三磷酸腺苷结合转运蛋白G超家族成员2特异性人源肺癌噬菌体单链抗体的筛选和鉴定

目的通过噬菌体展示库技术构建人肺癌单链抗体库,并筛选出抗多药耐药蛋白ABCG2的特异性单链抗体。方法取肺腺癌患者癌旁阳性淋巴结提RNA,PCR扩增重链和轻链可变区基因VH、VL,SOE-PCR扩增单链抗体可变区基因sc Fv,克隆入噬菌体表达载体p CANTAB5E,制备初级抗体库。以A549细胞及ABCG2蛋白对抗体库进行6轮淘选。Western blot检测单链抗体的可溶性表达和对ABCG2蛋白表达的影响,ELISA和ICC鉴定其特异性,CCK-8检测其顺铂增敏作用。结果成功筛选出抗ABCG2人源肺腺癌噬菌体单链抗体。Western blot证实其可溶性表达,大小约为34×103且可明显下调ABCG2蛋白的表达。ELISA和ICC检测到该抗体对ABCG2抗原的识别率高达75%,并与A549细胞具有结合特异性。CCK8结果则显示该sc Fv可增加A549细胞对顺铂的敏感性,明显减小其IC50值。结论成功构建了人源肺腺癌噬菌体单链抗体库,并筛选出了能与ABCG2蛋白特异性结合的单链抗体,为后续体内可视化研究和靶向ABCG2+的肺癌干样细胞奠定基础。

抗结核杆菌人源噬菌体单链抗体库的构建及筛选

目的:构建人源噬菌体展示单链抗体(ScFv)库,筛选抗结核杆菌特异性、高亲和力的ScFv.方法:从结核患者的外周血淋巴细胞中,提取RNA并通过RT-PCR扩增出VH和VL基因,并采用SOE-PCR构建ScFv基因,将其克隆入噬粒载pCANTAB5E中,转化于大肠杆菌TG1,通过辅助噬菌体M13K07援救构建噬菌体单链抗体库.结果:初级库库容量为3.5×106,在大肠杆菌TG1中重组后得到2.6×106的次级抗体库.结论:成功构建噬菌体展示ScFv库并获得人源抗结核杆菌特异性ScFv,为进一步研制抗抗结核杆菌的高特异性、高亲和力的基因工程抗体奠定了基础.

T载体在噬菌体单链抗体库中的应用

目的 将T载体用于提高PCR产物的克隆效率，以构建大库容量的噬菌体单链抗体库。方法 用传统的直接酶切的方法处理抗体轻链，直接连到经相同酶切的表达载体构建轻链抗体库；同时制备T载体，将抗体轻链克隆于T载体建成T载体克隆文库。然后再把轻链从T载体上切下来克隆到噬粒表达载体pDAN5，构建轻链抗体库。比较两种方法的效率。结果 制备的T载体质量较好，可以满足建库所需，轻链T载体库为28×10^8，经过T载体过渡比直接酶切连接效率要高出将近1000倍。结论 T载体的应用较好的解决了PCR产物克隆困难的问题。能够用于大容量噬菌体单链抗体库的构建。

胰腺癌人源噬菌体单链抗体库的构建及初步筛选

提取胰腺癌患者的外周淋巴细胞总RNA,以RT-PCR技术分别扩增出人源抗体H链和L链的可变区基因,采用SOE-PCR法将VH和VL片段随机拼接成scFv片段,然后将scFv片段克隆至pCANTAB5E载体,并电转化至感受态TG1菌,经辅助噬菌体M13K07拯救,获得胰腺癌人源噬菌体单链抗体库。结果表明,从外周血淋巴细胞中获取可变区基因,利用噬菌体抗体库技术制备人源抗胰腺癌单链抗体的策略是可行的。

抗弓形虫噬菌体单链抗体库的构建及筛选

采用弓形虫可溶性抗原攻击的小鼠,取小鼠脾脏从中提取细胞总RNA,通过RT-PCR扩增鼠源抗体VH和VL基因,并采用重叠PCR(SOE-PCR)方法构建ScFv基因,将其克隆入噬粒载体pCANTAB5E中,转化于感受态大肠杆菌TG1,通过辅助噬菌体M13K07援救构建噬菌体单链抗体库.从20个噬菌体克隆中筛选到15个具有弓形虫可溶性抗原结合活性的阳性克隆.研究提示成功地构建出了一个有效库容量为2.2×106的鼠抗弓形虫噬菌体单链抗体库.

