RGD多肽水凝胶对Tenon囊成纤维细胞活化和YAP信号的影响

目的 探究不同浓度的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)多肽水凝胶,对Tenon囊成纤维细胞(HTF)活化和Yes相关蛋白(YAP)表达的影响。方法 制备0.5%、1.0%、2.0%三种浓度RGD多肽水凝胶,透射电子显微镜观察其内部微观结构,流变学检测弹性模量(E)。构建SD雄性大鼠结膜损伤模型后,分为空白组(不作处理)、低浓度RGD组(结膜下注射0.5%RGD多肽水凝胶)、中浓度RGD组(结膜下注射1.0%RGD多肽水凝胶)、高浓度RGD组(结膜下注射2.0%RGD多肽水凝胶),观察1周后取材,Masson染色观察大鼠结膜处胶原纤维增生情况,免疫组织化学检测大鼠结膜YAP、平滑肌肌动蛋白-α(α-SMA)表达情况。利用转化生长因子-β2(TGF-β2)刺激HTF活化构建瘢痕化细胞模型,按照实验要求分为对照组、 0.5%RGD水凝胶组、1.0%RGD水凝胶组、2.0%RGD水凝胶组、正常组,培养24 h后,Western blot检测HTF中YAP、结缔组织生长因子(CTGF)、α-SMA、纤连蛋白(FN)和I型胶原蛋白(Col I)的蛋白相对表达量;激光共聚焦显微镜观察细胞骨架蛋白(F-actin)和YAP蛋白表达定位。结果 电镜下观察可见,RGD多肽水凝胶内部纳米纤维交联密度随多肽浓度增加而升高,流变学测得0.5%、1.0%及2.0%RGD多肽水凝胶弹性模量(E)依次约为0.067 kPa、0.150 kPa、2.170 kPa。Masson染色结果显示,除中浓度RGD组大鼠结膜胶原纤维增生面积比明显低于空白组外(P<0.05),低浓度组、高浓度组与空白组差异均无统计学意义(均为P>0.05)。免疫组织化学结果显示,与空白组相比,低浓度RGD组、中浓度RGD组、高浓度RGD组大鼠YAP及α-SMA蛋白相对表达量均下降,中浓度RGD组下降最明显,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。细胞免疫荧光染色结果显示,与对照组相比,0.5%RGD水凝胶组、1.0%RGD水凝胶组、2.0%RGD水凝胶组HTF的F-actin绿色荧光减弱,YAP红色荧光从细胞核转位于细胞质表达。Western blot检测结果显示,与对照组相比,0.5%RGD水凝胶组、1.0%RGD水凝胶组、2.0%RGD水凝胶组HTF中YAP、CTGF、α-SMA、FN及Col I蛋白相对表达量均下降,1.0%RGD水凝胶组下降最明显,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。结论 RGD多肽水凝胶的最佳作用浓度为1.0%,其通过抑制YAP蛋白的表达水平及其核转位,减少HTF的活化及其纤维化蛋白的表达,从而产生抗瘢痕效果。

EW-7197对TGF-β1诱导人Tenon囊成纤维细胞增殖和迁移的影响及机制

目的:探讨ALK5抑制剂EW-7197对转化生长因子β1(TGF-β1)诱导的人Tenon囊成纤维细胞(HTFs)增殖和迁移的影响及其机制。方法:采用MTS法检测细胞增殖率,并摸索EW-7197最佳的作用浓度和作用时间。之后将细胞分为3个组,分别为正常对照组、TGF-β1诱导组和TGF-β1+EW-7197处理组,采用Transwell小室观察各组细胞迁移情况,采用Western blot检测各组细胞Fibronectin、α-SMA、p-Smad2、p-Smad3的蛋白表达水平。结果:MTS结果显示,不同处理条件的EW-7197以6.0μmol/L作用24h的细胞增殖率最低(均P<0.01)。Transwell小室实验结果显示,TGF-β1诱导组的细胞迁移数量为228.0±17.0个/视野,明显高于正常对照组(149.0±15.0个/视野)和TGF-β1+EW-7197处理组(46.0±8.0个/视野)(均P<0.01)。Western blot检测结果显示,TGF-β1诱导组细胞中Fibronectin、α-SMA、p-Smad2、p-Smad3相对表达量高于正常对照组和TGF-β1+EW-7197处理组(均P<0.001)。结论:EW-7197能够通过TGF-β/Smad信号通路抑制TGF-β1诱导的HTFs增殖和迁移。

