噬菌体呈现技术制备结肠癌抗独特型抗体

以纯化的鼠抗人结肠癌细胞单克隆抗体 (简称单抗 )MC5与钥孔血蓝素 (KLH)的交联物经腹腔免疫Balb c小鼠 ,取脾分离mRNA .RT PCR分别扩增抗体重、轻链可变区基因片段 (VH 和VLcD NA ,大小分别约为 340bp和 32 0bp) ,二者经linkerDNA连接形成ScFv(singlechainvariablefragment)DNA(约 75 0bp) .将ScFvDNA与噬菌粒载体pCANTAB5E的连接产物转化于大肠杆菌TG1,经辅助噬菌体M13KO7感染后 ,获得重组噬菌体抗体ScFv文库 .以单抗MC5对ScFv文库进行 4轮亲和筛选后 ,随机挑取 80个克隆经酶联免疫吸附实验 (ELISA)筛选出 2 2个呈现ScFv形式抗独特型抗体(抗 IdScFv)的噬菌体单克隆 .竞争抑制实验表明 ,在 2 2个阳性克隆中有 4个克隆所呈现的抗 IdScFv属β或γ型 .针对单抗MC5的噬菌体呈现型抗 IdScFv的制备 ,为筛选新的结肠癌重组抗

噬菌体呈现技术在肿瘤研究中的应用

随着噬菌体呈现技术的日益广泛应用 ,其在肿瘤的研究中也发挥了越来越大的作用。用于生物淘筛的靶标包括肿瘤相关抗原、各种肿瘤相关生长因子、受体、酶类及肿瘤细胞、肿瘤组织血管等。通过此技术也发现了一些肿瘤组织特有的分子标识物 。

噬菌体呈现技术在生物活体组织器官筛选中的应用

噬菌体呈现技术近年来得到了广泛的应用,靶标也由纯化的抗原、抗体等发展到病毒、活细胞,尤其是以正常活体组织器官及肿瘤组织血管作为靶标的亲和筛选,在动物体内的研究取得了可喜的进展,不久的将来有望进入临床辅助诊断及靶向化疗。

用噬菌体呈现技术表达抗人红细胞血型B抗原的单链抗体

本研究的目的是构建表达抗人红细胞血型B抗原5D12杂交瘤细胞的单链抗体(ScFv)。应用重组噬菌体抗体技术，分离与构建5D12McAb单链抗体基因，将其克隆入噬粒pHEN-1中，转化E．coliTGl，M13KO7辅助噬菌体援救构建5D12噬菌体单链抗体库；用完整虹细胞亲和富集法淘选阳性重组噬菌体，重组噬菌体鉴定及序列测定分析；免疫杂交试验检测重组噬菌体单链抗体的特异性抗原活性。经M13K07援救E．coli TG1转化菌中的pHEN-1重组噬菌体，得到滴度为3×10^9pfu／m1噬菌体单链抗体库；免疫杂交试验证实表达产物保留了亲本单抗对人红细胞血型B抗原的特异性亲和力。本研究成功地构建5D12McAb单链噬菌体抗体库，为进一步研制；与特异性和高亲和力的基因工程原核血型检定抗体试剂奠定了基础。

噬菌体呈现肽库技术的应用

噬菌体呈现肽库是噬菌体显示技术的一个非常重要的分支。自问世以来,随着分子生物学技术的飞速发展,它已被广泛应用于免疫学、分子生物学、药理学、疫苗学等生命科学领域。简要概述了这一技术的应用。

噬菌体表面呈现技术在肿瘤中的应用

噬菌体表面呈现技术 (Phagedisplaytechnology)是近年来发展起来的新兴技术。目前将噬菌体表面呈现技术用于肿瘤 ,在肿瘤治疗方面取得了很大的进展 。

噬菌体表面呈现技术在肿瘤研究中的应用

噬菌体表面呈现技术 (phagedisplaytechnology )是近年来发展起来的新兴技术。目前将噬菌体表面呈现技术用于肿瘤研究与治疗 ,取得很大进展。现综述噬菌体表面呈现技术在肿瘤研究中的应用前景。