全人源肝癌噬菌体单链抗体库的鉴定及筛选

目的:对全人源肝癌噬菌体单链抗体库进行鉴定,筛选肝癌抗体,同时对抗体的活性进行鉴定. 方法:PCR鉴定阳性重组菌TG1中人肝癌ScFv的插入率.先以人成纤维细胞黏附后再以肝癌细胞SMMC-7721为抗原对所建抗体库进行3轮“黏附-洗脱-扩增”的亲和筛选. 将筛选后的ScFv进行PCR鉴定及双酶切鉴定;通过EIASA 法鉴定其与人肝癌细胞的结合活性. 结果:ScFv基因插入率为70%.在亲和筛选过程中,肝癌噬菌体单链抗体得到富集,收获率逐轮得到提高,第3轮为第1轮的214倍.筛选后的ScFv进行PCR鉴定及双酶切鉴定后,均可检测到目的基因.得到3株特异性肝癌单链抗体. 结论:利用噬菌体抗体库技术结合减数筛选得到了肝癌噬菌体单链抗体及其基因,且筛选后的抗体片段与人肝癌细胞有特异性的结合活性.

抗乙肝病毒人源噬菌体单链抗体库的构建及筛选

为了构建抗乙肝病毒人源噬菌体特异性单链抗体库,从中筛选抗乙肝病毒人源噬菌体单链抗体库特异性单链抗体,试验提取患者外周淋巴细胞总RNA,以总RNA为模板,通过RT-PCR技术分别扩增出H链和L链可变区基因,采用SOE-PCR方法将VH和VL片段随机拼接成ScFv片段,然后将ScFv片段克隆至pCANTAB5E载体,电转E.coil TG1,构建抗乙肝病毒人源单链抗体库,并从中筛选阳性克隆抗体。结果表明:经过5轮筛选,获得2株能与乙肝病毒抗原特异性结合的阳性克隆。说明利用噬菌体抗体技术可不经免疫制备抗乙肝病毒人源噬菌体特异性单链抗体。

尘肺病噬菌体单链抗体库的构建及鉴定

目的:构建具有良好多样性的人尘肺病噬菌体单链抗体(ScFv)库。方法:收集25例尘肺病患者外周血标本共50mL,密度梯度离心法分离淋巴细胞,Trizol法提取总RNA,逆转录后参考文献设计并合成半巢式PCR引物,扩增抗体重链(VH)和轻链(VL)可变区基因,Linker连接VH和VL,继而连接到噬菌体载体pCANTAB-5E中,连接产物转入感受态大肠杆菌TG1,超感染辅助噬菌体M13KO7,构建噬菌体ScFv库。结果:扩增出VH和VL基因序列并有效地连接,经转化和超感染,构建了库容为2.4×107pfu/mL的ScFV库。结论:成功构建人尘肺病噬菌体ScFV库。

