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米尔比霉素肟化物ScFv噬菌体展示抗体库的构建 被引量:3
1
作者 张晓 张晴晴 +2 位作者 温爽 刘媛 刘贤进 《免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第6期688-691,共4页
目的构建具16元大环内酯共性结构小分子物质的特异性抗体库。方法免疫原MILO-BSA免疫小鼠后从脾细胞中提取总RNA,RT-PCR扩增得到全套抗体重链可变区基因(VH)及轻链可变区基因(VL),SOE-PCR将VH、VL片段拼接扩增得到单链抗体可变区基因片... 目的构建具16元大环内酯共性结构小分子物质的特异性抗体库。方法免疫原MILO-BSA免疫小鼠后从脾细胞中提取总RNA,RT-PCR扩增得到全套抗体重链可变区基因(VH)及轻链可变区基因(VL),SOE-PCR将VH、VL片段拼接扩增得到单链抗体可变区基因片段(ScFv)。将ScFv基因克隆到噬菌粒载体pCANTAB5E中,电转化感受态大肠杆菌,辅助噬菌体超感染得到上清液即为噬菌体抗体库。结果RT-PCR扩增出长360bp左右的抗体重链可变区基因(VH)及340bp左右的轻链可变区基因(VL),SOE-PCR扩增得到750bp左右的ScFv基因片段,成功构建了库容量为2.4×106,滴度为2.0×1012pfu/mL的噬菌体单链抗体库。结论构建的抗体库目的片段连接率较高,多样性较好,为下一步16元大环内酯类小分子物质高特异性抗体的筛选奠了基础。 展开更多
关键词 米尔比霉素肟化物 单链可变区抗体 噬菌体展示抗体库
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大容量人源Fab噬菌体展示抗体库的构建及抗CD276抗体筛选
2
作者 刘婕 陈俊亨 +2 位作者 徐天殊 王丽萍 赵琦 《中国医药生物技术》 2014年第4期273-277,共5页
目的构建大容量人源Fab噬菌体库,筛选并鉴定抗CD276的特异性抗体。方法通过采集10位健康成人的外周血淋巴细胞,提取总RNA,利用RT-PCR扩增人Fab抗体基因片段,插入噬菌体载体pCANTAB5H中,构建人源Fab噬菌体抗体库。通过固相化的抗原对抗... 目的构建大容量人源Fab噬菌体库,筛选并鉴定抗CD276的特异性抗体。方法通过采集10位健康成人的外周血淋巴细胞,提取总RNA,利用RT-PCR扩增人Fab抗体基因片段,插入噬菌体载体pCANTAB5H中,构建人源Fab噬菌体抗体库。通过固相化的抗原对抗体库进行3轮筛选后,随机挑取96个单克隆进行phage-ELISA鉴定,筛选出与抗原具有较强结合性的噬菌体克隆。结果成功构建库容为5×1010的噬菌体抗体库,从中筛选到11株阳性克隆,对其进行测序鉴定,表明该11株克隆的序列均一致,ELISA证实其对抗原CD276具有较强的结合性。结论构建了大容量人源Fab抗体库,从中获得具有抗CD276的人源Fab抗体片段,为进一步的研究和应用提供实验基础。 展开更多
关键词 免疫球蛋白 FAB 片段 噬菌体展示抗体库 CD276
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构建噬菌体展示抗体库过程中电穿孔法的条件优化 被引量:1
3
作者 杨丽 石晓宇 +2 位作者 李文蕾 李剑 徐寒梅 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2020年第4期42-48,共7页
