转WMV-2外壳蛋白基因西瓜植株的病毒抗性

西瓜是夏季的重要水果 ,病毒病是影响其品质和产量的重要原因之一。植物基因工程的发展为抗病育种提供了新途径。利用外壳蛋白 (coatprotein)基因转化高等植物 ,赋予转基因植物以相应抗病性的成功例子已很多。本文报道WMV - 2CP基因在转基因西瓜植株中的遗传、分离、表达以及转基因植株对病毒病的抗性实验结果。通过自交结合PCR检测 ,发现WMV - 2CP基因在自交子一代的分离符合孟德尔 3∶1的分离比。经过连续 4代的选择鉴定 ,已从T7、T11和T32 3个独立转化子的后代中筛选获得 8个转基因纯合株系 ,性状表现整齐一致。Westernblot结果表明 ,R4 T7-1、R4 T11-3以及R4 T32 -73个不同来源的株系均能表达产生外壳蛋白。转基因纯合株系WMV - 2感染后的病毒抗性实验表明 ,与未转基因对照相比 ,转基因株系可以推迟发病时间 ,减轻发病程度。实验筛选获得的转基因株系R4 T32 -7表现出对WMV - 2的高度抗性 。

猪瘟病毒E2蛋白抗原多肽与T4噬菌体SOC蛋白的融合表达

利用 DNA重组技术将猪瘟病毒 (clascical swine fever virus,CSFV) E2蛋白主要抗原编码区基因 (m E2 )与 T4噬菌体 SOC基因融合 ,插入 T4噬菌体表达质粒 ,构建成 T4噬菌体 SOC位点表达 m E2的表达载体 p1Sm E2。将其转化至 BL2 1 (DE3 )菌 ,取经 IPTG诱导后表达的目的蛋白 SDC- m E2进行 SOS- PAGE、薄层凝胶扫描分析、Western blot及 EL ISA等方法检测。结果表明 ,表达的 SOC- m E2蛋白相对分子质量约 2 5 70 0 ,表达量占菌体总蛋白量的 36 .7%,并具有与 CSFV特异性抗体反应的活性。

猪瘟病毒E2蛋白重组T4噬菌体的构建及免疫学特性

利用重组 PCR技术将猪瘟病毒 (CSFV) E2基因与 T4噬菌体 SOC基因 C端融合 ,构建了大小为 12 33bp的SOC/ E2融合基因 ,将其插入携带 T4溶菌酶基因 (e)和 denv基因的 T4重组载体 (p RH) ,构建了重组载体 p RSE2 ,通过重组载体与缺失突变型 T4噬菌体基因发生同源重组 ,将 SOC/ E2融合基因整合入 T4噬菌体的基因组中。经EL ISA、Western blot等免疫学检测证实 ,T4噬菌体表达的 E2融合蛋白具有 CSFV免疫学活性 ,动物试验证实 T4 .SOC.

T7 cDNA噬菌体展示文库筛选乙型肝炎病毒前S2蛋白结合蛋白

目的以乙型肝炎病毒前S2蛋白(HBVPre-S2)为靶蛋白,寻找该蛋白相应的结合蛋白。方法应用噬菌体表面展示技术,以纯化的HBV前S2蛋白为固相筛选蛋白,用正常人肝细胞的噬菌体T7cDNA文库进行5轮生物筛选,经噬斑PCR,对筛选克隆进行DNA序列分析,将推断的氨基酸序列在蛋白质库中进行搜索,自GenBank中获得与HBVPre-S2有结合作用蛋白的cDNA和基因组的全长序列,并用ELISA验证筛选的结合蛋白。结果噬菌体经过5轮生物富集后,将随机筛选的200个噬斑裂解液做PCR,得到120个插入片段长短不一的克隆,ELISA证实获得43个阳性克隆。将其PCR产物序列测定后进行同源搜索,初步确定30个人体肝脏中固有的与乙型肝炎病毒前S2蛋白结合的蛋白,其中含细胞色素P450Ⅰ类A型亚基克隆2个、3个PI-3激酶相关激酶SMG-1同类蛋白、2个细胞生长抑制蛋白42,1个膜联蛋白A11转录变异体、3个转录激活因子5、2个α酸性糖蛋白、5个未知功能蛋白等。结论应用T7cDNA噬菌体表面展示技术和生物信息学方法筛选并验证了HBVPre-S2蛋白结合蛋白,为进一步研究Pre-S2蛋白的生物学功能提供新了思路。