HIF1α特异性人源喉癌噬菌体单链抗体的制备及其对放疗增敏的实验研究

目的利用噬菌体肽库技术,构建HIF1α人源喉癌单链抗体(single-chain variable fragment,scFv),研究其对放疗敏感性的影响。方法提取喉癌患者癌旁阳性淋巴结总RNA,通过RTPCR和重叠延伸PCR扩增得到可变区基因scFv,将其重组到载体pCANTAB5E中,转化至TG1大肠杆菌,以制备初级抗体库。以HEP2细胞及HIF1α纯化抗原对抗体库进行淘选。SDS-PAGE电泳检测scFv的可溶性表达,Western blot检测其对HIF1α蛋白表达的影响,ELISA和细胞免疫化学鉴定其特异性,CCK-8检测scFv联合X线照射后HEP2细胞的存活率,克隆形成实验分析scFv处理后HEP2细胞放疗存活曲线。结果成功制备HIF1α人源喉癌单链抗体scFv,SDS-PAGE电泳证实其可溶性表达且相对分子质量约为34×10~3,Western blot表明其能下调HIF1α蛋白的表达。ELISA检测到该抗体对HIF1α抗原的识别率高达79%,细胞免疫化学显示该抗体与HEP2细胞特异性结合。CCK-8检测结果显示scFv联合X线照射后,较单纯X线照射组明显降低了HEP2细胞的存活率(P<0.05),克隆形成实验结果显示scFv对放射的增敏比为1.89。结论成功构建了HIF1α人源喉癌单链抗体,且其能增加HEP2细胞对放疗的敏感性。

PCV2 Cap蛋白噬菌体单链抗体库的构建及淘选

用重组的PCV2Cap蛋白免疫Balb/c小鼠,从免疫小鼠脾细胞中提取总RNA,经反转录后,扩增抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因,利用Overlap PCR方法将VH基因和VL基因组装成单链抗体(ScFv)基因,将ScFv基因克隆到噬菌粒载体pCANTAB-5E中,并将重组载体转化至感受态大肠杆菌TG1中,获得PCV2Cap蛋白的单链抗体文库,经测定抗体库库容为3.58×106。通过辅助噬菌体M13K07拯救,构建鼠源PCV2Cap蛋白的噬菌体单链抗体库。4轮生物淘选后,经ELISA方法检测,最终获得3株能与Cap蛋白特异性结合的噬菌体克隆。

从噬菌体单链抗体库中筛选MMP7单链抗体

目的:从人天然噬菌体单链抗体库中筛选与MMP7特异结合的单链抗体(scFv),并对其特异性及活性进行分析。方法:转化MMP7质粒,分离、纯化与鉴定表达的MMP7。以MMP7为靶标对人天然噬菌体单链抗体库进行4轮的筛选富集,初步筛选到能与MMP7结合的scFv。通过ELISA和Western对所获scFv的特异性进行分析。结果:分离纯化鉴定了MMP7,筛选获得了结合MMP7的人噬菌体抗体。ELISA和Western表明筛选到的scFv特异性较好。结论:利用噬菌体抗体库技术可直接获得特异人源MMP7抗体,为抗MMP7单抗药物的研发提供了新的可能性。

HBsAg人源噬菌体单链抗体的筛选及其在临床诊断中的应用

目的 筛选乙型肝炎病毒 (HBV)表面抗原 (HBsAg)的人源噬菌体单链抗体 ,并探讨其在临床治疗和诊断中的应用价值。方法 以HBsAg阳性血清超速离心纯化的HBsAg为固相抗原 ,从噬菌体单链可变区半合成抗体库中经过 5轮“吸附 洗脱 扩增”筛选过程 ,获得特异性较强的HBsAg人源单链可变区抗体 (ScFv) ;用该抗体对 10例石蜡包埋的乙型肝炎患者肝组织进行免疫组化鉴定。结果 酶联免疫吸附法 (ELISA)结果表明 ,制备的HBV人源单链抗体能与HBsAg抗原特异性结合 ;免疫组化结果表明 ,该抗体能够特异性识别乙型肝炎患者肝组织中的HBsAg抗原 ,与正常肝组织及丙型肝炎病毒 (HCV)的抗原均无交叉反应。结论 此法制备的单链抗体亲和性好 ,特异性强 ,且制备方法简便 ,周期短 ,为HBV病原的检测提供了新的有效试剂 ,为今后HBsAg人源抗体的研究和应用奠定了基础。