目的:确定稳定且高效的电转化实验方案以达到构建高库容噬菌体展示抗体库的目的。方法:探索电压、脉冲时间、噬菌粒DNA质量与浓度、TG1大肠杆菌的生长周期、重悬洗涤缓冲液及培养基优化等方面对TG1大肠杆菌电转化效率的影响。结果:当电... 目的:确定稳定且高效的电转化实验方案以达到构建高库容噬菌体展示抗体库的目的。方法:探索电压、脉冲时间、噬菌粒DNA质量与浓度、TG1大肠杆菌的生长周期、重悬洗涤缓冲液及培养基优化等方面对TG1大肠杆菌电转化效率的影响。结果:当电转杯电极间距为2mm时,设定电转仪参数为3kV、25μF、5ms、200Ω;外源DNA经纯化后加入感受态菌液中使终浓度为1ng/μl;培养基中加入20mmol/L的MgCl2,并将TG1的生长阶段调控在OD600=0.8,用无菌超纯水重悬及洗涤细胞,将感受态细胞浓度调整为4×10^10个/ml。在上述条件下,电转化效率可达到4.9×10^9CFU/μg DNA。结论:通过多种条件优化,提高了电转化效率,为构建高库容噬菌体展示抗体库建立了基础。 展开更多
关键词 电穿孔法 电转化效率 TG1大肠杆菌 噬菌体展示抗体库
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应用全合成噬菌体抗体展示库技术实现抗膀胱癌单链抗体的定向进化 被引量:1
4
作者 张明生 何丹 +4 位作者 任永明 刘晶 林晴 晁开 黄华樑 《高技术通讯》 EI CAS CSCD 2002年第8期32-37,共6页
单链抗体在肿瘤治疗的临床应用中常会遇到两方面的问题 ,即低亲和力和鼠源性导致的免疫原性。为此 ,我们对鼠源抗膀胱癌单链抗体进行人源化改造 ,并从噬菌体抗体库中筛选具有高亲和力的人源化的单链抗体分子。运用噬菌体展示技术 ,成功... 单链抗体在肿瘤治疗的临床应用中常会遇到两方面的问题 ,即低亲和力和鼠源性导致的免疫原性。为此 ,我们对鼠源抗膀胱癌单链抗体进行人源化改造 ,并从噬菌体抗体库中筛选具有高亲和力的人源化的单链抗体分子。运用噬菌体展示技术 ,成功构建了库容为 10 6人源化的噬菌体抗体库 ,用膀胱癌细胞系膜抗原进行三轮筛选 ,得到了 展开更多
关键词 全合成噬菌体抗体展示 抗体 膀胱癌 单链抗体 定向进化 人源化 肿瘤治疗
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老年痴呆噬菌体抗体库的构建及抗Aβ肽单链抗体的筛选 被引量:1
5
作者 赵振富 苏雪莹 +3 位作者 初国良 徐杰 汪华侨 姚志彬 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第8期732-734,737,共4页
目的:构建人源性的老年痴呆(AD)噬菌体抗体库,筛选1株人源性的β-淀粉样蛋白(Aβ)特异性单链抗体(scFv)。方法:利用噬菌体展示技术,用20个AD患者的外周血B细胞首次构建了AD患者的单链可变区噬菌体抗体库。以Aβ40为靶,挑选出77个阳性抗... 目的:构建人源性的老年痴呆(AD)噬菌体抗体库,筛选1株人源性的β-淀粉样蛋白(Aβ)特异性单链抗体(scFv)。方法:利用噬菌体展示技术,用20个AD患者的外周血B细胞首次构建了AD患者的单链可变区噬菌体抗体库。以Aβ40为靶,挑选出77个阳性抗体克隆,从中筛选出一个抗AβscFv-H1,并对其重链和轻链可变区基因进行测序分析。利用预吸附实验及竞争性ELISA测定该抗体对Aβ40的特异性及结合位点。结果:成功构建出AD患者的单链可变区噬菌体抗体库,库容量为1.5×106。从库中筛选出1株抗Aβ40的单链噬菌体抗体-H1,DNA测序结果证实了其抗体的基因结构及氨基酸序列。预吸附及竞争性ELISA证实该抗体对Aβ40的结合表位位于蛋白氨基端的1到16个氨基酸内。结论:利用噬菌体抗体库技术可成功制备Aβ肽特异性scFv,为AD患者的临床诊断和被动免疫治疗提供了一种新的可供选择的途径。 展开更多
关键词 阿尔茨海默病 噬菌体展示抗体库 单链可变区抗体 Β淀粉样蛋白
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日本血吸虫未成熟卵单链抗体库的构建、筛选及初步应用 被引量:13
6
作者 何卓 汪世平 +4 位作者 肖小芹 曾少华 刘明社 李林 周帅锋 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2008年第8期921-928,共8页