西瓜花叶病毒2号南瓜分离物的鉴定及其外壳蛋白基因序列分析

利用电镜和酶联免疫吸附测定法(ELISA)在黑龙江省采集的南瓜病样中检测到西瓜花叶病毒2号(WMV-2)。再利用免疫PCR(IC-PCR)和反转录PCR(RT-PCR)方法,扩增获得其外壳蛋白(CP)基因片段,并克隆到pGEM-T载体中。核苷酸序列测定表明,该分离物CP基因全长为852个核苷酸,编码由284个氨基酸组成的31.8 kDa蛋白。与国外已报道的WMV-2 CP基因相比,其核苷酸序列同源性为92.2％-94.O％,由此推导的氨基酸序列同源性为94.5％-98.1％。与国内2个分离物相比,和山西分离物核苷酸和氨基酸的同源性都达到98.5％,和郑州分离物核苷酸和氨基酸的同源性分别为91.5％和95.0％。

衣原体GPIC噬菌体衣壳蛋白Vp2的克隆、表达和鉴定

目的获得衣原体GPIC噬菌体衣壳蛋白Vp2基因及其蛋白。方法提取噬菌体φCPG1及其核酸,用PCR技术扩增Vp2基因片段,再将其定位插入到原核表达载体pET30a(+)中,构建重组表达质粒。然后将重组表达质粒转化入大肠杆菌(BL-21)中,并用酶切分析、PCR扩增及部分序列测定等方法对重组质粒进行了鉴定。然后诱导表达,用SDS-PAGE及蛋白印迹进行鉴定。结果所获得的Vp2基因片段经测序,长度为561bp,检索确认其序列与Genebank一致。对重组质粒进行诱导表达,SDS-PAGE和蛋白质印迹均显示获得相对分子质量约32kDa的衣原体GPIC噬菌体衣壳蛋白Vp2。结论成功表达了噬菌体衣壳蛋白Vp2,为进一步研究其作用机制和临床应用打下基础。

西瓜花叶病毒2号外壳蛋白基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

以郑州地区西瓜花叶病病叶分离物──西瓜花叶病毒２号（２－ＷＭＶ－）为毒源，从繁殖寄主西葫芦病叶中分离、鉴定了病毒。以病毒基因组ＲＮＡ为模板，逆转录合成ｃＤＮＡ，通过多聚酶链式反应（ＰＣＲ），从ｃＤＮＡ中扩增和克隆了病毒外壳蛋白（ＣＰ）基因，其中包括３’端非编码区，完成了全部核苷酸序列分析。ＣＰ基因全长１０９９个苷耷酸，其中编码区长９０３个核苷酸，编码３０１个氨基酸，３’端非编码区长１９６个核苷酸。Ｚ－ＷＭＶ－２ＣＰ基因的编码区比Ａ－ＷＭＶ－２，Ｕ－ＷＭＶ－２两株系的ＣＰ基因编码区分别长出６０个核耷酸，多编码２０个氨基酸。与两个株系相比，编码区的核昔酸序列同源性分别为８８．５％和８７．０％，氨基酸序列同源性分别为９０．０％和８８．７％，３，端非编码区的同源性分别为６８．３％和７１．８％。若不考虑Ｚ－ＷＭＶ－２多出的６０个核苷酸及２０个氨基酸，则上述同源性依次为９５．４％、９３．７％、９６．４％、９５．０％、８８．８％和９３．４％。构建了含ＷＭＶ－２ＣＰ基因的大肠杆菌表达载体，经聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，表达出了与天然病毒外壳蛋白分子量相同的蛋白。

在丝状噬菌体主要外壳蛋白上展示外源多肽的载体

利用基因工程手段 ,构建了两个用于在丝状噬菌体主要外壳蛋白表面展示外源多肽的载体 .这类载体可以使编码外源多肽的DNA片段定向克隆到外壳蛋白的N末端DNA序列中或附近 ,被修饰的外壳蛋白将分布于野生型丝状噬菌体外壳蛋白亚单位中间 .