拉坦前列素酸对人Tenon囊成纤维细胞Ⅰ型胶原mRNA表达的影响

目的通过观察拉坦前列素酸对人 Tenon 囊成纤维细胞(human Tenon fibroblast,HTF)Ⅰ型胶原mRNA 表达的影响,研究拉坦前列素对滤过道疤痕化的影响。方法体外培养的 HTF 细胞,分别以不同浓度和不同时间拉坦前列素酸作用后,采用 RT-PCR 方法检测Ⅰ型胶原前胶原α_2亚单位 mRNA 相对表达量的变化。结果拉坦前列素酸作用2d,Ⅰ型胶原 mRNA 10^(-5)M 组下降40.2±8.2%(P<0.01),10^(-6)M 组下降38.4±6.4%(P<0.01),10^(-7)M 组下降29.1±10.5%(P<0.01),10^(-8)M 组下降23.3±10.6%(P<0.01)。10^(-7)M 拉坦前列素酸处理组相对于对照组Ⅰ型胶原 mRNA 第1天下降24.4±9.9%,第2天下降49.0±8.3%,第3天下降94.8±7.1%,随时间延长下调作用增强(P<0.01)。结论拉坦前列素酸可下调 HTF 细胞Ⅰ型胶原α_2亚单位mRNA 的表达。

TGF-β_1对Tenon’s囊成纤维细胞增殖和结缔组织生长因子表达的影响

目的研究转化生长因子β1(TGFβ1)对Tenon’s囊成纤维细胞增殖和诱导表达结缔组织生长因子(CTGF)的影响。方法用MTT法检测不同质量浓度TGFβ1(0、0.1、1、10ng/mL)对Tenon’s囊成纤维细胞增殖的影响;免疫细胞化学染色法检测不同质量浓度TGFβ1(0、0.1、1、10ng/mL)对Tenon’s囊成纤维细胞诱导表达CTGF的影响。结果GFβ1能够剂量依赖性地促进Tenon’s囊成纤维细胞增殖(P<0.05);TGFβ1能够促进CTGF的表达,有随质量浓度的增加而增强的趋势(P<0.05),但1ng/mL和10ng/mLTGFβ1组之间无统计学差异(P>0.05)。结论GFβ1能够促进Tenon’s囊成纤维细胞增殖,并促进其下游介质CTGF的表达,可能是青光眼滤过术后滤过泡瘢痕形成的重要机制。

转化生长因子-β2诱导人Tenon囊成纤维细胞转化及其在瘢痕形成中的作用

背景研究表明转化生长因子-β2（TGF-β2）能够促进瘢痕形成，但其在青光眼滤过术后局部瘢痕形成中的作用机制值得研究。目的探讨TGF-β2对人Tenon囊成纤维细胞（HTFs）转化以及在滤过术后瘢痕形成中的作用。方法在斜视手术中获取3例患者的Tenon囊组织，并用组织块培养法在含质量分数10％胎牛血清的DMEM中培养，培养的细胞贴壁后达到70％～80％亚融合状态时更换为无血清培养基饥饿培养24h，然后分别加入质量浓度1、2、5、10、20Ixg／LTGF-β2诱导HTFs24h，另用2tzg／L或5μg／LTGF-β2 诱导HTFs6、24、48、72h，阴性对照组培养基中不加TGF-β2 用Westernblot法检测HTFs中α-平滑肌肌动蛋白（n—SMA）和pSmad2蛋白的表达，采用细胞免疫荧光技术检测“-SMA及纤维状肌动蛋白（F—actin）表达的定位，采用凝胶收缩实验检测培养细胞收缩力的变化。结果不同质量浓度TGF—B，组HTFs中0I—SMA表达的强度均明显强于阴性对照组，2tzg／L、5μg／LTGF—B，作用24～48h后HTFs中d—SMA表达强度达峰值，10μg／L、20μg／LTGF-β2组较2μg／L、5μg／LTGF-β2组α—SMA蛋白表达强度减弱。对照组HTFs中有少量α—SMA及F—actin表达，1、2、5μg／LTGF-β2组d—SMA及F—actin荧光表达明显增强，阳性细胞数明显增加，10μg／LTGF-β2组α—SMA及F-actin荧光表达较低质量浓度组减弱。2μg／LTGF-β2作用后pSmad2表达强度明显强于PBS组和FBS组，在作用后30rain～2h表达较强，2h后开始出现下降。对照组HTFs收缩凝胶面积所占原面积的百分数为（78．00-3．13）％，1、2、5、10tzg／LTGF-β2组分别为（63．88±1．78）％、（20．69±O．65）％、（19．49±O．54）％、（16．24~0．84）％，HTFs收缩凝胶面积占原面积的百分数随着TGF-β2质量浓度的增加而明显增加（F组别=859．400，P=0．000）。结论TGF-β2可诱导成纤维细胞转分化，一定程度上其作用呈质量浓度依赖性和时间依赖性，且细胞收缩力随质量浓度的增加而增强，可能是青光眼滤过术后滤过通道建立失败的重要机制。