抗人肺癌单链抗体噬菌体库的构建及特异性单链抗体的鉴定

目的构建人源噬菌体抗体库,并从中筛选出抗肺癌人源单链抗体。方法提取肺癌患者癌旁淋巴结组织,通过RT-PCR扩增出重链可变区基因(VH)和轻链可变区基因(VL),再经剪切-重叠-延伸PCR(SOE-PCR)将VH和VL连接得到单链抗体(ScFv)。将双酶切后的ScFv基因片段克隆入噬菌体表达载体pCANTAB5E,得到初级噬菌体抗体库。以肺腺癌细胞株A549为抗原对抗体库进行4轮筛选富集,鉴定抗体库性能。将得到的阳性克隆用IPTG诱导表达并进行检测。结果成功构建噬菌体单链抗体库。经筛选富集,噬菌体收获率得到增加,第4轮是第1轮的115倍。随机选取10个克隆,通过ELISA法检测到其中7个与A549细胞呈阳性反应,阳性率为70%。SDS-PAGE及ELISA检测证实得到人源抗肺癌单链抗体。结论成功构建人源单链抗体噬菌体库,从中获得具有较高特异性的抗人肺癌单链抗体。

基于M13噬菌体展示单链抗体文库的新型蛋白质均衡器的研制及其在肾病患者尿蛋白分析中的应用

通过将展示单链抗体(scFv)文库的M13噬菌体固定于冷凝胶整体柱表面制备了一种新型蛋白质均衡器。由于展示的scFv片段具有种类多、数目大以及与蛋白质结合的特异性强等优点,因此其非常适合用于复杂蛋白质样品的预处理。将肾病患者尿蛋白在平衡器上反复上样5次后,依次使用2mol/LNaCl、50mmol/LGly-HCl(pH2.5)和凝血酶溶液洗脱与均衡器结合的蛋白质,收集各馏分,并采用串联微柱反相液相色谱-电喷雾质谱进行蛋白质的分离鉴定。与未经均衡器处理的样品相比,鉴定的蛋白质数目由142个提高到396个。此外,凝胶电泳的分析结果显示,在上样流出液中蛋白质的浓度差异明显变小,大量的高丰度蛋白质存在于NaCl洗脱液中。上述结果表明,基于M13噬菌体展示scFv文库的新型蛋白质均衡器能够有效减小样品中蛋白质的浓度差异,有利于发现更多的低丰度蛋白质。

抗HBV PreS2单链噬菌体抗体基因在噬菌体载体中的克隆及初步表达

本文利用基因工程技术,在成功构建抗HBV PreS2 3B9mAb单链可变区抗体(ScFV)基因的基础上,在389 ScFv基因中引入限制性内切酶位点,克隆的噬菌体表达载体pCANTAB5噬菌粒中。

圆形碘孢虫单链抗体库的筛选与阳性克隆特征分析

噬菌体抗体库已成为单克隆抗体生成的重要技术之一。本文通过用圆形碘孢虫相关抗原对已构建的鼠源免疫噬菌体展示单链组合抗体文库进行生物淘选,并对几株相对亲和力较高的阳性单克隆序列特征、相对亲和力及热稳定性等进行了分析。ELISA、间接免疫荧光及免疫印迹等进行特征鉴定。结果表明,噬菌体抗体库技术对于分离抗圆形碘孢虫不同表位抗原是可行的,将为粘体动物的抗原物质及分布、寄生虫-宿主相互关系等研究提供丰富的抗体来源。