MS2噬菌体衣壳蛋白与包装位点结合特异性及其生物学应用进展

MS2噬菌体为正义单链RNA噬菌体,基因组含有3569个核苷酸,编码成熟酶蛋白、衣壳蛋白、复制酶蛋白和裂解蛋白。MS2噬菌体复制酶编码基因5'端一个由19个碱基组成的茎环结构(又称包装位点)是衣壳蛋白二聚体与RNA相互作用的部位,二者相互作用形成的复合物是启动噬菌体自我包装的信号。MS2噬菌体衣壳蛋白与包装位点结合的特异性已被应用于RNA病毒核酸检测的标准物质、校准品和质控品的研究,实时动态监测活细胞内RNA的运动,以及RNA体内递送载体的研究等领域。

多肽在丝状噬菌体外壳蛋白上的展示

利用基因工程方法将丝状噬菌体ｆｄ基因８克隆入ｐＫＫ２２３－３质粒中．将人工合成的六个氨基酸残基的多肽基因插入到修饰后的质粒载体中，并制备了杂合噬菌体．ＳＤＳ－ＰＡＧＥ结果表明，外源多肽基因得到了正常表达，其产物展示于丝状噬菌体的外壳蛋白上．

利用噬菌体抗体库制备人源性抗β_2糖蛋白-Ⅰ抗体

目的:制备人源性抗β2糖蛋白-Ⅰ(β2GPI)抗体Fab片段。方法:以人β2GPI为抗原,从人源性天然抗体库中筛选特异性Fab抗体,并用ELISA方法对所获抗体进行抗原结合活性和特异性鉴定。结果:通过4轮"亲和吸附-洗脱-扩增"筛选,获得2株抗β2GPI抗体。酶切去掉载体上的噬菌体基因III,得到了可溶性表达的Fab段。经过鉴定,所获抗体具有良好的抗原结合活性和特异性。结论:利用人源性天然抗体库成功制备了2株抗β2GPIFab抗体,为深入研究该抗体在抗磷脂抗体综合征发病机理中的作用和探讨新的治疗措施奠定了基础。

