噬菌体技术在水污染控制中的应用

污水处理过程中伴有大量的微生物,不但对人类健康造成了巨大的危害,对污水处理系统的运行也有着严重的影响。多重耐药性细菌在污水中的出现导致了介水传染病的爆发,物理法、化学法等处理手段存在着着价格昂贵、效果欠佳的问题。噬菌体是自然界中数量最多和分布最广的病毒。噬菌体通过特定的感染和裂解影响细菌群落,在消灭细菌上具有专一性强、指数增殖等特点,可作为污水处理中的一种生物控制技术。介绍噬菌体的生物学特性,并对噬菌体技术在水污染控制中的应用进行了阐述与分析,论述了噬菌体技术在水污染控制中的现状及应用前景。

利用噬菌体展示技术筛选草鱼呼肠孤病毒VP39蛋白相互作用多肽

VP39是草鱼呼肠孤Ⅲ型病毒(GCRV GenotypeⅢ,GCRV-Ⅲ)S9基因编码的蛋白,为研究VP39蛋白在GCRV-Ⅲ感染草鱼细胞过程中行使的生物学功能,将克隆VP39基因序列并构建原核表达载体pET32a-VP39,通过原核表达得到VP39-HIS融合蛋白;利用VP39蛋白溶液免疫小鼠,制备鼠抗VP39多克隆抗体,通过Western Blot对抗体进行评估;利用制备的多克隆抗体探究GCRV-Ⅲ感染细胞过程中VP39蛋白表达动力学;利用噬菌体展示技术筛选与VP39蛋白特异性结合的多肽序列并进行分析。SDS-PAGE电泳结果显示,VP39-HIS融合蛋白可良好溶于PBS中,蛋白大小约为39 kD;Western Blot检测表明实验所制备的VP39多克隆抗体在1﹕10000稀释比例下,既能识别原核表达的VP39-HIS融合蛋白,也能识别GCRV-Ⅲ感染CIK细胞后表达的VP39蛋白,具有良好的效价与特异性;在病毒侵染过程中,VP39前期表达量较少,在中后期大量表达;噬菌体展示技术筛选出两条多肽与VP39蛋白有高度亲和性,经过在NCBI上比对后发现草鱼基因组中有7个基因与筛出的多肽具有同源性,表明其可能与VP39存在相互作用。研究制备了鼠抗VP39多克隆抗体,为GCRV-Ⅲ的免疫学检测方法提供了新的路径;结合多肽的筛选也为VP39在GCRV-Ⅲ侵染过程中参与的生物学功能研究奠定了基础。

噬菌体展示技术筛选羊小肠上皮细胞穿透肽

为解决抗菌药物不能穿透细胞膜杀伤胞内致病菌的问题,本试验以羊小肠(空肠段)上皮细胞为靶细胞,利用噬菌体展示技术4轮体外生物淘洗,系统地筛选羊小肠上皮细胞的特异性穿透肽,将其作为抗菌肽的载体从而提高抗菌肽的穿透能力。试验采用噬菌体展示技术,经过4轮体外生物淘洗,得到了能与羊小肠上皮细胞结合的多肽;4轮减数筛选后,噬菌体的回收率逐渐提高,特异性的噬菌体克隆得到了有效富集,酶联免疫吸附法(ELISA)测定单克隆噬菌体对羊小肠上皮细胞的亲和力,亲和力≥2的为阳性,筛选阳性噬菌体克隆,提取DNA进行测序,选择高重复率序列,合成细胞穿透肽,同时合成与细胞穿透肽的氨基酸序列及结构相同但组合顺序不同的对照多肽,并与异硫氰酸荧光素(FITC)标签连接。用细胞增殖/毒性检测试剂盒(CCK8)测定细胞穿透肽和对照肽对细胞活力的影响,用荧光显微镜初步观察穿透肽的穿透性,用激光共聚焦显微镜及流式细胞仪检测穿透肽在胞内的定位及穿透强度。结果表明:经4轮体外减数筛选噬菌体的回收率增长了226倍,随着第1轮至第4轮筛选轮次增加,与羊小肠上皮细胞结合的噬菌体依次增加;使用ELISA进行检测,结果显示,在随机挑选的30个单克隆噬菌体中,22个检测为阳性克隆(亲合力≥2);提取阳性克隆噬菌体进行DNA测序分析后,得到2条重复率高的氨基酸序列,VLNSLID命名为SCPP1,HSTTAQF命名为SCPP2;细胞活力结果表明,在浓度低于256μmol/mL时2条细胞穿透肽及其对照多肽的细胞活力仍在90%以上,表明对细胞无毒;荧光显微镜下观察及激光共聚焦结果表明,SCPP1和SCPP2可以特异性穿透羊小肠上皮细胞膜,且SCPP1可以穿透细胞核表现出比SCPP2更强的穿透性,2条对照多肽无穿透能力;流式细胞仪结果显示,SCPP1的胞内平均荧光强度明显高于SCPP2,且呈时间剂量依赖。本试验筛选出了安全可特异性穿透羊小肠上皮细胞的穿透肽(SCPP1),可作为治疗羊肠道胞内菌的抗菌肽的载体。

