噬菌体MS2和φX174的双层琼脂平板和液体培养基扩增方法的建立

噬菌体MS2和φX174曾广泛作为指示病毒,用来研究病毒在土柱和田间实验条件下的迁移行为。本文详细介绍了实验室小规模双层琼脂平板扩增和大规模高复数感染法制备纯噬菌体溶液的条件和方法步骤。宿主细菌E.coli(ATCC 15597)的最佳培养时间为90～120min,而E.coli(ATCC 13706)的最佳培养时间为120～150min,在上述时间段内,它们的生长分别进入对数期。小规模双层琼脂平板扩增方法耗时、耗力,但用高复数感染扩增方法可获取一次大量(约500ml)的高浓度纯噬菌体MS2和φX174溶液,它们的含量分别可达1011pfu/ml和108pfu/ml。

T4、φχ174D和f2三种噬菌体对戊二醛消毒剂抵抗力的比较研究

目的筛选出消毒实验中评价消毒因子对病毒灭活效果的指示噬菌体。方法比较研究噬菌体T4、φχ174D和f2对戊二醛消毒剂的抵抗力。消毒剂对噬菌体的灭活效果采用悬液定量灭活试验、中和剂鉴定试验、噬菌体的检测采用双层琼脂法。结果13000mg/L的戊二醛对噬菌体T4作用20min,或6000mg/L的戊二醛对噬菌体T4作用5min即可达到消毒水平(对噬菌体T4的灭活对数值(LIV)或噬菌体T4的对数减少值〔LRV)(log10No-log10Nt)≥4.00log10〕;22500mg/L的戊二醛对噬菌体φχ174D作用20min,或5000mg/L的戊二醛对噬菌体φχ174D作用5min达到消毒水平;34000mg/L的戊二醛对噬菌体f2作用40min,或8000mg/L的戊二醛对噬菌体f2作用10min达到消毒水平。结论上述三种噬菌体对戊二醛的抵抗力由强到弱为:噬菌体f2>噬菌体T4>噬菌体φχ174D。

噬菌体ΦX174标准物质定值方法研究

采用国际标准ISO 16604中噬菌体ΦX174的双层琼脂计数方法作为噬菌体ΦX174标准物质定值方法,针对该方法进行了方法验证和协同实验验证以及不确定度分析。结果显示,该方法重复性和复现性均较好,室内重复性相对标准偏差为10. 18%,室间相对标准偏差为14. 58%。经统计分析,双层琼脂计数法相对扩展不确定度为12. 44%,适用于噬菌体ΦX174标准物质的定值,对于人员防护装备防护性能评价具有重要意义。

防护服材料抗血液传播病原体穿透性能测试——Phi-X174噬菌体试验方法验证及影响因素讨论

YY/T0689-2008《血液和体液防护装备防护服材料抗血液传播病原体穿透性能测试——Phi-X174噬菌体试验方法》标准等同采用ISO16604:2004国际标准。结合北京市医疗器械检验所几年来具体的防护材料产品检测的实践经验,通过标准验证试验,我们对标准的适用性进行了可行性研究。

噬菌体裂解基因E原核表达载体构建及大肠杆菌菌影的制备

根据Genbank已知序列,设计1对引物,采用PCR方法扩增PhiX174噬菌体裂解基因E,经克隆、鉴定及序列测定分析,将该基因亚克隆到原核表达载体pGEX-6P-1,构建了能够在大肠杆菌中表达裂解基因E的载体pGEX-E,并采用CaCl2法将其转入大肠杆菌BL21(DE3),经诱导后成功获得了大肠杆菌菌影,为进一步研究菌影这一新型的疫苗制备方法和新的疫苗佐剂奠定了基础。

高度稀释的顺势疗法药物对噬菌体感染的细菌基因水平的作用(英文)