新型鹅星状病毒ORF2蛋白纳米抗体的筛选及鉴定

【目的】由新型鹅星状病毒(novel goose astrovirus,nGAstV)引起的雏鹅痛风病对我国养鹅业造成了重大经济损失。通过构建nGAstV纳米抗体(nanobody,Nb)噬菌体展示文库,获得识别nGAstV ORF2蛋白的特异性Nb,可为建立nGAstV抗体检测方法及研究nGAstV ORF2蛋白结构和功能奠定基础。【方法】使用蔗糖密度梯度离心方法纯化在LMH细胞中增殖的nGAstV,RT-PCR鉴定nGAstV并通过细胞病变测定nGAstV滴度。用0.06%甲醛溶液灭活纯化的nGAstV作为免疫原,免疫两周岁羊驼。首次免疫时用灭活纯化的nGAstV与等量弗氏完全佐剂乳化后免疫,第2—5次免疫用灭活纯化的nGAstV与等量弗氏不完全佐剂乳化。每间隔两周免疫一次,每次免疫剂量均为50μg。第5次免疫14 d后,通过间接ELISA方法测定羊驼血清中针对nGAstV的IgG抗体效价。待IgG抗体效价达到构建噬菌体抗体展示文库标准时,分离羊驼外周血淋巴细胞(peripheral blood lymphocyte,PBL),然后提取PBL总RNA将其反转录为cDNA,利用巢氏PCR方法扩增重链抗体重链可变区(variable domain of the heavy chain of heavy chain antibodies,VHH)基因,将其构建至pComb噬菌体载体并结合噬菌体展示技术构建nGAstV Nb噬菌体展示文库,计算该文库库容量并分析其多样性。nGAstV作为靶抗原,通过三轮富集淘选初步获得与nGAstV反应的重组噬菌体Nb阳性克隆,将其克隆至pcDNA3.1-Fc真核表达载体并进行测序分析,将测序成功且序列不同的质粒转染至HEK-293F细胞中表达,并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定表达情况。以nGAstV为靶标抗原,利用间接ELISA方法和Western blot试验对表达成功的Nb进行特异性、反应活性验证,并以nGAstV ORF2蛋白为靶标抗原,利用间接ELISA方法对Nb进行亲和力验证,获得生物学活性较好的Nb。【结果】RT-PCR结果显示,nGAstV增殖成功;Reed-Muench法分析nGAstV滴度达4.38 Log10TCID50/mL。羊驼经5次免疫nGAstV后,通过间接ELISA方法测得其血清中针对nGAstV的抗体效价达到1:64000;利用巢氏PCR方法扩增出VHH并成功构建库容量为3.8×108CFU/mL的nGAstV Nb噬菌体展示文库;遗传进化树分析显示,该噬菌体Nb库多样性良好。三轮富集淘选后,初步获得39株与nGAstV反应的重组噬菌体纳米抗体阳性克隆,其中有25株序列不同;SDS-PAGE鉴定结果显示,共有10株Nb在HEK-293F细胞中表达成功。通过ELISA、Western blot验证进一步获得8株与nGAstV ORF2蛋白特异性反应的Nb,且1株Nb生物学活性最好。【结论】首次筛选到与nGAstV ORF2蛋白特异性反应的Nb,为nGAstV的基础研究和检测方法提供材料。

桃拉综合征病毒CP2蛋白的克隆表达及其结合肽的噬菌体肽库筛选

目的：克隆表达出桃拉综合征病毒（TSV）主要衣壳蛋白CP2蛋白,并通过对噬菌体随机肽库的淘选,得到与CP2蛋白结合的相关多肽,以探讨CP2蛋白与配体作用的特异位点。方法：根据重组质粒pMD-CP2的核苷酸序列,设计并合成了一对引物,扩增TSV CP2基因高变区376~1 371 bp,扩增片段插入pET-32构建成原核表达载体pET-CP2。该重组载体在IPTG诱导下进行可溶性表达,SDS-PAGE电泳检测表达的CP2蛋白。以纯化的CP2蛋白作为筛选分子,对噬菌体展示12肽库进行亲和淘选。结果：原核表达出56 kD大小的CP2蛋白,对噬菌体12肽库4轮＂吸附-洗脱-扩增＂淘洗后,所得的噬菌体回收率逐步提高,由6.4×10-5上升到2.8×10-2,显示淘选过程对随机肽库有很好的富集效果。随机挑选第4轮淘筛后的36个单克隆噬菌体,ELISA鉴定有24个单克隆（66.6%）为强阳性。将这24个阳性克隆扩增、测序,推导随机多肽的氨基酸序列。分析发现,有7个克隆（克隆号2、6、7、9、18、20、33）完全一致,序列为HTSFCSTHLCLI,其它的几个克隆如克隆3及28序列为HCSNLFCSLDLP;克隆5为HCSHTLCALHVM;克隆26为HCNSWLCPLITD也与该7个克隆有相似的序列,经比对核心序列为HCS及LCL。结论：首次用重组的TSV CP2蛋白从噬菌体随机12肽库中筛选到特异结合的肽序列,其共有结构特征为明确CP2与结合蛋白的相互作用位点提供支持。