汉防己甲素对人眼Tenon囊成纤维细胞中bax、bcl-2、TGF-β2 mRNA表达的影响

目的观察汉防己甲素(Tet)对体外培养的人眼Tenon囊成纤维细胞(tenon's capsule fibroblasts,TCFS)中bax、bcl-2、转化生长因子-β2(TGF-β2)mRNA表达的影响,探讨其可能的作用机制。方法将体外培养的第3代TCFS分别置于浓度为10-5mol/LTet的培养液和1640培养液中培养48 h,采用实时荧光定量PCR检测细胞中bax、bcl-2和TGF-β2 mRNA的表达变化。结果同对照组比较,Tet实验组中bax mRNA的表达量明显升高,bcl-2、TGF-β2 mRNA的表达量显著下降,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论一定浓度的汉防己甲素可以通过降低bcl-2、TGF-β2 mRNA的表达量,同时提高bax mRNA的表达量来抑制TCFS的增殖,并可诱导其凋亡,可能成为一种潜在的抗青光眼滤过瘢痕药物。

TGF-β_2刺激人Tenon囊成纤维细胞增殖,表达CTGF和合成Fn

目的:研究转化生长因子(TGF-β2)和结缔组织生长因子(CTGF)在滤过泡瘢痕化中的作用。方法:用不同浓度的TGF-β2刺激HTF,然后用RT-PCR和免疫细胞化学法分别检测CTGF和Fn的表达,用MTT法检测细胞的增殖。结果:TGF-β22μg/L到5μg/L范围有剂量依赖性地促进HTF的细胞增殖,CTGF的表达和Fn的合成的趋势(P<0.01),但0.5μg/L,1μg/L与正常对照组对细胞的增殖作用差别无显著性,5μg/L与10μg/L增强细胞的增殖作用也无显著性差异(P>0.05)。结论:TGF-β2能够明显地促进HTF细胞增殖,并增强其下游介质(CTGF)的表达和合成细胞外基质-纤维连接蛋白(fibronetin,Fn)。

CCK-8检测法研究槲皮素对人Tenon囊成纤维细胞的抑制作用

目的观察槲皮素(quercetin,QU)对体外培养的(human Tenon’s capsule fibro-blasts,HTCF)增殖的抑制作用。方法体外培养HTCF。配制QU溶液,其浓度依次为20μmol·L-1、40μmol·L-1、60μmol.L-1、80μmol·L-1、100μmol·L-1,采用活细胞计数试剂盒CCK-8检测不同浓度QU作用下HTCF的增殖,并在光学显微镜下观察细胞的形态变化。结果不同药物浓度HTCF形态学检测显示:50μmol·L-1QU作用48h后,细胞收缩,胞核固缩,聚集在核膜边缘;100μmol·L-1QU作用48h后,细胞未见增殖,出现凋亡小体,细胞的增殖几乎完全被抑制。细胞生长抑制实验的结果显示:QU在各浓度组对体外培养的HTCF均有抑制作用,抑制效应呈剂量时间依赖关系。结论QU能抑制体外培养的HTCF的增殖,且该作用呈剂量和时间依赖性。

转化生长因子-β1对人Tenon囊成纤维细胞表型转化的作用

目的探讨转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）对人Tenon囊成纤维细胞（human subconjunctival Tenon’s capsule fibroblast，HTCF）表型转化的作用。方法人白内障手术中取结膜下Tenon囊组织块培养成纤维细胞。用第5～9代细胞，以不同浓度TGF-β1（0μg·L^-1，2μg·L^-1，5μg·L^-1。，10μg·L^-1，20μg·L^-1）、不同时间（24h、48h、72h）诱导成纤维细胞表型转化为肌成纤维细胞。用蛋白质印迹免疫检测技术和免疫细胞化学技术鉴定细胞表型。结果体外用TGF-β1诱导HTCF，在0～10μg·L^-1，TGF-β1呈剂量依赖性增加平滑肌肌动蛋白在蛋白水平的表达，至20μg·L^-1时表达迅速下降；10μg·L^-1 TGF-β1诱导48h后其平滑肌肌动蛋白的表达与24h、72h相比，差异有显著性（P〈0．01，n=6）。结论一定浓度和剂量的TGF-β1能显著诱导HTCF表型转化为肌成纤维细胞，在人Tenon囊组织局部组织损伤修复及瘢痕形成中具有重要作用。

