基于3种原噬菌体基因的赣南地区黄龙病菌种群动态分析

柑橘黄龙病(citrus Huanglongbing,HLB)对全球柑橘产业造成了重大经济损失。为明确赣南地区柑橘黄龙病菌基因组上原噬菌体的分子特征和传播动态,本研究对采自赣南10个市县区的470份样品进行HLB检测,并对阳性样品中3种类型的原噬菌体(SC1、SC2和P-JXGC-3)上的SC1_gp050、SC2_gp040和PJXGC_gp08基因序列进行遗传多样性分析和谱系地理学分析。结果显示,共检出74份HLB阳性样品,包括7种原噬菌体组合类型:SC1、SC2、P-JXGC-3、SC1+SC2、SC1+P-JXGC-3、SC2+P-JXGC-3和SC1+SC2+P-JXGC-3,含SC2类型的原噬菌体检出41份,检出率为55.41%,说明赣南地区含SC2类型的原噬菌体菌株最为普遍。遗传多样性分析结果表明,赣南地区的3种原噬菌体的基因交流频繁,遗传分化现象不明显。选择压力分析结果显示,SC1和P-JXGC-3类型的原噬菌体均处于负向选择,SC2类型的原噬菌体处于正向选择。基于3种原噬菌体上的基因构建的中介网络图和单倍型分布表结果显示,3种原噬菌体均存在1个祖先单倍型,其他独有单倍型均是由该祖先单倍型经多次突变而来,其中PJXGC_gp08基因产生的独有单倍型最多。时空动态分析结果显示,SC1类型原噬菌体存在2条传播路径,分别为安远和全南地区间的相互传播(3<BF<20),安远地区可能是SC1类型原噬菌体的主要扩散传播地。P-JXGC-3类型原噬菌体存在3条传播路径,瑞金可能是P-JXGC-3类型原噬菌体的扩散中心。上述成果为解析柑橘黄龙病菌亚洲种Candidatus Liberibacter asiaticus在赣南地区的遗传进化及扩散动态提供参考依据。

柑橘黄龙病菌在雷波脐橙中的分布规律及其原噬菌体类型分析

为了解柑橘黄龙病菌在雷波脐橙不同组织部位的含量差异和遗传多样性,为雷波县柑橘黄龙病流行研究提供理论基础,利用Real-time PCR分析黄龙病菌在雷波脐橙8个组织(新梢叶片、新梢韧皮部、果蒂、橘络、果实中轴、枝条叶片、枝条上部韧皮部、枝条下部韧皮部)以及橘络不同分段中的绝对定量,并鉴定其原噬菌体类型。结果表明,黄龙病菌含量在果实组织(果蒂、橘络、中轴)中显著高于新梢组织及枝条组织。黄龙病菌在橘络中含量不均匀,集中分布在果实中间部分。通过原噬菌体类型鉴定发现,新梢组织的病原为Type 2+Type 4类型,而成熟组织的病原为Type 1类型,并且在果蒂中存在两类病原混合感染。综上,黄龙病菌在雷波脐橙中主要富集于果实组织的橘络中部,并且目前雷波县存在外源的黄龙病菌侵染新梢组织的情况。

大肠埃希菌耐药基因及可移动遗传元件与噬菌体原遗传标记研究

目的调查大肠埃希菌临床分离株的耐药性及遗传学特征。方法收集2009年1-12月患者尿液标本中分离的大肠埃希菌20株,采用聚合酶链反应(PCR)及序列分析的方法分析23种β-内酰胺酶基因、14种氨基糖苷类修饰酶基因、6种16SrRNA甲基化酶基因、8种可移动遗传元件遗传标记、9种噬菌体原遗传标记以及与细菌细胞分裂相关的2种基因(dicB、kilR),与细菌致病性相关的2种基因(hofQ、ompT)。结果 20株大肠埃希菌共检出3种β-内酰胺酶基因、6种氨基糖苷类修饰酶基因、1种16SrRNA甲基化酶基因,7种可移动遗传元件遗传标记、6种噬菌体原遗传标记、2种与细菌细胞分裂相关的基因、2种与细菌致病性相关的基因;20株大肠埃希菌全部基因检测结果的样本聚类分析示,1、4、9、10号株为一簇,其余为另一簇。结论对大肠埃希菌尿液分离株进行β-内酰胺酶基因、氨基糖苷类修饰酶基因、16SrRNA甲基化酶基因、可移动遗传元件遗传标记、噬菌体原遗传标记以及与细菌细胞分裂相关的基因,与细菌致病性相关的基因检测与分析,国内为首次,从样本聚类分析图可见,虽无克隆传播,但6、12号株与7、18号株有较近的亲缘关系,有医院感染的可能性。