PCV2 Cap蛋白噬菌体单链抗体库的构建及淘选

用重组的PCV2Cap蛋白免疫Balb/c小鼠,从免疫小鼠脾细胞中提取总RNA,经反转录后,扩增抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因,利用Overlap PCR方法将VH基因和VL基因组装成单链抗体(ScFv)基因,将ScFv基因克隆到噬菌粒载体pCANTAB-5E中,并将重组载体转化至感受态大肠杆菌TG1中,获得PCV2Cap蛋白的单链抗体文库,经测定抗体库库容为3.58×106。通过辅助噬菌体M13K07拯救,构建鼠源PCV2Cap蛋白的噬菌体单链抗体库。4轮生物淘选后,经ELISA方法检测,最终获得3株能与Cap蛋白特异性结合的噬菌体克隆。

猪瘟病毒E2基因噬菌体展示多肽库的构建及表位鉴定

本研究通过建立CSFV噬菌体展示多肽库,并对其进行生物淘选,以期获得E2蛋白上新的抗原表位。选择CSFV石门株(SM)和疫苗株(HCLV)为代表株,采用噬菌体展示技术,以T7select415-1b为载体,分别构建了CSFV SM株和HCLV株E2基因噬菌体展示多肽库(SM-E2库和HCLV-E2库)。通过生物淘选和噬菌体原位杂交技术,采用7株猪瘟单克隆抗体和1株猪瘟高免血清分别对构建的SM-E2库和HCLV-E2库进行抗原表位筛选。结果共筛选到了5条与E2蛋白高度同源的序列,在E2蛋白上的同源区域分别为TAVSPTTLR、YYEP、TTWKEYSH、GGQ(V)VK和PDGLPHY。结果表明,TAVSPTTLR、YYEP和TTWKEYSH序列与目前已知E2蛋白表位一致,说明它们是E2蛋白上的优势表位;GGQ(V)VK和PDGLPHY序列与预测表位一致,推测是E2蛋白上潜在的抗原表位。

适应素耳结合外壳相关蛋白2高表达对肝细胞癌生物学功能的影响

目的:探讨适应素耳结合外壳相关蛋白2(NECAP2)在肝细胞癌中的表达与肝细胞癌(HCC)患者预后的关系,观察NECAP2在肝癌细胞MHCC-97H中的表达及其对HCC增殖及侵袭的影响。方法:从肿瘤基因组图谱(TCGA)数据库下载并整理TCGA-LIHC的数据进行分析;选取16例肝癌样本及其配对的癌旁样本进行研究,用荧光实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测这16对样本、正常肝细胞LO2以及肝癌细胞MHCC-97H中的差异表达水平;用小干扰RNA转染MHCC-97H细胞以沉默NECAP2的表达,实验分为实验组(si-NECAP2组)和对照组(si-NC组)。并采用细胞计数试剂盒(CCK-8)、5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷(EdU)实验、Transwell实验和蛋白质印迹法(Western blot)分别检测实验组和对照组的细胞活力、增殖、迁移和侵袭能力以及表皮生长因子受体(EGFR)蛋白的表达量。两组间比较采用t检验。结果:基于TCGA数据库中的肝癌细胞组和正常肝细胞组,癌旁组织中NECAP2的表达水平明显低于肝癌组织(3.747±0.474比4.367±0.593),差异有统计学意义(t=7.102,P<0.05);NECAP2在正常肝组织中的表达(3.746±0.474比4.263±0.503)要显著低于配对的肝癌组织,差异有统计学意义(t=5.152,P<0.05)。ROC曲线下面积(AUC)值为0.802,表明NECAP2对HCC有很好的诊断价值,Kaplan-Meier分析结果显示,NECAP2高表达组患者的生存期更短;实验组细胞吸光度(A)值、EdU阳性细胞占比、迁移细胞数量和侵袭细胞数量[3.201±0.300、(15.06±8.90)%、(103.000±7.550)个、(112.333±5.508)个]明显低于对照组[4.852±0.462、(49.070±10.520)%、(141.000±8.888)个、(146.333±4.041)个],差异有统计学意义(t=5.995、4.269、5.664、8.621,P<0.05)。此外,EGFR的表达量更低,与NECAP2的表达呈正相关。结论:NECAP2在HCC中的表达显著上调,NECAP2高表达组的患者预后更差;细胞实验证明下调NECAP2的表达可能通过下调EGFR的表达来抑制HCC的增殖、迁移及侵袭能力。