青蒿琥酯对人Tenon囊成纤维细胞增殖与凋亡的影响

目的观察青蒿琥酯(artesunate,Art)对人Tenon囊成纤维(human Tenon’s capsule fibroblasts,HTFs)细胞增殖与凋亡的影响,探讨青光眼术后滤过泡瘢痕化的治疗对策。方法体外培养HTFs细胞,应用不同浓度(50μg·mL^(-1)、100μg·mL^(-1)、150μg·mL^(-1)、200μg·mL^(-1))的Art处理细胞,采用MTT法检测Art对细胞增殖的影响,流式细胞仪检测Art对细胞凋亡的影响,Western blot检测Art对凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2表达的影响。结果 Art作用细胞48 h后,MTT结果显示:与空白对照组比较,不同浓度的Art处理组对HTFs细胞的增殖均有抑制作用,且呈浓度依赖性抑制(均为P<0.05)。流式细胞仪结果显示:与空白对照组比较,50μg·mL^(-1)、100μg·mL^(-1)、150μg·mL^(-1)、200μg·mL^(-1) Art作用后细胞凋亡率逐渐增加(均为P<0.05),分别为8.80%±0.88%、11.60%±0.56%、16.30%±1.03%、23.40%±1.62%。Western blot检测结果显示:与空白对照组比较,不同浓度Art处理组Bax蛋白表达明显增加,Bcl-2蛋白表达明显降低,且均呈浓度依赖性(均为P<0.05)。结论 Art可抑制HTFs细胞增殖并诱导其凋亡,其机制可能是通过调节凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2的表达而实现的。Art可能成为一种潜在的抗青光眼术后滤过泡瘢痕化的药物。

TGF-β1对Tenon囊成纤维细胞增生和HSP47表达的影响

目的探讨转化生长因子β1(TGF-β1)对人Tenon囊成纤维细胞(HTF)增生和热休克蛋白47(HSP47)表达的影响。方法青光眼患者Tenon囊组织体外培养,用不同质量浓度0.01、0.1、1、5、10ng/mLTGF-β1处理细胞,继续培养24h,用MTT比色法检测吸光度值(A),用免疫细胞化学检测HSP47和Ⅰ型胶原纤维蛋白含量,用实时荧光定量PCR检测HSP47和Ⅰ型胶原mRNA表达。结果TGF-β1能促进HTF的增生(P<0.05),诱导HTF表达HSP47和Ⅰ型胶原纤维蛋白(P<0.05),促进HTF表达HSP47和Ⅰ型胶原纤维mRNA(P<0.05),其作用随TGF-β1质量浓度的增加而增强。结论TGF-β1通过促进HTF纤维增生,诱导下游介质HSP47和Ⅰ型胶原蛋白表达而促进HTF纤维化,可能是青光眼滤过手术后瘢痕形成的重要机制。

丝裂霉素C抑制人结膜囊成纤维细胞生长及增殖

目的 观察丝裂霉素 C( MMC)对培养人结膜囊成纤维细胞生长及增殖的作用 .方法 用 MTT比色法、3H- Td R掺入法及流式细胞仪检测细胞增殖周期观察 MMC对培养的人结膜囊成纤维细胞生长及增殖的影响 .结果 0 .4 g· L- 1MMC作用 5 min后 ,可使成纤维细胞 MTT比色 A570 nm值 7d内无显著变化 ( P>0 .0 5 ) ,3H- Td R掺入实验 CPM第 1日较对照组降低了 72 .5 % ,至第 7日时仍低于对照组 86.2 % ( P<0 .0 1) .细胞增殖周期中 ,MMC组 S期细胞的百分比明显低于对照组 .结论 临床使用剂量 MMC可使结膜囊成纤维细胞增殖能力下降 ,处于增殖抑制状态 ,而不引起明显的细胞死亡 .