噬菌体展示技术筛选猪小肠上皮细胞穿透肽

为辅助抗菌药物进入动物细胞杀伤胞内致病菌,本试验利用噬菌体展示技术筛选猪小肠上皮细胞的穿透肽。通过噬菌体展示技术进行4轮体外生物淘洗,得到与猪小肠上皮细胞结合的多肽;经过4轮减数筛选,噬菌体回收率逐渐提高,酶联免疫吸附法(ELISA)测定单克隆噬菌体对猪小肠上皮细胞的亲和力,亲和力≥2的为阳性,将阳性噬菌体克隆提取DNA,将高重复率序列合成细胞穿透肽,同时合成与其氨基酸序列及结构相同但组合顺序不同的对照多肽,荧光FITC标签连接。检测多肽的抑菌活性、溶血活性和细胞毒性,荧光显微镜观察穿透肽的穿透性、激光共聚焦显微镜及流式细胞仪检测穿透肽在胞内的定位及强度。结果表明:4轮筛选噬菌体的回收率增长283倍;ELISA检测显示,随机挑选30个单克隆噬菌体,17个为阳性克隆;DNA测序得到2条高重复序列,SAYKMMA命名ICPP1和SSSISGL命名ICPP2;穿透肽及对照多肽无抑菌活性,溶血性较好,安全无毒对细胞活力无影响;荧光显微镜观察及激光共聚焦结果表明,ICPP1和ICPP2可穿透猪小肠上皮细胞膜,且ICPP1表现出更强的穿透性;流式细胞仪结果显示,ICPP1的胞内平均荧光强度明显高于ICPP2,且呈时间剂量依赖,有较好的热稳定性和较低的血清稳定性。本试验筛选出了安全可穿透猪小肠上皮细胞的穿透肽(ICPP1),可作为治疗猪肠道胞内菌的抗菌肽的载体。