丙型肝炎病毒包膜蛋白E2抗独特型人源单链可变区抗体的筛选与鉴定

目的:制备抗丙型肝炎病毒(HCV)包膜蛋白E2(E2)的抗独特型单链可变区抗体scFv(抗-IdscFv),为研制HCVE2的抗-IdscFv疫苗奠定基础.方法:采用噬菌体表面展示技术,将抗HCVE2单克隆抗体固相包被于Nunc板,从噬菌体单链可变区抗体库中经过5轮“黏附-洗脱-扩增”筛选过程,随机挑选出53个克隆,利用酶联免疫黏附法、交叉反应和竞争抑制实验,对其进行免疫学检测,获得与HCVE2单克隆抗体结合活性较强的抗独特型抗体单链可变区片段(抗-IdscFv)的阳性克隆,并对HCVE2特异性抗-IdscFv的编码序列进行序列测定分析.结果:对噬菌体单链可变区抗体库经过5轮“黏附-洗脱-扩增”的筛选后,结合到包被平皿的噬菌体与第一轮相比,富集了12倍.用酶联免疫黏附实验(ELISA)方法测定第五轮筛选后上清液中含有的抗-IdscFv与HCVE2单克隆抗体结合活性.其中有18株克隆ELISA的吸光度(A450nm)值较高(E11A450nm0.928,E14A450nm1.152,E17A450nm1.136,E28A450nm1.163,E53A450nm0.965).对这些噬菌体抗体进行与牛血清白蛋白(BSA)的交叉反应后,确定其中有5株交叉反应较弱(E11A450nm0.044,E14A450nm0.062,E17A450nm0.166,E28A450nm0.012,E53A450nm0.069),结合2次ELISA重复实验的A值及竞争抑制实验结果,最后确定1株(E28)阳性克隆.提取质粒,进行DNA序列测定,DNA大小为768bp.结论:用噬菌体抗体库技术能够成功地获得单抗HCVE2的抗-IdscFv,本实验结果为开展用抗-IdscFv防治丙型肝炎的研究创造了条件.

猪瘟病毒E2蛋白B细胞识别基序的筛选

根据猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)E2蛋白的序列设计并人工合成18条重叠多肽,与载体蛋白BSA偶联后,利用抗CSFV E2蛋白单克隆抗体SWmAb8筛选该蛋白上的B细胞表位;同时用12肽噬菌体随机肽库淘选E2单抗识别多肽序列。结果显示,多肽序列VSPTTLRTEV能被单抗SWmAb8识别;含SPTxLR基序的噬菌体能被单抗SWmAb8结合,且能被病毒抗原竞争性抑制。证实SPTxLR基序很可能是E2蛋白的线性表位之一,可诱导机体产生中和抗体。

金葡菌固相抗体吸附水样中 f_2 噬菌体的效果

采用金葡菌固相抗体技术特异地吸附水样中的ｆ２噬菌体获得较好的效果。先用滤料物理吸附ｆ２噬菌体，然后用３Ｘ肉汤洗脱，再用金葡菌固相抗体特异地吸附洗脱液中的ｆ２噬菌体。结果，当金葡菌固相抗体与洗脱液的体积比＝１：１０，样品中ｆ２噬菌体的浓度为１０４～１００时，吸附率可达８０％～１００％，并使ｆ２噬菌体浓缩近５０倍，为进一步ＰＣＲ检验提供了条件。本法操作简便、灵敏度高、特异性强、金葡菌固相抗体可冷冻干燥，便于长期保存。