前列腺特异性膜抗原(PSMA)纳米抗体基因的原核表达及天然噬菌体纳米抗体库筛选

目的筛选出抗前列腺特异性膜抗原(PSMA)的纳米抗体。方法利用天然噬菌体纳米抗体库,以PSMA为靶抗原进行三轮的淘选,采用ELISA鉴定阳性克隆,并进行测序分析,将筛选到的阳性克隆基因序列插入pET28a原核表达载体中,并转化至大肠杆菌BL21中,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白的表达,利用Ni柱进行亲和纯化,通过SDS-PAGE验证纯化产物。结果筛选获得4条PSMA纳米抗体序列重链可变区1(VHH1)、VHH2、VHH3、VHH4,VHH1序列未能获得明确的原核表达蛋白,VHH2、VHH3、VHH4蛋白均表达。纯化后获得了纯度高、相对分子质量(Mr)约为17000的抗PSMA纳米抗体。结论通过天然噬菌体纳米抗体库淘筛,成功获得抗PSMA的纳米抗体序列并进行了原核表达和纯化。

羊驼噬菌体展示纳米抗体库中 Le^(a) 模拟抗原表位筛选与鉴定的初步研究

目的:建立一种新型Lewis血型抗原的合成方法,即利用羊驼噬菌体展示纳米抗体库筛选Lewis血型抗原的模拟表位,并将模拟表位序列进行生物合成。方法:用单克隆抗Lewis a(Le^(a))抗体亲和淘选羊驼噬菌体展示纳米抗体文库来选择Le^(a)抗原的模拟表位。利用酶联免疫吸附试验(ELISA)对阳性克隆菌与筛选原Le^(a)单克隆抗体的亲和力进行检测,选择高亲和力的阳性克隆菌进行测序,并对最终确定的序列进行表达合成。最后通过ELISA法对合成后的Le^(a)模拟抗原进行灵敏度、特异度以及临床样本的验证。结果:随机挑取96个噬菌体克隆,有24个阳性克隆,并选取亲和力最强的前14个噬菌体克隆进行测序,结果显示有5个不同序列,选取出现频率最高、差异最大、亲和力最高的3条序列进行表达合成。利用ELISA法检测筛选得到的Le^(a)模拟抗原的灵敏度及特异性,发现微柱凝胶法与ELISA法的最低检出限相差25倍,且Le^(a)模拟抗原与其他5种单抗(anti-A,anti-B,anti-P1,anti-M,anti-N)没有交叉反应(P<0.001)。最后,检测了30例临床血浆样本(15例Le^(a+),15例Le^(a-)),结果显示,15例阳性血浆样本的吸光度的均值高于阴性血浆样本,且具有统计学差异(P=0.02),但临床样本的阳性信号值远低于单抗的阳性信号值。结论:初步建立了利用羊驼噬菌体纳米抗体库筛选Le^(a)模拟抗原的方法,有望实现Le^(a)模拟抗原表位的筛选,从而实现ELISA、化学发光等高灵敏度检测方法在血型抗体鉴定方面的应用。

抗HER-2纳米抗体的筛选、表达及功能鉴定

目的筛选获取抗HER-2纳米抗体序列,偶联人IgG1 Fc片段,采用原核表达系统表达重组抗HER-2纳米抗体并验证其生物学特征。方法基于天然噬菌体纳米抗体展示库,采用生物素-链霉亲和素液相筛选法,以生物素化HER-2抗原为靶点经三轮淘选,随机挑取单克隆进行ELISA鉴定并测序。获得抗HER-2纳米抗体序列,将其偶联人IgG1 Fc片段,并将重组抗HER-2纳米抗体序列克隆至原核表达载体pET-30a,转化至表达菌Arctic Express,诱导重组抗HER-2纳米抗体表达并纯化,采用SPR、Western blot、细胞免疫荧光对纯化后的重组抗HER-2纳米抗体特征和功能进行验证。结果经淘选获得了一条抗HER-2纳米抗体序列,与人IgG1 Fc片段偶联,成功构建了原核表达载体,并表达纯化获得的重组抗HER-2纳米抗体;SPR显示其亲和力较好,Western blot表明其可与HER-2抗原结合,细胞免疫荧光实验结果提示其可与人乳腺癌细胞SKBR-3结合。结论本实验获得了亲和力、特异性均良好且具有一定生物学功能的重组抗HER-2纳米抗体,可为其后续临床应用提供基础。