运用噬菌体展示技术构建日本血吸虫未成熟虫卵可溶性抗原(SIEA)单链抗体(scFv)表达文库,以天然分子候选疫苗SIEA26~28ku为靶抗原筛选SIEA单链抗体库,获得特异性单链抗体.并将该scFv基因亚克隆至原核高效表达载体PET32a,诱导SIEA26~28k... 运用噬菌体展示技术构建日本血吸虫未成熟虫卵可溶性抗原(SIEA)单链抗体(scFv)表达文库,以天然分子候选疫苗SIEA26~28ku为靶抗原筛选SIEA单链抗体库,获得特异性单链抗体.并将该scFv基因亚克隆至原核高效表达载体PET32a,诱导SIEA26~28ku特异性scFv大量表达.随后以此为探针筛选日本血吸虫尾蚴cDNA文库,以期获得SIEA26~28ku天然分子候选疫苗相关的编码基因.结果显示,所获得的SIEA26~28ku特异性scFv,表达量高,采用该探针初步筛选出相关基因核糖体蛋白S4.SIEA26~28ku特异性scFv的获得,为进一步筛选、分析鉴定抗日本血吸虫病天然分子候选疫苗SIEA26~28ku的编码基因奠定了基础. 展开更多
关键词 日本血吸虫 未成熟虫卵可溶性抗原(SIEA) 单链抗体(scFv) 噬菌体展示抗体库 CDNA文
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β-淀粉样蛋白特异性单链抗体的制备及鉴定 被引量:6
7
作者 赵振富 苏雪莹 +3 位作者 初国良 汪华侨 徐杰 姚志彬 《免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2010年第3期215-219,共5页
目的制备1株人源性的β-淀粉样蛋白(Aβ)特异性单链抗体(scFv),并进行性能鉴定。方法利用噬菌体展示技术,用20个AD病人的外周血B细胞首次构建了AD患者的单链可变区噬菌体抗体库。以Aβ1-40为靶,挑选出77个阳性抗体克隆,从中筛选出一株抗... 目的制备1株人源性的β-淀粉样蛋白(Aβ)特异性单链抗体(scFv),并进行性能鉴定。方法利用噬菌体展示技术,用20个AD病人的外周血B细胞首次构建了AD患者的单链可变区噬菌体抗体库。以Aβ1-40为靶,挑选出77个阳性抗体克隆,从中筛选出一株抗Aβ单链抗体H1,对其重链和轻链可变区基因进行测序分析。通过表达载体pET28a(+)对目的蛋白进行大量表达,并利用Western-blot对单链抗体H1的免疫活性进行鉴定。结果成功构建出AD患者的单链可变区噬菌体抗体库,库容量为1.5×106。从库中筛选并表达出一株抗Aβ1-40的单链抗体H1,DNA测序结果证实了其抗体的基因结构及氨基酸序列。Western-blot检测证实该抗体可特异性结合Aβ1-40。结论利用噬菌体抗体库技术可成功制备Aβ肽特异性单链抗体,为AD患者的临床诊断和被动免疫治疗提供了一种新的可供选择的途径。 展开更多
关键词 阿尔茨海默病 噬菌体展示抗体库 单链可变区抗体 Β淀粉样蛋白 免疫
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具有谷胱甘肽过氧化物酶活性的含硒人源单链抗体的制备 被引量:4
8
作者 霍锐 石毅 +10 位作者 魏景艳 徐俊杰 吕绍武 闫飞 苏家明 段玉晶 王诗雯 丛登立 李唯 闫岗林 罗贵民 《高等学校化学学报》 SCIE EI CAS CSCD 北大核心 2008年第7期1379-1383,共5页
以谷胱甘肽(GSH)为靶抗原,从噬菌体展示人源单链抗体库中筛选人源单链抗体(scFv).经3轮筛选后,用ELISA方法检测出5个(2,11,16,24,32)可以和GSH结合的克隆.PCR产物的电泳和测序结果表明,只有3个克隆(11,16,24)具有完整的scFv编码基因.选... 以谷胱甘肽(GSH)为靶抗原,从噬菌体展示人源单链抗体库中筛选人源单链抗体(scFv).经3轮筛选后,用ELISA方法检测出5个(2,11,16,24,32)可以和GSH结合的克隆.PCR产物的电泳和测序结果表明,只有3个克隆(11,16,24)具有完整的scFv编码基因.选取和GSH结合力高的克隆11的scFv编码基因组装到表达载体pPELB上,在大肠杆菌Rosetta中进行可溶性表达,用Ni2+螯合亲和层析纯化scFv-11,免疫点印迹结果证实该抗体能与GSH特异结合.通过化学突变将scFv-11的丝氨酸转变成硒代半胱氨酸(Sec)后,获得了具有谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)活力的含硒(Se)人源单链抗体(Se-scFv-11),其活力为351U/μmol. 展开更多