多药耐药肺炎克雷伯菌噬菌体原/噬菌体、整合子、转座子、插入序列及质粒遗传标记分析

目的调查多药耐药肺炎克雷伯菌(MDRKP)中噬菌体原/噬菌体、整合子、转座子、插入序列和质粒等可移动遗传元件遗传标记的存在情况。方法收集2008年8月-2010年5月6所医院共47株MDRKP,采用聚合酶链反应(PCR)及序列分析的方法,分析12种噬菌体原/噬菌体、3种整合子、7种转座子插入序列和两种质粒共24种可移动遗传元件遗传标记。结果该组MDRKP共检出1种噬菌体原/噬菌体、1种整合子、6种转座子和插入序列、两种质粒遗传标记。结论携带Ⅰ类整合子(intⅠ1)、插入序列(IS26、IS903、ISEcp1、ISKpn6)、耐药质粒(trbC)是该组MDRKP耐药的一个重要原因,MDRKP同时作噬菌体原/噬菌体、整合子、转座子、插入序列和质粒等遗传标记检测为国内首次。

中国柑橘黄龙病病原菌两个原噬菌体超变异基因遗传多样性

【目的】通过原噬菌体区域高度变异的基因位点研究柑橘黄龙病病原菌亚洲种(‘Candidatus Liberibacter asiaticus’)的种群分化,探讨病原菌种群遗传多样性水平和遗传结构。【方法】基于2种原噬菌体类型(SC1和SC2)对应的超变异基因区域设计2对引物(Lap-TJ-F/Lap-TJ-R1和Lap-TJ-F/Lap-TJ-R2),对中国不同柑橘产区的224个‘Ca.L.asiaticus’株系进行PCR检测和序列分析。【结果】PCR扩增的条带类型呈多态性,具有4种条带类型(SC1-1、SC1-2、SC2-1和SC2-2),西南地区以SC1-1型为主,广东、广西地区以SC2-1型为主,福建、江西、浙江地区没有明显优势的扩增型。分析SC1-1和SC1-2对应序列表明,其差异系由于132 bp的卫星序列和24 bp的小卫星序列2种串联重复序列数不同引起,而SC2-1和SC2-2的差异系由原噬菌体内部基因重排引起。【结论】中国不同地理来源病原菌株系在原噬菌体区域具有较丰富的多态性,对该基因区域研究将有助于揭示中国‘Ca.L.asiaticus’种群的遗传多样性。