结肠癌单抗MC5的噬菌体呈现型单链可变区片段的制备

背景与目的:MC5是一种特异性良好的针对人结肠癌的鼠源性单克隆抗体,而将鼠源性抗体小型化可使其用于在体研究时引起人抗鼠抗体反应的可能性大大降低。本研究的目的是制备MC5的噬菌体呈现型单链可变区片段(ScFv)。方法:从分泌MC5的杂交瘤细胞分离mRNA,RT-PCR分别扩增抗体的重、轻链可变区DNA(VH和VLDNA),两者经linkerDNA连接形成ScFvDNA。将ScFvDNA与噬粒载体pCANTAB5E的连接产物转化于大肠杆菌TG1,经M13KO7辅助噬菌体感染后,获得重组噬菌体抗体ScFv。以高表达MC5结合抗原的细胞株SW480对重组噬菌体抗体ScFv进行两轮筛选后,随机挑取克隆经ELISA筛选呈现MC5ScFv的噬菌体单克隆,经竞争ELISA对阳性克隆结合抗原的能力进行鉴定。结果:VH、VL和ScFvDNA分别约为340bp、320bp和750bp。在随机筛检的25个克隆中得到10个呈现MC5ScFv的噬菌体单克隆,其中结合抗原能力强的克隆有3个。结论:用噬菌体呈现技术成功地制备了单抗MC5的ScFv,为拓展该抗体的应用范围奠定了基础。

噬菌体表面呈现技术及其在肾脏病中的应用

噬菌体表面呈现 (phagedisplay)技术是将外源蛋白或多肽与噬菌体壳蛋白融合并呈现于噬菌体表面。这种外源蛋白或多肽可以识别相应的结合分子而被筛选鉴定出来。本文综述了噬菌体表面显现技术的建立 ,抗体文库。

噬菌体表面呈现抗人红细胞血型A抗原单链抗体的研究

构建表达抗人红细胞血型A抗原 5 0A杂交瘤细胞的单链抗体 (ScFv)。方法 :应用重组噬菌体抗体技术 ,从5 0A杂交瘤细胞中分离、构建单链抗体基因 ,并将其克隆入噬粒pCANTAB5E中 ,转化E .coliXL Blue,辅助噬菌体援救构建 5 0A噬菌体单链抗体库 ;采用完整红细胞亲和富集法淘选阳性重组噬菌体 ,鉴定重组噬菌体并进行序列测定分析 ;免疫印迹试验检测重组单链抗体的特异性抗原活性。结果 :用M13KO7援救XL 1Blue转化菌中的pCANTAB5E重组噬菌体 ,得到滴度为 4×10 9pfu ml噬菌体单链抗体库 ;免疫印迹试验证实表达产物保留了亲本单抗对人红细胞血型A抗原的特异性亲和力。结论 :成功构建 5 0AMcAb单链噬菌体抗体库 ,为进一步研制高特异性、高亲和力的基因工程原核血型检定抗体试剂奠定了基础。

噬菌体呈现抗体库的构建及抗Fas-Fab抗体的研究

目的构建噬菌体抗体库,获得具有功能的抗FasFab噬菌体抗体。方法以Fas重组蛋白为抗原免疫Balb/c小鼠。取其脾细胞提取mRNA采用RTPCR方法扩增抗体基因,构建重链和κ链基因库,用重组Fas抗原对所构建的抗体库进行4轮筛选,并以ELISA法鉴定其功能。结果获得抗体重链Fd基因和κ链基因长度约700bp。构建的重链Fd基因为3.5×106的抗体重链基因库。构建的重链和κ链基因库的容量均为3.1×106。经VCSM13感染得到噬菌体的滴度为8.9×1016cFu/L的噬菌体抗体库,含有抗体重链和κ链基因的噬菌体占27%。用重组人Fas抗原进行4轮筛选,得到100%的富集,说明Fas重组抗原富集了抗FasFab噬菌体抗体,经ELISA检测均有抗Fas抗体的特异性。结论制备的可溶性抗FasFab抗体具有抗Fas抗体的特异性,为进一步的研究奠定了基础。

