分枝杆菌噬菌体DNAⅢ的遗传学信息及抗结核潜力初步研究

目的了解分枝杆菌噬菌体DNAⅢ的遗传学信息,初步探索其在抗结核治疗中的应用潜力。方法试剂盒提取噬菌体DNA,鸟枪法测序,Phred/Phrad/Consed软件包组装、拼接重叠群,PCR扩增连接重叠群缺口。通过DNAStar软件包中的EditSeq软件、Glimmer 3.0基因预测软件、共线性分析及构建DNAⅢ的系统发育树等对DNAⅢ基因组的遗传学信息进行分析。检测DNAⅢ对理化因素的抵抗力并行体外抗结核菌实验。结果 DNAⅢ基因组是含39 520 bp的线性双链DNA,G+C含量是66.83%,不含tRNA和串联重复序列;DNAⅢ有60个基因,gene 32编码整合酶,但未发现编码阻遏蛋白的基因;DNAⅢ与Angel和BPs核苷酸序列相似度高,且具有清晰的共线性;与DNAⅢ关系最近的是Liefie。DNAⅢ对温度、乙醇及酸碱度均敏感;抗结核菌实验第1、2、3天的DNAⅢ组结核菌数量与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 DNAⅢ是一株能有效杀灭结核菌的G簇烈性分枝杆菌噬菌体。

λ噬菌体DNA的快速提取法

从ｃＤＮＡ文库中筛选目的片段是获得新基因的常用和可靠手段。由于具有能扩增和长期保存不失活的优点，目前一般用λ噬菌体ＤＮＡ来作为ｃＤＮＡ文库载体。因此提取λ噬菌体ＤＮＡ便成为鉴定ｃＤＮＡ文库重组效率和获得目的片段的必由之路。通常提取λ噬菌体ＤＮＡ采用２...

分枝杆菌噬菌体DNAⅢ生物学特性及其抗耐药结核潜力

目的研究分枝杆菌噬菌体DNAⅢ的生物学特性及抗耐结核潜力,筛选鸡尾酒疗法配方噬菌体。方法采用双层琼脂培养法制备噬菌体DNAⅢ,观察噬菌斑特点;透射电镜观察DNAⅢ形态;噬菌斑实验检测DNAⅢ最佳和最小感染复数(MOI);通过一步生长曲线实验确定DNAⅢ潜伏期及裂解量;检测DNAⅢ对温度、酸碱度的耐受情况;检测DNAⅢ对分枝杆菌的裂解谱;血清中和实验检测DNAⅢ的抗原性,及其与其它8种分枝杆菌噬菌体之间的亲缘关系。结果 DNAⅢ噬菌斑圆形透明,直径约1mm;DNAⅢ尾长(208±28.7)nm;最佳MOI为10-4,DNAⅢ对耻垢分枝杆菌极度易感;DNAⅢ感染宿主菌的潜伏期约为165min,裂解量为28;DNAⅢ对热、酸碱均敏感;DNAⅢ能裂解耻垢分枝杆菌、结核分支杆菌标准株、多数结核分枝杆菌临床耐药株;DNAⅢK值为770.01,抗血清对非对应噬菌体的中和活性差。结论 DNAⅢ抗原性低,裂解谱广,具有抗耐药结核作用,可作为鸡尾酒疗法的候选噬菌体。

表达载体噬菌体DNAλgt11提纯方法

利用表达载体噬菌体λgt11构建基因组文库和cDNA文库是遗传工程研究较为普遍和理想的一种载体。该载体DNA有如下特点:①在β-半乳糖苷酶基上游53bp处有一个EcoRI克隆位点,可容纳较大片段的外源DNA(约7.2kb),使之能组建容量较大的基因文库。②经诱导能产生融合蛋白,为利用抗体探针筛选特异基因克隆提供了非常便利的条件。