广东梅州柑橘黄龙病和病毒病的发生调查及其黄龙病菌原噬菌体多样性

【目的】调查柑橘黄龙病(Huanglongbing,HLB)和病毒病在广东省梅州市柑橘主产区的危害情况,分析该地区柑橘黄龙病菌(CLas)的原噬菌体多样性。【方法】以16S rDNA为模板设计引物,利用实时荧光定量PCR(qPCR)检测梅州市不同抽检地在2017-2019年3年间柑橘黄龙病的发病情况;同时分别采用已报道的柑橘衰退病毒(Citrus tristeza virus,CTV)、柑橘裂皮病毒(Citrus exocortis viroid,CEVd)、柑橘褪绿矮缩病毒(Citrus chlorotic dwarf-associated virus,CCDa V)、柑橘碎叶病毒(Citrus tatter leaf virus,CTLV)和柑橘黄脉病毒(Citrus yellow vein clearing virus,CYVCV)的特异性检测引物,提取样品的RNA,反转后以样品的c DNA为模板,通过普通PCR的方法分析梅州市抽检地区柑橘病毒病的发生情况。此外,以基于2种原噬菌体类型(SC1和SC2)对应的超变异基因区域设计的2对引物(Lap-TJ-F/Lap-TJ-R1和Lap-TJ-F/Lap-TJ-R2),运用普通PCR方法分析该地区CLas菌株原噬菌体的遗传多样性。【结果】除2018年9月梅州大浦顺兴公司蜜柚基地的抽检样品外,梅州市其他被检地区均发现CLas。总体来说,梅州市的脐橙CLas检出率为55.3%,蜜柚为61.5%,沙田柚为61.7%。其中2017年采集自平原县大拓镇的蜜柚和沙田柚样品CLas检出率为100%,兴宁市白马镇的蜜柚为100%,沙田柚为80%;其他抽检地区的样品CLas检出率在16.7%-83.3%。虽然梅州市部分地区的检出率较高,但其病原菌的含量并不高,大部分处于柑橘黄龙病发病初、中期,属可防可控阶段;此外,梅州市柑橘病毒的总检出率不高,CTV、CTLV和CYVCV为梅州的主要病毒,CEVd和CCDa V没有检测到。CTV、CTLV和CYVCV在脐橙上的检出率依次为78.9%、7.9%和21.1%,蜜柚为15.4%、25.0%和9.6%,沙田柚为6.4%、2.1%和4.3%。基于Lap-TJ-F/Lap-TJ-R1和Lap-TJ-F/Lap-TJ-R2来研究CLas原噬菌体多样性的PCR扩增条带共有4种类型(SC1-1、SC1-2、SC2-1和SC2-2),经过PCR电泳和测序得出,来自梅州市脐橙和沙田柚的CLas菌株以SC2-1型为主,蜜柚上以SC1-1型为主。【结论】梅州柑橘产区的柑橘黄龙病目前属于可防可控阶段,其病原菌菌株的原噬菌体在不同品种上具有其独特性;由于在抽检时发现有柑橘病毒病的存在,因此在种植过程中需加强种苗监管,同时应采取有效措施对柑橘黄龙病和柑橘木虱(Diaphorina citri)进行绿色防控。

赣南柑橘木虱体内黄龙病菌原噬菌体类型多样性的研究

柑橘黄龙病是柑橘生产中的毁灭性病害,且该病病原菌中存在噬菌体/原噬菌体。原噬菌体序列是该病病原菌基因组动态变化的关键组分,对病原菌种内多样性起重要作用。为探明赣南地区柑橘木虱体内黄龙病菌原噬菌体类型的多样性,利用2对PCR引物对分别采自赣南赣州市、寻乌、于都、定南、瑞金、南康、崇义等7个不同柑橘产区的42头柑橘木虱阳性样品进行PCR检测和测序。结果表明在赣南地区柑橘木虱体内黄龙病菌株系原噬菌体类型的存在划分为4种:单一SC1类型、单一SC2类型、没有噬菌体类型和SC1-SC2噬菌体类型。其中单一的原噬菌体类型(SC1 or SC2)检测率达67%,而2种原噬菌体共存或未检测到噬菌体类型分别占12%、21%。由此可见赣南柑橘木虱体内黄龙病菌株中单一的原噬菌体占一定优势,可能是由于2种原噬菌体在寄主中存在竞争。对赣南柑橘木虱黄龙病菌株中噬菌体/原噬菌体类型检测有助于了解该区菌株噬菌体/原噬菌体的遗传多样性,也有助于进一步的研究分析柑橘木虱的传毒机制。

基于原噬菌体类型的广西柑橘黄龙病菌种群分析

2016年-2021年,从广西各柑橘产区采集叶片斑驳、黄化等疑似黄龙病症状的柑橘样品,利用黄龙病特异引物和基于原噬菌体类型的特异引物对样品进行鉴定及分析,结果显示,所采集的3293份样品中有856份样品为黄龙病阳性样品,阳性样品的检出率为25.99%,阳性样品在广西的14个地市均有分布。基于原噬菌体类型的黄龙病菌种群分析发现,广西存在7种类型的菌株,分别是type 1菌株、type 2菌株、type 3菌株、type 1+type 2菌株、type 2+type 3菌株、type 1+type 2+type 3菌株及未检出任何类型菌株(none type),其中,type 2类型原噬菌体菌株为优势种群。