关键词 人源单链抗体 噬菌体展示抗体库 谷胱甘肽过氧化物酶 化学突变
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人源抗C3d单链抗体的筛选与鉴定
9
作者 赵信平 杜昕颖 +9 位作者 徐银凤 韩冬 赵江云 郭卫光 谢靖 李环 董灏 刘肖 杜鹏 贾雷立 《国际药学研究杂志》 CAS 北大核心 2020年第9期750-755,共6页
目的从噬菌体展示单链抗体库中筛选获得人源抗人C3d单链抗体,并评价其结合活性。方法以人C3d重组蛋白包被免疫管,对噬菌体展示单链抗体库进行固相筛选;C3d包被量逐轮降低,洗涤强度逐轮增强。采用ELISA对筛选产出进行鉴定,选择阳性克隆,... 目的从噬菌体展示单链抗体库中筛选获得人源抗人C3d单链抗体,并评价其结合活性。方法以人C3d重组蛋白包被免疫管,对噬菌体展示单链抗体库进行固相筛选;C3d包被量逐轮降低,洗涤强度逐轮增强。采用ELISA对筛选产出进行鉴定,选择阳性克隆,测序确定阳性单链抗体基因。分子克隆构建单链抗体的真核表达载体,转染HEK293-F细胞进行真核表达,镍柱亲和纯化获得单链抗体。采用生物膜干涉技术(BLI)检测单链抗体与重组人C3d的结合活性。结果经3轮筛选获得3个特异性结合C3d的噬菌体单链抗体(A1、A3和B6),重组表达获得高纯度的单链抗体蛋白,与C3d重组蛋白结合活性为22.7~171 pmol/L。结论获得了全新的高亲和力人源抗人C3d单链抗体。 展开更多
关键词 噬菌体展示抗体库 单链抗体 C3D 亲和力
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人噬菌体抗体库的构建及人源性IL-17单链抗体的筛选
10
作者 钮敏红 闫晓霏 +1 位作者 吕卫东 万晓春 《中国临床研究》 CAS 2016年第5期687-690,共4页
目的通过噬菌体展示技术构建人源单链抗体库,筛选抗IL-17的特异性抗体并鉴定。方法通过采集35位类风湿关节炎患者的外周血淋巴细胞,提取总RNA,逆转录合成c DNA,PCR扩增人H链和L链可变区抗体基因。利用SOE-PCR法将VH和VL片段拼接成Sc Fv... 目的通过噬菌体展示技术构建人源单链抗体库,筛选抗IL-17的特异性抗体并鉴定。方法通过采集35位类风湿关节炎患者的外周血淋巴细胞,提取总RNA,逆转录合成c DNA,PCR扩增人H链和L链可变区抗体基因。利用SOE-PCR法将VH和VL片段拼接成Sc Fv片段并插入噬菌体载体p CANTAB5E中,构建人源噬菌体单链抗体库。通过固相化的抗原对抗体库进行3轮筛选后,挑取单克隆进行phage-ELISA鉴定,筛选与抗原具有较强结合性的噬菌体克隆。结果成功构建库容为3.5×10~8的噬菌体抗体库,从中筛选到5株阳性克隆,ELISA证实其对抗原IL-17具有较强的结合性及中和活性。结论成功构建了人源噬菌体单链抗体库,从中获得具有抗IL-17的人源Sc Fv抗体片段,为进一步的研究和应用提供实验基础。 展开更多
关键词 白细胞介素-17 噬菌体展示抗体库 单链抗体 类风湿关节炎
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抗HER-2纳米抗体的筛选、表达及功能鉴定
11
作者 王丽燕 李艳宁 +4 位作者 王红霞 蒋丹 张艳婷 张爱君 徐广贤 《宁夏医科大学学报》 2022年第6期616-621,629,共7页