目的:探讨具有抗病毒作用的高度稀释的顺势疗法药物对噬菌体感染的大肠杆菌在基因水平调节噬菌体ΦX174 DNA的作用。方法:本研究之所以选用噬菌体ΦX174是因为其对大肠杆菌的宿主特异性及其在宿主内进行溶菌素基因E的组成性表达。采用顶层琼脂法,计数琼脂板上的斑块数量以衡量不同的顺势疗法药物对噬菌体感染的大肠杆菌的保护作用。被噬菌体感染的大肠杆菌接受不同顺势疗法药物的干预,以高度稀释的乙醇做为安慰剂对照,并加设空白对照组。琼脂板上的斑块数量表明菌群被噬菌体ΦX174感染并溶解的数量。反之,我们在用顺势疗法药物干预前将噬菌体ΦX174混入药物中,再与细菌作用,以确定药物本身对感染细菌的噬菌体ΦX174没有作用。结果:每一种顺势疗法药物干预后的细菌琼脂板上的斑块数量均较安慰剂对照组和空白对照组有显著下降;而混入药物的噬菌体ΦX174感染细菌后,琼脂板上的斑块数量并无明显下降。因为噬菌体ΦX174在细菌内开始其溶菌过程,斑块数量的下降可能是因为溶菌素基因E被抑制或者整个噬菌体ΦX174的DNA被大肠杆菌内的基因产物(抑制酶)所破坏。结论:本研究的结果证实了高度稀释的顺势疗法药物对噬菌体感染的大肠杆菌在基因水平有调节作用。

大肠杆菌菌影制备及介导pEGFP-N1在RAW264.7细胞中表达

通过PCR扩增噬菌体PhiX174裂解基因E,并将其插入到温控表达载体pBV220中,构建重组温控表达质粒pBV220-E。将重组质粒pBV220-E转化至大肠杆菌DH5α中,升温到42℃诱导E基因的表达。将真核表达质粒pEGFP-N1与大肠杆菌菌影孵育后转染小鼠巨噬细胞RAW264.7,荧光显微镜观察pEGFP-N1的表达情况。结果表明:扩增的E基因全长为276bp,与GenBank公布的基因序列一致。电镜观察结果显示,细菌表面出现跨膜孔道,细菌内容物经孔道排出形成空壳。荧光显微镜观察结果显示,大肠杆菌菌影介导的pEGFP-N1在小鼠巨噬细胞中获得表达。为进一步研究以细菌菌影为基础的新型灭活疫苗和载体疫苗提供参考依据。

裂解基因E和核酸酶基因串联表达载体的构建及大肠杆菌菌影的制备

目的构建噬菌体裂解基因E和核酸酶基因串联表达载体,制备高质量的大肠杆菌菌影。方法自行设计一对引物,PCR扩增PhiX174噬菌体裂解基因E,将该基因亚克隆至原核表达载体pGEX-6P-1,构建大肠杆菌菌影的表达载体pGEX-E。在E基因基础上与辅助基因葡萄球菌核酸酶A(SN)基因串联,并插入pGEX-6P-1载体,构建双基因串联高效表达载体pGEX-E-5aaLinker-SN和pGEX-E-15aaLinker-SN,采用CaCl2法将其转入大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,制备大肠杆菌菌影。结果裂解基因E单基因及串联基因已成功插入融合表达载体pGEX-6P-1,所构建的大肠杆菌菌影表达载体pGEX-E、pGEX-E-5aaLinker-SN和pGEX-E-15aaLinker-SN,诱导后经透射电镜及活菌计数显示大肠杆菌已发生不同程度裂解,制成了大肠杆菌菌影。电镜下菌影形态完整,内容物已释放到胞外。结论已成功构建了噬菌体裂解基因E单基因及裂解基因和核酸酶基因串联基因表达载体,并制成了大肠杆菌菌影,为进一步研究菌影这一新型的疫苗及佐剂形式奠定了基础。

φχ174D、T4和f2噬菌体对碘伏消毒剂抵抗力的研究

目的筛选出消毒实验中评价消毒因子对病毒灭活效果的指示噬菌体,比较研究了噬菌体φχ174D、T4和f2对碘伏消毒剂的抵抗力。方法消毒剂对噬菌体的灭活效果采用悬液定量灭活试验、中和剂鉴定试验,噬菌体的检测采用双层琼脂法。结果(1)有效碘浓度为500mg/L的碘伏溶液与噬菌体φχ174D作用40min,或有效碘浓度为750mg/L,作用10min,或有效碘浓度为1000mg/L,作用5min即可达到消毒水平[对噬菌体φχ174D的灭活对数值(LIV)或噬菌体φχ174D的对数减少值(LRV)(log10No-log10Nt)≥4·00log10]。(2)有效碘浓度为600mg/L的碘伏溶液与噬菌体T4作用40min,或有效碘浓度为700mg/L,作用5min即达到消毒水平。(3)有效碘浓度为50mg/L的碘伏溶液与噬菌体f2作用10min,或有效碘浓度为75mg/L,作用10min或有效碘浓度为100mg/L,作用5min达到消毒效果。结论上述三种噬菌体对碘伏的抵抗力由强到弱为:噬菌体φχ174D>噬菌体T4>噬菌体f2。