O157∶H7原噬菌体消除菌株的鉴定与分析

目的 O15 7∶H7是一种重要的新发传染病病原 ,它主要引起出血性或非出血性腹泻 ,出血性结肠炎 (HC)或溶血性尿路综合征 (HUS)等。研究表明引起HC和HUS的主要毒力因子是由整合到O15 7基因组中的原噬菌体编码的志贺毒素(Stx) ,包括Stx1和Stx2 ,它们分别由原噬菌体 933v和 933w所编码。由于原噬菌体本身具有潜在的不稳定性 ,本研究以O15 7∶H786 - 2 4为始发菌株 ,将其进行传代培养 ,筛选原噬菌体消除菌株 ,对原噬菌体在O15 7基因组中的整合位点进行分析 ,并用Vero细胞对原噬菌体消除菌株的细胞毒性进行鉴定。结果筛选到了原噬菌体消除后的O15 7菌株 ,该菌株丧失了对Vero细胞的毒性作用。序列比较分析表明原噬菌体 933v的整合位点位于O15 7∶H7EDL933基因组中第 2 96 6 137位的相对位置 ,在整合位点两侧有一个 2 0bp的直接重复序列 ,原噬菌体 933w的整合位点位于基因组中第 1330 82 6位的相对位置 ,在整合位点两侧有一个 7bp的直接重复序列。该研究证实了编码Stx的原噬菌体具有不稳定性 ,原噬菌体对O15 7的致病性具有重要作用 ,也提示原噬菌体在致病菌的进化过程中也具有重要作用。

原噬菌体PBSX阻遏基因及其温度敏感型等位基因的克隆分析

本研究利用聚合酶链式反应技术，成功地克隆了枯草芽孢杆菌缺陷型原噬菌体ＰＢＳＸ阻遏基因及其温度敏感型等位基因。核苷酸序列分析发现，野生型及其温度敏感型阻遏基因之间的碱基变异较大，但却存在几乎完全相同的开放读框，尤其是开放读框ｏｒｆⅠ，可能编码着１１３个氨基酸的阻遏蛋白，并且还推定了开放读框的启动区和核糖体结合位点。通过互补实验，证实了野生型阻遏基因的产物能够抑制温度诱导ＰＢＳＸ原噬菌体，表明克隆的基因有着正常的生物活性。

贵州南部柑桔黄龙病菌两个原噬菌体位点遗传多样性分析

为研究贵州南部柑桔黄龙病菌'Candidatus Liberibacter asiaticus'遗传多样性,分析了来自罗甸、望谟、册亨、兴义、榕江和从江等6个南部县(市)的54个病原菌样品(株系)在SC1和SC2两个原噬菌体位点上的变异情况。结果显示,不同行政区域和海拔来源的病原菌株系在两个位点上的扩增情况不同,共存在4种(SC1,SC2,SC1+SC2,SC1和SC2均无)原噬菌体类型;相同原噬菌体类型株系的扩增序列之间,也存在碱基变异及插入/缺失。

测定λ原噬菌体诱导频率的新方法

本文报道两种测定λ原噬菌体紫外诱导频率的新方法—菌落计数法和平板诱导法。将溶源菌液经紫外诱导暗培养稀释后直接涂布在平板上培养 ,根据平板上菌落形成单位数计算λ噬菌体紫外诱导频率。另一种是将溶源菌与指示菌混合制备的平板用紫外线诱导 ,根据平板上噬菌体形成单位确定λ噬菌体紫外诱导频率。这两种方法不仅能准确测定噬菌体紫外诱导频率 ,而且操作简便 ,节省时间和用具 ,重复性好。本研究还将冬虫夏草浸出汁与溶源菌混合后进行紫外辐射 ,通过几种方法进行比较 ,结果证明建立的新方法确实可行 ,易操作 ;

多药耐药大肠埃希菌9种噬菌体原遗传标记研究

目的调查多药耐药大肠埃希菌中9种噬菌体原遗传标记存在情况。方法用PCR检测多药耐药大肠埃希菌中9种噬菌体原遗传标记(intF、intD、intE、intR、intQ、flu、intS、intZ、intA)和两种细菌细胞分裂基因(dicB、kilR),并进行BIOCYC基因数据库检索。结果 20株多药耐药大肠埃希菌共检测到intD、intE、intR、in-tQ、intS等5种噬菌体原遗传标记,两种dicB、kilR基因均有检出;intF、flu、intZ、intA4种遗传标记均未检出;有14株检出>1种与细菌细胞分裂相关的基因,2号株intR阳性基因测得序列经BLAST比对,与已在GenBank登录的CP002516.1序列相同(截止日为2011年3月9日);8号株intQ阳性基因测得序列经BLAST比对,与已在GenBank登录的相同AP010960.1序列99%相同。结论噬菌体原遗传标记或许是多药耐药大肠埃希菌高度耐药的一个重要辅助因素,但其作用机制及相关功能还有待进一步研究。