目的筛选获取抗HER-2纳米抗体序列,偶联人IgG1 Fc片段,采用原核表达系统表达重组抗HER-2纳米抗体并验证其生物学特征。方法基于天然噬菌体纳米抗体展示库,采用生物素-链霉亲和素液相筛选法,以生物素化HER-2抗原为靶点经三轮淘选,随机挑... 目的筛选获取抗HER-2纳米抗体序列,偶联人IgG1 Fc片段,采用原核表达系统表达重组抗HER-2纳米抗体并验证其生物学特征。方法基于天然噬菌体纳米抗体展示库,采用生物素-链霉亲和素液相筛选法,以生物素化HER-2抗原为靶点经三轮淘选,随机挑取单克隆进行ELISA鉴定并测序。获得抗HER-2纳米抗体序列,将其偶联人IgG1 Fc片段,并将重组抗HER-2纳米抗体序列克隆至原核表达载体pET-30a,转化至表达菌Arctic Express,诱导重组抗HER-2纳米抗体表达并纯化,采用SPR、Western blot、细胞免疫荧光对纯化后的重组抗HER-2纳米抗体特征和功能进行验证。结果经淘选获得了一条抗HER-2纳米抗体序列,与人IgG1 Fc片段偶联,成功构建了原核表达载体,并表达纯化获得的重组抗HER-2纳米抗体;SPR显示其亲和力较好,Western blot表明其可与HER-2抗原结合,细胞免疫荧光实验结果提示其可与人乳腺癌细胞SKBR-3结合。结论本实验获得了亲和力、特异性均良好且具有一定生物学功能的重组抗HER-2纳米抗体,可为其后续临床应用提供基础。 展开更多
关键词 纳米抗体 人表皮生长因子受体-2 噬菌体纳米抗体展示
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利用噬菌体展示技术制备人血管生成素2单链抗体 被引量:2
12
作者 张中林 艾勇彪 +3 位作者 张吉发 袁玉蜂 刘志苏 何跃明 《中华实验外科杂志》 CAS CSCD 北大核心 2012年第11期2159-2161,共3页
目的用纯化的人血管生成素2(Ang2)蛋白,通过噬菌体展示技术从非免疫小鼠噬菌体展示抗体库中淘选、鉴定Ang2单链抗体。方法以纯化的人Ang2蛋白为抗原,对非免疫小鼠噬菌体展示抗体库进行富集和筛选,获得Ang2单链抗体,利用十二烷基... 目的用纯化的人血管生成素2(Ang2)蛋白,通过噬菌体展示技术从非免疫小鼠噬菌体展示抗体库中淘选、鉴定Ang2单链抗体。方法以纯化的人Ang2蛋白为抗原,对非免疫小鼠噬菌体展示抗体库进行富集和筛选,获得Ang2单链抗体,利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Westernblot法检测目的蛋白的表达并测序。结果经过3轮富集和筛选,获得了1个能特异性识别Ang2蛋白的阳性噬菌体克隆,DNA测序表明其含有完整的单链抗体基因片段,大小约750bp,表达蛋白相对分子质量约33.7×10^3;通过SDS-PAGE进一步实现Ang2单链抗体(phage-Ang2-scFv)的鉴定。结论成功分离并鉴定人Ang2-scFv,为进一步的功能学研究奠定了基础。 展开更多
关键词 血管生成素2 噬菌体抗体展示 单链抗体
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Sj-UV-致弱尾蚴单链抗体库的构建及筛选
13
作者 周帅锋 汪世平 +2 位作者 何卓 李林 高冬梅 《热带医学杂志》 CAS 2010年第8期907-914,917,共9页
目的构建和鉴定日本血吸虫(Schistosoma japonicum,Sj)紫外线(UV)-照射致弱尾蚴单链抗体(single chain Fv,ScFv)表达文库,并以此作为高通量的库源筛选出针对有潜在保护力的Sj尾蚴66-68 kDa抗原(Schistosoma japonicum cercariae antigen... 目的构建和鉴定日本血吸虫(Schistosoma japonicum,Sj)紫外线(UV)-照射致弱尾蚴单链抗体(single chain Fv,ScFv)表达文库,并以此作为高通量的库源筛选出针对有潜在保护力的Sj尾蚴66-68 kDa抗原(Schistosoma japonicum cercariae antigen 66-68kDa,SCA66-68kDa)的单链抗体。