ROCK-Ⅰ选择性抑制剂Y-27632对人Tenon囊成纤维细胞增殖、凋亡和黏附性的影响

目的观察ROCK-Ⅰ选择性抑制剂Y-27632对体外培养的人眼Tenon囊成纤维细胞(ocular Tenon capsule fibroblasts,OTFs)增殖、凋亡和黏附性的影响。方法体外培养的第4～6代OTFs经溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid,LPA)诱导后,不同浓度Y-27632处理,采用MTT测定细胞增殖抑制率和细胞黏附抑制率,未经LPA诱导OTFs细胞同时采用Annexin V-FITC/PI双标记流式细胞术测定细胞凋亡率,以及细胞平板克隆增殖实验测定不同浓度Y-27632组OTFs细胞增殖克隆形成率。结果 6、30、150、750μmol/L Y-27632各组经LPA诱导的OTFs细胞增殖抑制D(490)与LPA组比较,差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.01),OTFs细胞黏附抑制D(490)与LPA组比较,同样具有统计学差异(P<0.05,P<0.01)。随着Y-27632浓度增加,细胞凋亡率相应增加。未经LPA诱导的OTFs细胞克隆形成率随着Y27632浓度的增高而降低。结论 Y-27632有效抑制LPA诱导的OTFs增殖和细胞间黏附,诱导细胞早期凋亡。

姜黄素对人眼Tenon囊成纤维细胞抑制作用的研究

目的研究姜黄素对体外培养人眼Tenon囊成纤维细胞增殖的抑制作用,探索防治青光眼手术区滤过泡纤维瘢痕化的新途径。方法用0～80μg/ml姜黄素作用体外培养的人眼Tenon囊成纤维细胞,观察24～96h后不同浓度姜黄素对人眼Tenon囊成纤维细胞的影响。CCK-8法检测细胞生长活性。结果在0～80μg/ml浓度作用24～96h范围内,姜黄素可以抑制人眼Tenon囊成纤维细胞的增长,且呈剂量和时间依赖性。结论姜黄素可抑制体外培养人眼Tenon囊成纤维细胞增殖。

Bevacizumab对人Tenon囊成纤维细胞转分化的抑制作用

目的观察Bevacizumab(贝伐单抗)对转化生长因子(transforming growth factor,TGF)-β2诱导下的人Tenon囊成纤维细胞转分化的抑制作用,探讨抗新生血管药物抑制青光眼术后滤过泡瘢痕化的机制。方法用含体积分数10%胎牛血清的DMEM高糖型培养基对人Tenon囊成纤维细胞株进行体外常规培养和传代。实验分为空白对照组、TGF-β2处理组(加入终浓度为10μg·L-1的TGF-β2DMEM完全培养基)及Bevacizumab干预组(加入10μg·L-1的TGF-β2和1.0 g·L-1的Bevacizumab DMEM完全培养基),置于37℃、体积分数5%二氧化碳培养箱中培养48 h,并分别应用细胞免疫荧光染色技术和Western Blot实验检测Bevacizumab对TGF-β2刺激下人Tenon囊成纤维细胞α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)表达的影响。结果α-SMA蛋白主要表达在细胞质中,免疫荧光染色结果显示TGF-β2处理组可以见到α-SMA的荧光表达,而Bevacizumab干预组α-SMA蛋白表达受到抑制。Western Blot结果显示空白对照组、TGF-β2处理组及Bevacizumab干预组α-SMA蛋白相对表达量分别为0.630±0.038、1.130±0.071和0.340±0.033,Bevacizumab干预组α-SMA蛋白相对表达量低于空白对照组和TGF-β2处理组(均为P<0.05)。结论 Bevacizumab可明显抑制TGF-β2诱导下人Tenon囊成纤维细胞α-SMA蛋白的表达,抑制成纤维细胞表型转化。