用原噬菌体诱导法测定14种常用抗肿瘤药物的遗传毒性

随着医药科技的发展及肿瘤发病率的上升,抗肿瘤药物的品种及使用量在日益增加,研究该类药物在治疗肿瘤的同时是否产生致癌作用,对选配联合化疗方案,药品的研制和肿瘤预防具有重要意义。以往的研究多注重临床疗效及有否临床症状的副作用,对其潜在的遗传毒性研究尚少。原噬菌体诱导法较快速而敏感,假阳性率低,所检出的诱导剂一般也是致癌剂,已正式用于检测环境诱变剂。为了进一步完善该方法,筛选更多的阳性对照剂。

赣南柑橘木虱体内黄龙病菌psy62株系原噬菌体类型多样性的研究

为探明柑橘木虱体内黄龙病菌psy62株系中原噬菌体遗传多样性及与柑橘株系的遗传差异,本研究将利用3对引物在psy62基因组中2个噬菌体FP1和FP2的同源序列区域内对赣南地区阳性样品进行PCR扩增和测序。结果显示,赣南地区阳性样品在此基因区域内有28头柑橘木虱检测到原噬菌体,共有5种类型,分别为A,A2,B,C,C1。其中A,B的检测率相对较高;C1检测率最低,为7.1%。由此可见,在此基因位点不同地理位置的柑橘木虱原噬菌体种群有较大的遗传差异,且与美国佛罗里达的"Ca.L.asiaticus"株系,中国柑橘叶片"Ca.L.asiaticus"株系均有显著的遗传差异,这有助于进一步研究分析原噬菌体的种类差异对柑橘木虱传毒机制的影响。

原噬菌体诱导法检测灵菌素潜在致癌毒性

本文报道用原噬菌体诱导法检测灵菌素的潜在遗传毒性结果,表明:在不加S_0的情况下,灵菌素为阴性反应。

致病性大肠杆菌携带原噬菌体的预测及耐药性与毒力研究

【目的】研究致病性大肠杆菌携带原噬菌体的比例、原噬菌体携带毒力基因及耐药基因的情况,了解致病性大肠杆菌中原噬菌体对菌株的耐药性与毒力的影响,保证噬菌体生产菌的生物安全性,为大肠杆菌噬菌体的基础研究与应用提供借鉴。【方法】从NCBI中下载大肠杆菌全基因组信息,通过在线网站预测大肠杆菌中携带的原噬菌体数目,并分析原噬菌体的GC含量、基因组大小、占细菌基因组比例等基因组特征及完整型原噬菌体的类型,对原噬菌体做初步分类,统计分析完整型原噬菌体中携带耐药基因数目、耐药表型、耐药机制与毒力基因数目、毒力基因家族分布等。【结果】112株大肠杆菌携带完整型原噬菌体1024个,疑似型原噬菌体287个,缺陷型原噬菌体505个。1024个完整型原噬菌体中,多数与长尾噬菌体相似,占70.21%(719/1024);共有63种噬菌体类型,其中BP4795(登录号:NC_004813.1)类型的占比最高,达到19.24%(197/1024),其次是DE3(登录号:NC_042057.1),占比11.72%(120/1024)。大肠杆菌携带原噬菌体的GC含量在38%~57%之间,基因组大小为3.1~152.6 kb,其中80 kb以内的原噬菌体占97.03%(1762/1816)。1024个完整型原噬菌体中携带耐药基因占比为6.35%(65/1024),共携带耐药基因253个,分别来自11个抗生素耐药基因家族;携带一个或多个毒力基因的完整性原噬菌体占42.78%(438/1024),共携带毒力基因1274个,分别来自9个不同毒力因子家族,平均每个完整型原噬菌体携带毒力基因2.9个。【结论】大肠杆菌普遍携带原噬菌体,原噬菌体中部分携带耐药基因与毒力基因,在实际应用中应充分评估其风险,防止原噬菌体造成的耐药基因与毒力基因在菌株之间的转移。