基于噬菌体展示技术筛选抑制素α亚基特异性纳米抗体

【目的】通过噬菌体展示技术构建抗抑制素α亚基(INHα)纳米抗体文库,并筛选出针对绵羊INHα的特异性纳米抗体,以期制备出新型抑制素免疫制剂,为提高绵羊外周血促卵泡素(FSH)水平和排卵率做前期准备。【方法】利用pET32a-INHA原核表达载体诱导表达INHα蛋白,并对诱导表达的INHα蛋白进行SDS-PAGE和Western blotting鉴定;用Ni琼脂糖凝胶纯化后的INHα蛋白免疫新疆双峰驼。通过巢式PCR扩增制备骆驼噬菌体展示纳米抗体文库,通过三轮免疫亲和淘选及噬菌体ELISA从该文库中富集和筛选INHα特异性纳米抗体,并通过测序得知纳米抗体的基因序列;用蛋白-蛋白模拟对接初步鉴定该纳米抗体与INHα蛋白的亲和性。【结果】通过原核诱导表达及Ni琼脂糖凝胶纯化得到了大小为36 ku的INHα重组蛋白,通过Western blotting检测到约36 ku的蛋白条带;双峰驼通过6次INHα蛋白免疫抗体效价达到1∶1024000;通过巢式PCR获得了400 bp左右的VHH基因,通过电转化等试验构建了库容量为1.05×10^(12)CFU的纳米抗体文库,文库阳性率为94%;通过三轮免疫亲和淘选获得3.0×10^(8)CFU的抗INHα纳米抗体文库,利用噬菌体ELISA获得了4株(VHH-4、VHH-29、VHH-89、VHH-108)INHα特异性纳米抗体,且4株INHα特异性纳米抗体基因序列相似度为80.31%;通过蛋白-蛋白模拟对接鉴定发现4株纳米抗体均与INHα具有较强的亲和性。此外,VHH-4与INHα的总自由能为-576.28 kJ/mol,是4种VHH中的最佳抗体。【结论】成功构建了抗INHα纳米抗体库,并从该库中获取了VHH-4、VHH-29、VHH-89和VHH-1084株INHα特异性纳米抗体。本研究结果可为纳米抗体在生殖免疫学中的应用提供参考。

噬菌体展示技术在全人源性抗体发现中的应用

噬菌体展示技术是目前应用最广泛的体外抗体筛选技术,它以噬菌体为载体,将外源抗体库基因插入到噬菌体衣壳蛋白基因中,在噬菌体表面表达衣壳蛋白的同时也展示了抗体分子。抗体药物因靶向优势在肿瘤免疫和病原生物感染中都发挥着重要作用,是其成为医药研发领域热点的重要推动力。因此,本文对噬菌体展示技术的研发背景、基本原理、抗体库构建类型及抗体展示片段类型进行综述,并对基于噬菌体展示的全人源性抗体的最新进展和应用前景进行了展望。

噬菌体表面呈现技术研究进展

噬菌体表面呈现技术是1985年建立的一种将外源基因表达呈现在噬菌体颗粒表面的方法,可用于建立随机多肽文库、抗体文库等。经特定配基的筛选,可获得与其特异结合的配体分子。通过改构,还可将cDNA产物表达于噬菌体颗粒的尾部构建cDNA文库。SIP技术通过将配体和配基分别与基因Ⅲ蛋白的C末端和N末端融合表达,基因Ⅲ的C-末端参与噬菌体颗粒的组装,配基与配体的结合能够重建基因Ⅲ蛋白的功能,才能形成有感染能力的噬菌体,这样就大大提高了筛选效率。

应用噬菌体展示技术筛选乙型肝炎病毒表面抗原基因启动子Ⅱ结合蛋白

目的 通过筛选乙型肝炎病毒 (HBV)表面抗原基因启动子Ⅱ(SPⅡ)结合蛋白 ,为HBV复制机制的研究探索新的途径。方法 应用噬菌体展示技术 ,以HBV的表面抗原基因启动子Ⅱ的聚合酶链反应 (PCR)产物DNA作为固相筛选分子 ,对噬菌体人肝细胞cDNA文库进行 5轮“吸附 洗脱 扩增”筛选过程 ,经噬斑的PCR扩增后 ,构建克隆载体 ,最后对所筛选克隆进行DNA序列测定和同源性分析。结果 噬菌体经富集后 ,从随机筛选的 2 0个克隆中得到 4个阳性克隆 ,成功构建了克隆载体。序列测定后经过同源性分析 ,确定了和HBVSPⅡ结合的肝细胞蛋白———尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶 4 (NADHDH4 )。结论 用噬菌体人肝cDNA文库筛选得到了HBVSPⅡ的结合蛋白 ,分析了该蛋白的编码基因 ,为进一步研究HBV的复制、转录、调节机制开辟了新的途径。