方法选择最佳紫外灯照射条件,构建UV-致弱尾蚴小鼠模型,通过其血清被动转移实验证实其是否具有抗血吸虫攻击感染的保护效果;随后提取该小鼠脾脏mRNA,利用噬菌体展示技术构建UV-照射致弱尾蚴单链抗体库,并从库容量、多样性等方面进行鉴定;运用直接菌落挖集法以SjSCA66-68kDa筛选该抗体库,获得阳性克隆进行蛋白表达,再与SCA进行反应,验证其与SjSCA66-68kDa反应的特异性。结果构建UV-致弱尾蚴动物模型中的血清转移至小鼠体内得到42.5%的减虫率,显著高于日本血吸虫感染血清转移组的减虫率(28.0%);日本血吸虫UV-致弱尾蚴单链抗体库的库容量测定为1.9×108,重组率为100%;运用抗原直接菌落挖集法筛选共获得6个SCA66-68kDa阳性克隆,经SDS-PAGE、Western-blot分析结果显示可溶性ScFv获得了正确表达,且与相应抗原SjSCA66-68kDa特异性结合,证实成功获得了特异性抗SjSCA66-68kDa单链抗体。结论成功构建了高效日本血吸虫UV-致弱尾蚴单链抗体库,从该库筛选共获得6个阳性克隆,均能诱导表达SjSCA66-68kDa特异性可溶性单链抗体。 展开更多
关键词 日本血吸虫 致弱尾蚴 被动转移 单链抗体 噬菌体展示抗体库 菌落挖掘法
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Construction and diversity analysis of a murine IgEphage surface display library
14
作者 LIZONGDONG MINGYEH 《Cell Research》 SCIE CAS CSCD 1997年第2期161-170,共10页
To make further investigation of the IgE antibodyrepertoire in Trichosanthin (TCS) allergic responses, amurine IgE phage surface display library was constructed(3.0×105 independent clones). We first constructed t... To make further investigation of the IgE antibodyrepertoire in Trichosanthin (TCS) allergic responses, amurine IgE phage surface display library was constructed(3.0×105 independent clones). We first constructed theVe cDNA library (4.6×105 independent clones) and VκcDNA library (3.0×105 independent clones). Then, theVε and Vκ gene segments were amplified from both libraries by PCR respectively, and assembled into Fab fragment by SOE PCR. The phage library containing Fabs wasthus constructed. The diversity of Vε from this library wasanalyzed and proved. Fab clones with high specificity toTCS have been screened out. 展开更多
关键词 Phage surface display library trichosanthin murine IgE antibody
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