甲状腺未分化癌人源单链抗体库的构建及筛选

目的构建天然人源甲状腺未分化癌噬菌体单链抗体库并初步筛选出抗甲状腺未分化癌抗体。方法从甲状腺未分化癌患者癌周淋巴结组织中提取总RNA,采用RT-PCR技术扩增抗体可变区基因VH和VL基因片段,并分别与相应Linker连接,再通过重叠延伸PCR技术将其拼接组装成sc Fv基因片段,并引入酶切位点SfiⅠ和NotⅠ。将双酶切后的sc Fv重组基因片段与噬菌粒栽体p CANTAB-5E连接,产物经化学转化转入大肠杆菌TG1,超感染噬菌体,构建噬菌体单链抗体库。以甲状腺未分化癌细胞(ARO细胞株)为抗原对该抗体库进行4轮"吸附-洗脱-扩增"的筛选,并行ELISA鉴定抗体特异性。结果成功获得约为750 bp的sc Fv基因。用p UC19标准质粒测定转化效率达到108 cfu/μg,双酶切鉴定sc Fv基因的阳性插入率为86.4%(19/22)。筛选过程中,甲状腺未分化癌单链抗体得到富集,收获率不断提高,第4轮为第1轮的77倍。ELISA结果显示筛选出的抗体能与甲状腺ARO细胞株特异性结合。结论成功构建了人源甲状腺未分化癌噬菌体单链抗体库,并从中筛选出具有甲状腺未分化癌细胞特异性的人源噬菌体单链抗体,为进一步放免研究打下基础。

人源甲状腺髓样癌噬菌体抗体库的构建及初步鉴定

目的:应用噬菌体抗体展示技术,构建大容量天然人源甲状腺髓样癌(medullary thyroid carcinoma,MTC)噬菌体单链抗体库。方法:提取MTC病人癌周淋巴结总RNA,通过RT-PCR方法获得抗体可变区基因V H和V L基因片断,以它们为模板分别扩增V H-Linker和V L-Linker,再用剪切重叠延伸PCR技术将之拼接组装成单链抗体可变区基因片段(single chain fragment variable,scFv)后引入酶切位点SfiⅠ和NotⅠ。将scFv基因克隆入噬菌粒栽体pCANTAB-5E后经电转入大肠杆菌Ecoli TG1,之后经辅助噬菌体M13K07超感染,构建人源MTC噬菌体单链抗体库。PCR鉴定scFv片段阳性插入率,1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆双酶切产物。结果:MTC周围淋巴结总RNA的琼脂糖电泳结果可见清晰的28 S、18 S条带;V H基因的大小约为370 bp,V L基因为350 bp,组装后的scFv基因约为750 bp。用pUC19标准质粒测定转化效率达到108cfu/μg,scFv的阳性插入率为87.5%(21/24)。结论:成功地构建了人源MTC噬菌体展示文库,为进一步筛选具有MTC细胞特异性的人源噬菌体单链抗体奠定了实验基础。

荧光素标记噬菌体抗体的制备及其应用

目的:通过直接荧光素标记方法制备荧光标记的噬菌体单链抗体,并且对于肿瘤细胞的免疫学活性进行检测。方法:用异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)和四甲基异硫氰酸罗丹明(tetramethyl rhodamine isothio cyanate,TRITC)标记的单链噬菌体抗体对肿瘤细胞进行直接染色,通过荧光显微镜和激光扫描共聚焦显微镜检测观察单链抗体与肿瘤细胞及白细胞的荧光显色情况。结果:荧光显微镜和激光扫描共聚焦显微镜检测证实标记荧光素FITC、TRITC的噬菌体抗体与肿瘤细胞有较好的特异性结合,主要结合在细胞膜的表面。比较荧光的强度,与白细胞结合活性有差异。结论:用荧光素标记的噬菌体单链抗体能够作为检测试剂用于细胞、组织的检测,具备应用于免疫检测分析的价值,进一步证实所筛选的抗肿瘤细胞噬菌体抗体具有较好的免疫生物学活性。

轮换淘选法筛选凝血酶特异的噬菌体抗体

以抗原为选择剂,通过淘选可以从噬菌体抗体库中获得特异的单链抗体克隆。采用液相—固相轮换淘选的方法,从鼠源噬菌体抗体库中淘选出与凝血酶特异结合的单链抗体。首先,用光敏生物素将凝血酶生物素化,然后用链亲和素磁珠法淘选与凝血酶特异结合的重组噬菌体。噬菌体扩增后使用酶标板进行第2轮淘选,以除去上一轮中非特异结合的重组噬菌体。经4轮轮换淘选,最后从23个单克隆噬菌体抗体中分离出4个凝血酶特异的噬菌体抗体。