抗大肠癌噬菌体单链抗体的筛选及初步鉴定

应用 3种方法 (肿瘤细胞膜表面和胞内、裸鼠体内和组织切片 ) ,从全人源化的抗大肠癌噬菌体初级抗体库中筛选肿瘤特异性的噬菌体单链抗体 (Sc Fv) .在肿瘤细胞经过 3轮亲和选择 ,回收结合胞膜和内化进入胞内的噬菌体 ,得到抗肿瘤噬菌体单链抗体的富集倍数为 430倍 ;荷瘤裸鼠体内注入初级抗体库后 ,在不同时刻点处死裸鼠 ,回收肿瘤组织内的噬菌体 ,其回收率在 2 4 h时最高 ;初级抗体库与大肠癌组织切片亲和选择后 ,从冰冻组织切片上比从石蜡组织切片上回收得到的噬菌体高出约 1 .6倍 .从上述方法挑选单克隆 ,经 ELISA筛选抗大肠癌阳性噬菌体克隆株 ,分离得到 5个对大肠癌细胞反应较好的单克隆噬菌体单链抗体 .进一步用细胞 ELISA检测对各种肿瘤细胞的特异性反应 ,其中 4个对大肠癌细胞有很好的特异性 ,1个克隆对所有肿瘤细胞均有反应 .因此 ,3种方法用于筛选抗大肠癌噬菌体初级抗体库是有效的 ,具有推广和应用价值 .

运用噬菌体随机肽库分析系统性红斑狼疮的Sm抗原模拟表位

目的:应用噬菌体呈现技术分析系统性红斑狼疮(SLE)Sm抗原的模拟表位。方法:以鼠单克隆抗Sm抗体为筛选配基,对噬菌体随机12肽库进行3轮亲和筛选。分离10个噬菌体克隆进行Dot-ELISA和双抗体夹心ELISA鉴定。将阳性克隆进行DNA序列测定,并将混合阳性克隆与患者血清反应。结果:经3轮筛选,每轮筛选的投入与产出比逐轮升高,显示良好的富集效果。两种ELISA鉴定9个噬菌体克隆具有特异性。经过DNA测序得到6个不同的序列,推导出保守的氨基酸序列为RR/PR/IS。混合克隆诊断sLE血清的敏感性是51.72％,特异性是100.00％,结论:噬菌体呈现技术能够分析Sm抗原的模拟表位,将有利于研制表位水平的诊断试剂。

用体外致敏的鼻咽癌患者B细胞构建噬菌体抗独特型抗体库

目的 :构建噬菌体人源抗独特型抗体库。方法 :体外致敏并用EBV转化鼻咽癌患者的PBMC。用PCR分别扩增VH 和VL 基因并组成ScFv基因。将ScFv基因与载体连接后 ,转化大肠杆菌MC10 6 1,构建噬菌体呈现型ScFv库。结果 :经EBV转化的 10例鼻咽癌患者的PBMC中 ,8例有鼻咽癌抗独特型抗体产生。经多次PCR ,扩增出 5种VH(γ、μ)和 7种VL(κ、λ)基因 ,经连接组成 14种ScFv基因。将ScFv基因与载体连接后 ,导入大肠杆菌MC10 6 1。经四环素抗性筛选 ,得到库容为 1.1× 10 7的初级噬菌体抗独特型抗体库 ,噬菌体DNA中全长ScFv基因的插入率为 70 %。结论 :用体外致敏法结合噬菌体抗体库技术 ,制备人源抗独特型单链抗体(Ab2 βScFv)

从噬菌体随机肽库中初步筛选RCAS1的模拟表位

目的从噬菌体随机肽库中初步筛选表达于SiSo细胞系的受体结合癌抗原(receptorbindingcancerantigenexpressedonSiSocells,RCAS1)的模拟表位。方法用抗RCAS1单克隆抗体2211对噬菌体随机肽库进行多级亲和筛选,建立与2211具有亲和力的肽库,随机挑选阳性克隆,用双抗体夹心ELISA和斑点ELISA检测其特异性。结果经过3轮免疫筛选,阳性噬菌体克隆富集了100倍,在随机挑取的10个阳性克隆斑中,有7个克隆可与2211单克隆抗体特异性结合。结论这7个阳性克隆中可能包含了肿瘤相关抗原RCAS1的模拟表位。