,结果表明新型噬菌粒系统具有更好的呈现能力。

噬菌体展示技术研究进展

噬菌体表面展示技术是一种将外源蛋白或抗体可变区与噬菌体表面特定蛋白质融合并展示于其表面,构建蛋白质或抗体库,并从中筛选特异蛋白质或抗体的基因工程技术。介绍这一技术的原理、相关展示系统以及在蛋白质相互作用的研究,抗体及疫苗的制备、多肽药物的研制等方面的应用潜力和独特的优点。

噬菌蛭弧菌生物学特性的初步研究

研究了噬菌蛭弧菌噬菌斑形成，对宿主菌的寄生和裂解，及其相差显微镜下动力观察和电镜超微结构等．结果表明：噬菌蛭弧菌形态有杆状、弧形、球杆状和球形４种．其鞭毛可分极生单鞭毛、极生双鞭毛和极生三鞭毛．鞭毛螺旋桨样转动是该菌动力的来源，菌体表面有附加结构．

抗HBV PreS2单链噬菌体抗体基因在噬菌体载体中的克隆及初步表达

本文利用基因工程技术,在成功构建抗HBV PreS2 3B9mAb单链可变区抗体(ScFV)基因的基础上,在389 ScFv基因中引入限制性内切酶位点,克隆的噬菌体表达载体pCANTAB5噬菌粒中。

噬菌蛭弧菌对鱼类常见致病菌裂解作用的研究

调查了北京地区２５份水样，其中２４份检出噬菌蛭弧菌。本次试验选用４株鱼类主要致病菌为宿主菌，检出的蛭弧菌对上述４种细菌的裂解范围有所不同。其中嗜水气单胞菌可被全部检出的蛭弧菌裂解（２４／２４），其他３株菌仅部分被裂解，依次为肠型点状气单胞菌（１７／２４），荧光假单胞菌（９／２４），鳗弧菌（７／２４）。本次试验直接从水样中检出６株对４种宿主菌均有裂解作用的蛭弧菌，为进一步利用蛭弧菌防治鱼类常见细菌性疾病提供了可用资料。