酶促DNA合成研究的进展

笔者介绍了酶促DNA合成研究的进展。科恩伯格和他的同事经历了从合成核苷酸、核苷三磷酸到合成DNA的历程。他们分离并提纯了DNA聚合酶,弄清了合成DNA的最直接的前体,揭示了DNA合成的化学机理,合成了具有感染性的噬菌体ΦX174DNA。

人伤寒沙门菌Ty21a菌蜕的制备

目的探讨利用噬菌体PhiX174 E基因制备人伤寒沙门菌Ty21a菌蜕的可行性以及适当制备条件。方法将PhiX174 E基因克隆至温控表达系统,筛选获得裂解效率较高的质粒pMBE,通过优化转化方法将pMBE导入Ty21a,利用温控表达系统进行Ty21a菌蜕制备。菌落计数计算菌蜕裂解效率,并通过扫描电镜和透射电镜观察其形态结构。结果裂解质粒pMBE介导大肠杆菌DH5α的裂解效率达99.99%;通过电击转化方法获得重组Ty21a(pMBE),利用温控表达系统成功制备Ty21a菌蜕,裂解效率达96.77%。电镜观察菌蜕结构完整并呈空泡状结构,并能看到溶菌孔道。结论 PhiX174 E基因表达可实现人伤寒沙门菌Ty21a裂解形成Ty21a菌蜕,为其作为疫苗和药物递送载体的研究奠定了基础。

细菌生长过程中的病毒消失行为研究

环境中土著微生物存在及微生物的不同生长阶段可能影响病毒去向。本研究选择自然界广泛存在的3株细菌:恶臭假单胞菌(PP)、铜绿假单胞菌(PA)、枯草芽孢杆菌(BS)为微生物代表,以噬菌体X174为指示病毒,通过30℃(PP)和35℃(PA和BS)条件下病毒与细菌同步生长的培养实验和4℃条件下病毒与不同生长时段的菌株培养物的静态吸附实验,比较分析了细菌生长发育阶段对病毒消失(包括可逆/不可逆吸附和消亡)的影响。培育实验结果表明,病毒在30℃和35℃培养基中的浓度随着培育时间持续降低;但当培养基中接菌时,病毒浓度从接种至对数期6 h间急剧降低,降低幅度超过对照处理,其中在BS处理中降幅最大,其次为PA和PP处理;随着细菌由对数期进入稳定期和衰亡期,病毒浓度先反弹升高,然后后持续降低,反弹最高点病毒浓度在3株菌处理中均高于各自对照处理,反弹持续时间和病毒浓度的反弹提升程度依不同菌株而异。静态实验结果表明,菌株培养物的培育时间从6 h延长至18 h时,病毒的消失比例逐渐降低,继续延长至24 h时又迅速升高,然后随着培育时间的进一步延长而持续降低。以上结果表明细菌对病毒消失的影响随细菌生长发育阶段和菌种而异,暗示在研究病毒在环境中去向时,必须考虑环境中本土微生物的存在及其组成。

普通变异型免疫缺陷症的Ig类别及其亚类转换障碍——Ⅱ.体内观察

以新抗原噬菌体174(φ×174)免疫25例普通变异型免疫缺陷(CVI)病人,以观察其体内免疫球蛋白(Ig)及其亚类转换功能。24例正常成人作为对照组。结果示25例人,仅4例能完全从IgM转换到IgG_4,9例仅产生IgM,5例IgM+IgG_3+IgG_1,6例IgM+IgG_3+IgG_1+IgG2。