应用噬菌体展示技术筛选乙型肝炎病毒核心启动子结合蛋白

目的 通过筛选乙型肝炎病毒 (HBV)核心启动子 (corepromoter)结合蛋白 ,为HBV复制机制的研究探索新的途径。方法 应用噬菌体表面展示技术 ,以HBV核心启动子的聚合酶链反应产物作为固相筛选分子 ,对噬菌体人肝细胞cDNA文库进行 5轮“吸附 洗脱 扩增”的筛选过程 ,经噬斑的PCR扩增后 ,构建克隆载体 ,最后对所筛选克隆进行DNA序列分析和同源性搜索。结果 噬菌体经富集后 ,从随机筛选的 2 0个克隆中得到 6个阳性克隆 ,成功构建了克隆载体。序列测定后经过同源性搜索 ,确定了和HBV核心启动子结合的肝细胞蛋白———羧肽酶N(CPN)。结论 用噬菌体人肝cDNA文库筛选得到HBV核心启动子的结合蛋白 ,分析了该蛋白的编码基因 ,为进一步研究HBV的复制机制创造了新的途径。

噬菌体展示技术及其应用

噬菌体展示技术是一项新兴的分子生物学技术;该技术将基因型和表现型有效地联系起来,是后基因组时代的有力工具。目前用于构建展示文库的噬菌体主要有丝状噬菌体、λ噬菌体、T4噬菌体和T7噬菌体;它们所展示的外源蛋白可以保持相对独立的空间结构和生物活性。随着此项技术的不断完善和发展,噬菌体展示技术已在新型疫苗的研制、酶抑制剂的筛选、医学诊断和治疗、多肽药物的开发、蛋白质相互作用的研究等领域得到了广泛的应用,并显示了良好的应用前景。

噬菌体表面展示技术筛选乙型肝炎病毒前S1蛋白结合蛋白基因

目的 以乙型肝炎病毒 (HBV)前S1蛋白为靶蛋白 ,寻找其相应的结合蛋白。方法 应用T7cDNA文库噬菌体展示技术克隆与前S1蛋白具有结合作用的蛋白序列 ,命名为前S1结合蛋白 (PreS1BP)。将推断的氨基酸序列在蛋白质库中进行搜索 ,自GenBank中获得结合蛋白的cDNA和基因组的全长序列。结果 初步确定PreS1BP即为神经胶质瘤抑制基因区候选基因 2 (GLTSCR2 ) ,cDNA长为14 36核苷酸 ,基因位于第 19号染色体长臂 13.3区 (19q13 3) ,长度 114 4 5碱基对 (bp) ,位于 19号染色体 10 4 0 3483～10 4 14 989,PreS1BP基因含有 13个外显子 ,具有 12个内含子。结论 应用T7cDNA文库噬菌体展示技术和生物信息学方法获得了HBVPreS1BP基因。

噬菌体展示技术定位主要食物过敏原表位的研究进展

噬菌体展示技术是一项可以在噬菌体颗粒的表面展示外源多肽的体外筛选技术。由于该技术实现了基因和蛋白质的体外统一,现已被广泛应用于生命科学和医学等领域。目前噬菌体展示系统主要有丝状噬菌体展示系统、λ噬菌体展示系统、T4噬菌体展示系统和T7噬菌体展示系统。本文主要介绍了噬菌体展示技术以及该技术在八类食物抗原表位分析的应用。

噬菌体展示技术及其在天牛防治中的应用展望

本文综述了噬菌体展示技术的研究现状和发展趋势 ,着重描述了噬菌体展示技术的筛选方法及其在生命科学研究领域的广泛应用 ,结合目前我国天牛防治存在的问题 。

噬菌体显示技术用于抗体表位的筛选

利用噬菌体随机肽库筛选抗ＴＮＦ单抗表位的研究中，就抗体的选择、肽库富集的检测、筛选得到的表位多肽的验证及如何提高筛选的成功率等，进行了一些初步探索．实验结果表明，由识别线性抗原位点的抗体较容易筛选到噬菌体呈现表位，具有较强中和活性的抗体，因多识别空间构型抗原位点而增加筛选难度．ＮＣ膜斑点印迹、ＥＬＩＳＡ及ＤＮＡ测序均可作为筛选富集的检测方法．用与天然抗原同源比较的方法及竞争性ＥＬＩＳＡ分析。