大规模噬菌体DNA测序样品制备方法的改进与应用

目的优化大规模噬菌体DNA测序样品制备的方法,提高筛选效率。方法通过PCR扩增噬菌体环七肽库第一轮、第二轮和第三轮淘选产物中含插入目的片段噬菌体DNA,经琼脂糖凝胶电泳和DNA测序鉴定,并与经典的噬菌体DNA提取方法进行比较。结果PCR扩增法和经典法制备的噬菌体DNA的测序成功率分别为92.73%、93.75%,差异无统计学意义(P>0.05);两种方法制备的同一个噬菌体克隆的DNA经测序鉴定显示测序结果一致;第一轮、第二轮和第三轮淘选产物的噬菌体克隆经PCR扩增和电泳鉴定,发现无插入目的片段的噬菌体克隆检出率逐轮增加分别为1.04%、4.17%和22.69%(P<0.01)。结论PCR扩增含插入目的片段噬菌体DNA的方法可使大规模噬菌体筛选和DNA测序更加方便、快捷、实用,值得推广。

噬菌体基因组DNA快速提取方法

针对传统噬菌体基因组DNA的提取方法缺乏广泛适用性,并且提取中用到酚/氯仿抽提,操作步骤繁琐,会对操作人员身体造成一定程度的损伤等不足,笔者建立了1种噬菌体基因组DNA快速提取方法。其提取的主要步骤包括宿主核酸降解、噬菌体粒子沉淀、噬菌体DNA释放、杂质去除、DNA吸附、DNA清洗和DNA洗脱等。结果表明,通过此法能快速提取以溶藻弧菌、大肠杆菌和阴沟肠杆菌为宿主菌的多种噬菌体基因组DNA,最快可以在2 h内完成,而且提取的产量和纯度均较高,DNA浓度超过100 ng·μL^(-1),OD_(260/280)达到1.8以上,提取产物不受宿主菌基因组DNA污染,可用于下游的实验分析。

酸水解同位素稀释质谱法测量基因组DNA含量

建立了测量噬菌体入基因组DNA含量的方法。样品添加同位素标记碱基内标之后，用体积分数为88％的甲酸溶液在170℃水解30min，解离出的核酸碱基通过反向柱分离，电喷雾四级杆质谱法测定，用多反应监测模式分别检测碱基及其同位素标记物的母离子和碎片子离子，从而建立了基因组DNA水解一同位素稀释质谱法测量长片段核酸含量的方法，并将DNA浓度溯源至碱基浓度。方法的线性范围为1—1000μg／g，检出限可低至100ng／g。测定的入DNA含量标准物质为（2．51±0．06）μg／支（k=2），该方法可用于长片段核酸含量标准物质定值。

酶促DNA合成研究的进展

笔者介绍了酶促DNA合成研究的进展。科恩伯格和他的同事经历了从合成核苷酸、核苷三磷酸到合成DNA的历程。他们分离并提纯了DNA聚合酶,弄清了合成DNA的最直接的前体,揭示了DNA合成的化学机理,合成了具有感染性的噬菌体ΦX174DNA。

一株广域pH耐受性微小噬菌体αα的分离、纯化及生理学特性分析

本研究采用双层平板法从污水中分离纯化出一株烈性沙门氏菌噬菌体αα。利用电镜观察其形态特征,通过琼脂糖凝胶电泳分析其核酸组成,并对其生理学特性进行分析,包括一步生长曲线、温度耐受性、pH耐受性、裂解谱、最佳离子浓度和最佳感染复数。结果表明,该烈性噬菌体αα有一个直径为20 nm的头部,无尾部结构,其核酸类型为单链DNA。由此推断,噬菌体αα属于微小噬菌体科。该噬菌体无明显潜伏期,裂解期为60 min,在pH2.10～11.45内和温度40～50℃内效价分别保持在10~6～10~8和10~8pfu/mL左右,最佳感染复数值为10^(-4),钙镁离子均能促进该噬菌体的液体增殖,其中培养基中含10 mmol/L MgCl_2时促进效果最佳,与未添加离子的对照组相比提高了1.5个log。研究结果为噬菌体的多样性及其应用等方面的研究奠定了基础。