生物防护服穿透性噬菌体指标筛选

目的研究PhiX-174、f2、MS2 3种噬菌体的生物学性质,为生物防护服抗微生物悬浮液穿透性能评价选择合适的指示噬菌体。方法从噬菌体形态大小、繁殖能力、耐压性及其所形成噬菌斑的特征等方面,对PhiX-174、f2、MS2 3种噬菌体的生物学性质进行观察。结果 PhiX-174形成噬菌斑最大、形成时间最短,培养5 h后,噬菌斑直径可达2.57 mm,繁殖能力最强,4 h即可迅速增殖到1.67×1010 PFU/mL,最终可达1012 PFU/mL以上,3种噬菌体大小相当,直径均为25 nm左右,远小于人类血源性病毒和呼吸道病毒,均有一定耐压力,在1.75、3.5、7、14、20 kPa下作用5 min后,均未见噬菌体滴度明显减少。结论噬菌体PhiX-174最适于作为生物防护服尤其高危生物污染环境作业人员防护服抗病毒效果评价的指示病毒。

低成本材料对病毒ΦX174在土壤中迁移的影响

低成本工农业副产物和矿物材料对土壤和水体中病原微生物具有去除潜力。本研究以噬菌体ΦX174作为目标病原体,选用菱镁矿、煅烧菱镁矿、铁屑、生物炭、沸石、石灰石和铝矾土7种材料,分别与表层土壤按体积比1∶9混合后填装柱体,开展室内稳态饱和条件下的土柱迁移实验。结果表明,对ΦX174的去除率:煅烧菱镁矿(100.0%)>菱镁矿(23.3%)>铁屑(16.9%),其余4种材料(生物炭、沸石、石灰石、铝矾土)对ΦX174的去除率均低于15.0%。结合实验前后材料表面晶体结构和物相组成变化分析可知,煅烧菱镁矿在实验溶液中部分反应生成氢氧化镁,改变材料表面晶体结构和溶液化学条件,使病毒通过固相吸附和液相失活被截留去除。菱镁矿实验前后材料性质稳定,无反应产物生成。铁屑在实验溶液中部分反应,生成铁氧化物和羟基铁氧化物,增加了铁屑表面的病毒吸附位点。铁屑和菱镁矿可能的吸附机制为静电作用和疏水作用。探究不同材料对病毒在土壤中迁移行为的影响,可为防治病原微生物污染提供理论基础和修复依据。

某种正压生物防护服的病毒气溶胶防护性能评价

目的评价某种正压生物防护服对病毒气溶胶的防护效果。方法制备Phi—X174噬菌体悬液，在气溶胶密闭舱室内发生Phi—X174噬菌体气溶胶，应用空气动力学粒子分析仪检测粒子直径，在高送风档和低送风档条件下，调节气溶胶密闭舱室内的湿度，用安德森六级采样器采样，通过计数噬菌体噬斑数评价该正压生物防护服对病毒气溶胶的防护效率。结果Phi-X174噬菌体气溶胶粒子质量中值直径约为0．922仙m，气溶胶粒子本底浓度〉2．0×10^4个／m^3，在不同的测试条件下，该正压生物防护服内病毒气溶胶浓度为0—21PFU／m^3，对Phi—X174噬菌体气溶胶粒子防护效率均〉99．9％，送风量（P=0．84）、环境湿度（P=0．33）以及采样时间（P=0．07）对正压防护服防护效率的影响无统计学意义。结论该正压生物防护服对Phi—X174噬菌体气溶胶的防护效果较好。

大肠杆菌细菌菌蜕的制备及初步研究

目的:利用温度控制噬菌体PhiX174裂解基因E的表达,制备大肠杆菌细菌菌蜕,鉴定其裂解效率并观察其形态。方法:利用PCR技术扩增分离了噬菌体PhiX174裂解基因E并构建其表达质粒,并将质粒转化大肠杆菌DH5α构建工程菌。工程菌培养温度从28℃突升至42℃,每15 min检测菌液D600值,诱导后4 h收集菌体。体外菌落计数计算裂解效率,并通过电镜观察菌蜕结构。结果:获得273 bp的PhiX174裂解基因E全长基因及表达质粒。菌液D600在温度突升至42℃后30 min开始持续下降,2 h后基本维持不变。4 h后收集菌体测得裂解效率为99.99%。电镜观察菌蜕为具有完整外膜结构的细菌空壳,并且无细胞毒性。结论:本研究成功利用噬菌体PhiX174裂解基因E实现了大肠杆菌细菌菌蜕的制备,为进一步的疫苗及递送系统研究奠定了基础。