用T7噬菌体展示技术筛选乙型肝炎病毒PreS1相互作用蛋白

目的:用T7噬菌体筛选系统筛选乙型肝炎病毒PreS1的相互作用蛋白。方法:应用T7噬菌体展示技术,以通过原核表达的方式得到的乙型肝炎病毒PreS1作为靶分子,对噬菌体人肝细胞cDNA文库进行生物筛选,对筛选到的克隆进行DNA序列分析及同源性搜索。结果:经鉴定得到1个阳性克隆,确定了能与乙型肝炎病毒PreS1相互作用的蛋白可能为:细胞色素C氧化酶1(Cytochrome c Oxidase Subunit I,COX1)。结论:T7噬菌体展示筛选系统是筛选相互作用蛋白的一种简单、快速和有效的手段,筛选到的相互作用蛋白为进一步探讨PreS1的致病机制提供重要依据。

噬菌体抗体库技术:靠近理想的现实

噬菌体抗体库技术是近年来在基因工程抗体研究领域中发展起来的一项新技术 ,该技术把特异性结合和高效筛选有机结合 ,大大缩减了获得目的性抗体的工作量。本文综述了噬菌体抗体库的构建 ,种类 ,筛选方法及最新进展。

应用噬菌体展示技术筛选中药的药物靶点蛋白研究进展

噬菌体展示技术是一种有效的药物靶点筛选工具,可用其筛选中药的药物靶点蛋白。其原理是将外源性蛋白或多肽的DNA序列插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置,使外源基因随外壳蛋白的表达而表达。药物靶点是药物在体内的作用结合位点,是药物筛选和新药研究的基础,良好的药物靶点也是发现性质优良药物的基础。利用现代生物技术为基础的高通量药物筛选技术,进行中药活性组分筛选是实现中药现代化的有效途径,并促进我国天然药物的开发和应用,为中药的研究提供一套完整的筛选和验证方案。

用T7噬菌体展示技术筛选HCV核心蛋白的相互作用蛋白

目的用T7噬菌体筛选系统筛选HCV核心蛋白的相互作用蛋白。方法应用T7噬菌体展示技术,以通过原核表达的方式得到HCV的核心蛋白作为靶分子,对噬菌体人肝细胞cDNA文库进行筛选,对筛选到的克隆进行DNA序列分析及同源性搜索。结果经鉴定得到1个阳性克隆,确定了能与HCV核心蛋白相互作用的蛋白为:Smad interacting-protein 1(SIP1)。结论T7噬菌体展示筛选系统是筛选相互作用蛋白的一种简单、快速和有效的手段,筛选到的相互作用蛋白为进一步探讨核心蛋白的致病、致癌机制提供重要依据。

噬菌体展示技术在食品安全分析中的应用

随着噬菌体展示技术的发展,其在食品安全领域的应用也越来越多,该技术可以作为一种高效的抗体制备技术应用于食品中常见的抗生素、生物毒素、有害小分子的检测及食源性致病菌控制,同时可以开发有毒待检物的替代品建立绿色检测技术。此外,噬菌体展示技术在新型食品防腐剂开发等方面也具有广阔的应用前景。本文在介绍噬菌体展示技术的基础上,对其在食品安全领域的应用进行了综述。

噬菌体抗体库技术应用研究进展

噬菌体抗体库技术是近几年发展的一项分子生物学技术,是迄今发展最成熟、应用最广泛的制备抗体的技术。它是一种将PCR技术和噬菌体展示技术相结合,并在噬菌体表面表达、分泌,经过筛选后获得特异性抗体的技术。就噬菌体抗体库技术的原理、构建、筛选及其应用研究进展进行综述。