噬菌体PaP3多糖解聚酶对铜绿假单胞菌生物膜的作用研究

目的检测重组铜绿假单胞菌噬菌体PaP3多糖解聚酶对铜绿假单胞菌生物膜的降解活性。方法经FITC-ConA/PI荧光双染色后,采用激光扫描共聚焦显微镜观察重组多糖解聚酶处理前后PA3生物膜的形态变化,以测定多糖解聚酶对生物膜的降解活性;测定多糖解聚酶作用前、后铜绿假单胞菌对4种敏感抗生素(乳酸环丙沙星、加替沙星、头孢他啶、硫酸庆大霉素)的MIC、MBC变化情况,从而判断多糖解聚酶对抗生素的协同杀菌作用。结果FITC-ConA/PI荧光双染色结果显示,经重组多糖解聚酶处理后,铜绿假单胞菌生物膜的胞外多糖组分少而分散,包裹在胞外多糖组分里的细菌数量也大大减少,表明多糖解聚酶确实能够特异性的降解生物膜的胞外多糖组分。多糖解聚酶作用后四种抗生素相应的MIC、MBC都出现了不同程度的降低,其中以头孢他啶降低最为明显,表明多糖解聚酶对抗生素具有协同杀菌活性。结论重组噬菌体PaP3多糖解聚酶在体外可以特异性的降解铜绿假单胞菌生物膜的胞外多糖,有利于抗生素通透生物膜,作用于菌体,具有协同抗菌作用。

推定铜绿假单胞菌噬菌体PaP3末端酶小亚单位的DNA结合能力检测

目的检测理论推定的铜绿假单胞菌噬菌体PaP3末端酶小亚单位(pap3p01基因)编码蛋白对特异性DNA的结合能力。方法通过PCR从噬菌体PaP3基因组扩增出pap3p01基因,克隆至表达载体pQE31,转化入大肠杆菌JM109后,IPTG诱导表达目的蛋白,超声裂菌后发现目的蛋白质H6-PaP3P01存在于上清中,进而利用Ni-NTA亲合层析纯化蛋白。利用PCR与酶切方法获取可能含有末端酶小亚单位结合位点的DNA片段,并对其3′端进行生物素标记。最后采用凝胶迁移率改变实验检测H6-PaP3P01的DNA结合能力。结果成功构建了pQE-PaP3P01表达载体,获得的融合蛋白H6-PaP3P01表达量较高且全部存在于菌体超声后的上清中。经亲和层析初步纯化及脱盐处理后,H6-PaP3P01可与263 bp特异性DNA片段结合。结论成功构建并表达了推定的PaP3末端酶小亚单位重组蛋白H6-PaP3P01,并且检测到了该蛋白质对特异DNA的结合能力,初步证实了理论推定的正确性,为完善PaP3噬菌体包装机制的研究奠定了基础。

铜绿假单胞菌噬菌体PaP3末端酶大亚单位DNA结合能力的测定

目的检测铜绿假单胞菌噬菌体PaP3末端酶大亚单位与噬菌体基因组末端cos位点的结合能力。方法通过PCR扩增出末端酶大亚单位编码基因tls,经pMD-T18载体克隆至表达载体pQE31上,IPTG诱导表达,获得包涵体蛋白,用包涵体裂解液溶解包涵体,通过Ni-NTA亲和层析,分离出重组目的蛋白rTLS,透析复性后,与生物素标记的基因组末端cos片段进行结合反应,通过EMSA检测DNA滞后现象。结果成功构建了表达载体pQE-tls,获得了纯化的具有生物学活性的重组末端酶大亚单位rTLS,EMSA结果证实结合rTLS后的cos片段与无蛋白加入的对照组相比明显滞后。结论重组噬菌体PaP3末端酶大亚单位在体外可与基因组末端cos片段发生特异性结合,为进一步研究该蛋白的功能奠定了基础。

噬菌体PaP3推定基因tls核酸内切酶活性的初步验证

目的对BLAST推定的铜绿假单胞菌噬菌体PaP3的tls基因功能进行实验验证。方法采用PCR方法从噬菌体PaP3基因组扩增出tls基因,克隆至pMD18-T载体中,再经酶切纯化后将目的基因插入表达载体pQE31,转化入大肠杆菌JM109,IPTG诱导表达目的蛋白,超声裂菌后收集包涵体,并用裂解缓冲液溶解包涵体蛋白。然后利用Ni-NTA亲合层析纯化蛋白,通过透析使H6-TLS复性。最后构建含有末端酶大亚基酶切位点的底物质粒pMD-cos,检测复性蛋白活性。结果通过上述方法,成功构建了pQE-tls表达载体,融合蛋白H6-TLS表达量占菌体总量的30%。同时成功构建了目的蛋白的底物质粒pMD-cos。经由亲和层析初步纯化及透析复性后,H6-TLS可检测出核酸内切酶的活性,能将底物质粒部分线性化。结论成功地获得了具有内切酶活性的H6-TLS融合蛋白,为tls基因的认证提供了实验证据,为进一步鉴定和利用该基因奠定了基础。

铜绿假单胞菌噬菌体PaP3的溶原化条件及稳定性研究

目的:溶原性噬菌体在宿主菌基因组中的整合和切割作用介导基因在宿主菌间的水平转移。文中研究铜绿假单胞菌噬菌体PaP3的溶原化机制及生物学特性,为阐明噬菌体介导的基因转移和由此而产生的生物多样性提供实验依据。方法:在不同的条件下利用该噬菌体感染其宿主菌-铜绿假单胞菌PA3,制备溶原菌基因组DNA,用在噬菌体基因组中没有酶切位点的PstⅠ进行酶切,通过脉冲场电泳图谱确定最佳的溶原化条件。并通过噬菌体效价测定噬菌体PaP3对温度、pH值、离子强度及柠檬酸钠浓度等理化因素的敏感性。结果:噬菌体PaP3的最佳溶原化培养条件为37℃,在NZYM培养基培养铜绿假单胞菌PA3 10 h后,以20∶1(宿主菌数目∶噬菌体数目)的比例加入噬菌体PaP3感染24 h。噬菌体PaP3对温度有一定的耐受性,对pH的适应范围较广,Ca2+与Mg2+可使PaP3的效价增加,而柠檬酸钠可抑制噬菌体生长。结论:通过溶原菌基因组DNA的酶切确定了噬菌体PaP3的最佳的溶原化条件,并在基因水平上证明PaP3为溶原性噬菌体,在不同的理化因素下具有不同的稳定性。

PaP3噬菌体53×10^3蛋白编码基因的确定

目的 确认PaP3噬菌体 5 3× 10 3 蛋白的编码基因。方法 用PEG沉淀结合CsCl梯度密度离心分离、纯化噬菌体颗粒 ,通过SDS PAGE电泳分析该噬菌体的结构性蛋白带 ,转印PVDF膜后 ,对 5 3× 10 3 蛋白进行N 端氨基酸测序 ,进而从PaP3全基因组的 2 5 2个ORFs中确认该蛋白质的编码基因及其对应的氨基酸序列。结果 PaP3噬菌体的结构性蛋白共发现有 8个 ,其中 5 3× 10 3 蛋白是由ORF2 9893编码的。 5 3× 10 3 蛋白编码基因全长 15 2 4bp ,G +C =5 4 92 %,编码 5 0 8个氨基酸。该蛋白分子质量为 5 3 7× 10 3 ,等电点 (PI)为 7 2 0 7。结论 5 3× 10 3 蛋白是由噬菌体基因组中ORF2 9893编码的 ,共由 5 0 8个氨基酸组成。