用抗细胞表面分子单链抗体筛选和鉴别其相互作用肽

展示于噬茵体表面的肽库适于用抗体筛选其特异性结合表达肽。scFv-C193是一个抗KGla细胞表面分子的单链抗体,其抗原仍不清楚,为了筛选并鉴定其识别分子,用8cFv-C193筛选了1个展示于T7噬茵体表面的人胎肝cDNA片段库。经4轮生物吸附后分离单个阳性噬斑,并对其表达产物做电泳分析及斑点杂交。结果鉴别出1个scFv-C193结合肽,scFv-C193+克隆噬菌体DNA插入片段的PCR扩增和序列分析结果表明它是1个43bpDNA片段表达产物。BLAST分析EST人类基因数据库,发现它97%相同于CD34+造血干/祖细胞mRNA的1-43bp,提示scFv-C193识别片段存在于人类造血干/祖细胞基因中,单克隆单链抗体scFv-C193可能用于研究这些人类基因的性质。

美国微生物学会杂志摘要

1．美国德州MD Anderson癌症研究中心开发了一种颗粒，是带有金（金属）的重组丝状M-13噬菌体的颗粒，据称可以用作影像诊断试剂，并还可能具有可将药物导入损伤组织的潜在作用。该组研究人员曾发现人血管系统具有特异的分子标记，并被称“邮编”（zip codes）。根据这一特性，他们利用重组噬菌体DNA可展示一些肽，从而可以识别这些“邮编”，而与之结合并到达特殊的组织内。

Red/ET重组及其在生物医学中的应用

通过应用Rac噬菌体的RecE RecT和λ噬菌体的RedαRedβ系统而建立的DNA工程平台———Red ET重组,是一种不依赖于限制性内切酶的分子克隆新技术。运用该技术能够介导PCR产物或寡核苷酸对目标基因进行剪切、插入、融合及突变等多种操作,在生物医学领域里具有广阔的应用前景,尤其在基因组功能研究中对BACs、PACs和细菌染色体的打靶修饰以及基因敲除动物DNA靶分子的快速构建等方面最有效。随着Red ET重组的推广与应用,该技术本身也在不断被改进,在工作效率得到显著提高的同时,其操作也变得更加简单、省时、省力。结合自身的一些研究结果,对Red ET重组的技术特点、发展现状和在生物医学中的应用进行了详细阐述。

转基因迷局

30多年前，美国科学家伯格利用限制性内切酶，将猿猴病毒DNA和噬菌体DNA切开、重组，得到了世界上第一批重组DNA分子，标志着DNA重组技术成为现代生物技术和生命科学的基础与核心。从那时起，就有人预言，利用转基因技术培育作物会引发第二次绿色革命：充足的改良食物、燃料和纤维将喂饱这个饥饿的世界，为农民带来收益，并促进环境好转。从许多层面来看，这场革命已经开始了。

人源噬菌体抗体库中血管内皮细胞生长因子抗体的筛选及活性鉴定

目的 从人噬菌体Fab抗体库中筛选抗人血管内皮细胞生长因子 (VEGF)抗体克隆 ,并对其特异性及活性进行分析 ,为后续工作奠定基础。方法 从不同人群外周血淋巴细胞提取总RNA ,经逆转录聚合酶链式反应 (RT PCR)分别扩增轻、重链抗体Fab段 ,用噬菌体表面呈递技术构建抗体库 ,经过 4轮固相筛选及单克隆差异筛选 ,获得能结合VEGF的抗体克隆。在此基础上通过ELISA、Westernblot和3 H TdR参入分别对所获抗体克隆的特异性及中和活性进行分析 ,并对阳性克隆DNA进行测序分析。结果 构建了 1.5× 10 8人组合噬菌体抗体库 ,并筛选获得了结合VEGF的人噬菌体抗体Fab段。Westernblot表明所获抗体能较好结合VEGF ,3 H TdR参入实验显示其中一株抗体可中和VEGF引起的内皮细胞增殖作用。DNA序列分析表明所获抗体片段为人源VH6亚群抗体重链基因和VJC重排后的VL4亚群抗体轻链基因。结论 利用噬菌体抗体库技术可直接获得特异人源VEGF抗体 ,为进一步通过基因工程改造 ,获得有临床应用价值的VEGF抗体提供了新的可能性。