携带不同原噬菌体的黄龙病菌在柑橘木虱体内的增殖及致病力

【背景】在中国,柑橘黄龙病(citrus Huanglongbing,HLB)是由候选韧皮部杆菌亚洲种(‘Candidatus Liberibacter asiaticus’,CLas)所引起的一种毁灭性病害,严重威胁着柑橘产业的可持续发展。前期研究表明CLas全基因组上鉴定出3种单独类型的原噬菌体基因序列,而广东黄龙病菌主要以Type-2原噬菌体类型和Type-1+3混合原噬菌体类型为主。这两种CLas菌株在传病媒介——柑橘木虱(Diaphorina citri)体内的增殖及其对寄主植物的致病力差异依然不清楚。【目的】比较Type-2-CLas菌株和Type-1+3-CLas菌株在柑橘木虱体内的增殖能力和对砂糖橘(Citrus reticulata Blanco cv.Shatangju)的致病力差异。【方法】嫁接准备含有不同CLas菌株的砂糖橘,分别将50头柑橘木虱若虫和50头成虫放置到含有不同CLas菌株的砂糖橘嫩梢上刺吸获菌6、12、18 d,利用荧光定量PCR检测并统计柑橘木虱若虫期、成虫期对Type-2-CLas和Type-1+3-CLas的获菌率和获菌量差异。饲养分别携带Type-2-CLas和Type-1+3-CLas菌株的柑橘木虱种群,分别将携带Type-2-CLas和Type-1+3-CLas菌株的20头柑橘木虱成虫置于健康砂糖橘嫩梢上刺吸2周,移除木虱后统计柑橘木虱获菌率和获菌量,每月追踪砂糖橘症状变化和叶片病菌浓度,利用光学显微镜观察接种360 d时叶片韧皮部和薄壁细胞形态学变化情况。【结果】柑橘木虱以若虫形态对Type-2-CLas和Type-1+3-CLas菌株的获菌率和获菌量无显著差异,但柑橘木虱以成虫形态对Type-2-CLas的获菌率和获菌量显著高于Type-1+3-CLas菌株。在虫传后120 d时接种Type-2-CLas菌株的叶片附近新叶会呈现更严重的斑驳症状。Type-2-CLas菌株侵染砂糖橘一年后抽出的新叶转绿不正常,出现均匀黄化、小叶的明显症状,而Type-1+3-CLas菌株新叶症状则为典型斑驳和革质化。叶片解剖观察结果发现,在叶片病菌浓度相近的情况下,相比于接种了Type-1+3-CLas的叶片,接种了Type-2-CLas菌株的叶片韧皮部细胞发生更严重的细胞塌缩,在叶脉和叶肉薄壁细胞内造成较多的淀粉粒积累。【结论】Type-2-CLas比Type-1+3-CLas更容易在柑橘木虱成虫体内增殖,且达到较高的病菌浓度,间接证明了Type-2-CLas菌株具有高传染性。感染Type-2-CLas的新叶呈现均匀黄化、叶小的症状,而感染Type-1+3-CLas的新叶呈现较为斑驳和革质化的症状,Type-2-CLas比Type-1+3-CLas造成更严重的叶脉韧皮部塌缩和淀粉粒积累情况,说明Type-2-CLas比Type-1+3-CLas对柑橘具有更强的致病力。

烟草青枯菌FQY_4基因组中原噬菌体生物信息学分析

为了解青枯菌(ralstonia solanacearum)基因组中原噬菌体和噬菌体元件的信息,在烟草青枯菌FQY_4全基因组序列的基础上,分析了FQY_4染色体上的原噬菌体,结果显示FQY_4染色体上有1个具有完整噬菌体特征的原噬菌体,3个噬菌体元件。比较青枯菌GMI1000和FQY_4中的原噬菌体的序列信息,结果显示它们具有一定的相似性,其中青枯菌FQY_4的原噬菌体-2与噬菌体φRSA1的相似度为82%,它们有40个编码基因高度同源,相似度为99%以上。这些信息可为青枯菌原噬菌体的多样性分析,噬菌体和青枯菌的协同进化研究奠定基础。