K115对TGF-β1诱导的人Tenon囊成纤维细胞增殖和迁移的影响及其机制

目的探讨K115对转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导的人Tenon囊成纤维细胞增殖和迁移的影响及其机制。方法人Tenon囊成纤维细胞取自于河北省人民医院眼科行青光眼手术的患者。采用CCK-8实验检测K115对人Tenon囊成纤维细胞增殖的影响,筛选出TGF-β1对细胞增殖最佳作用浓度为5.0μg·L^(-1),最佳作用时间为24 h;K115对细胞增殖起始作用浓度为5.0μmol·L^(-1),最佳作用浓度为10.0μmol·L^(-1)。依据这两个浓度进行分组,分别是对照组(不加TGF-β1与K115),TGF-β1组(加5.0μg·L^(-1) TGF-β1),TGF-β1+5.0μmol·L^(-1) K115组(加5.0μg·L^(-1)TGF-β1和5.0μmol·L^(-1)的K115),TGF-β1+10.0μmol·L^(-1) K115组(加5.0μg·L^(-1) TGF-β1和10.0μmol·L^(-1)的K115)。采用Transwell实验检测K115对人Tenon囊成纤维细胞迁移的影响;免疫荧光法测定人Tenon囊成纤维细胞中α-SMA蛋白的表达;流式细胞仪检测细胞凋亡情况。对实验所得各指标进行统计学分析。结果本研究细胞培养状态良好,6~8周可见人Tenon囊成纤维细胞铺满培养瓶瓶底。用CCK-8试剂盒检测各组细胞增殖情况结果显示,对照组、TGF-β1组、TGF-β1+5.0μmol·L^(-1) K115组、TGF-β1+10.0μmol·L^(-1) K115组光密度值分别为0.977±0.042、1.306±0.059、0.862±0.035、0.558±0.042,TGF-β1+5.0μmol·L^(-1) K115组、TGF-β1+10.0μmol·L^(-1) K115组光密度值均小于TGF-β1组(均为P<0.05),并且呈现浓度依赖性减小,K115浓度越大细胞增殖减少幅度越大。Transwell实验结果显示,对照组、TGF-β1组、TGF-β1+5.0μmol·L^(-1) K115组、TGF-β1+10.0μmol·L^(-1) K115组迁移细胞数分别为(38.67±3.06)个、(81.00±4.00)个、(44.33±3.21)个、(23.67±2.52)个;TGF-β1+5.0μmol·L^(-1) K115组与TGF-β1组比较,迁移细胞数降低,差异有统计学意义(P<0.05);TGF-β1+10.0μmol·L^(-1) K115组与对照组及TGF-β1组比较,迁移细胞数均明显降低,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。各组细胞内α-SMA蛋白免疫荧光染色结果显示,对照组人Tenon囊成纤维细胞胞浆内可见散在分布的绿色荧光物质,TGF-β1处理后24 h(TGF-β1组),胞浆内绿色丝状荧光物质明显增加,荧光强度差异有统计学意义(P<0.05);与TGF-β1组比较,TGF-β1+5.0μmol·L^(-1) K115组和TGF-β1+10.0μmol·L^(-1) K115组细胞胞浆内的荧光强度呈浓度依赖性减弱,K115浓度越高荧光强度减弱越明显(均为P<0.05)。流式细胞仪检测结果显示,对照组细胞凋亡率为(2.400±0.346)%,TGF-β1组为(0.900±0.173)%,TGF-β1+5.0μmol·L^(-1) K115组为(1.333±0.252)%,TGF-β1+10.0μmol·L^(-1) K115组为(1.067±0.058)%;TGF-β1组的细胞凋亡率较对照组降低(P<0.05);TGF-β1+5.0μmol·L^(-1) K115组和TGF-β1+10.0μmol·L^(-1) K115组的细胞凋亡率均较对照组降低(均为P<0.05),而与TGF-β1组比较,差异均无统计学意义(均为P>0.05)。结论K115对TGF-β1诱导的人Tenon囊成纤维细胞增殖和迁移有明确的抑制作用,其作用机制可能与K115抑制了TGF-β1诱导的细胞内α-SMA的表达进而调控了细胞活化有关。

芹黄素对人眼Tenon囊成纤维细胞增生的影响

背景青光眼滤过手术后人Tenon囊成纤维细胞（HTFs）的增生是滤过手术失败的主要原因，寻找抑制术后HTFs增生的药物可提高滤过手术的成功率。目的观察芹黄素对HTFs体外生长的抑制效应并探讨其作用机制。方法斜视手术中获取的人眼Tenon囊组织剪成1mm×1mm×1mm的组织块，进行原代培养，免疫荧光法进行细胞波形蛋白检测以鉴定培养的HTFs。取第3～5代HTFs接种于96孑L板中，加入0、20、40、80、160μmol／L芹黄素后继续培养，于24、48、72h后分别取一块96孔板，在酶联免疫检测仪上检测560nm波长处各组细胞的吸光度（A。）值，磺基罗丹明B（SRB）法测定细胞的增生能力。分别在培养基中加入40、80、160μmol／L芹黄素，同时在不同浓度芹黄素组培养基中均加入10汕g／LBrdU，继续培养48h，在各组同一个视野下分别拍摄荧光显微镜和光学显微镜照片，计算BrdU的标记率，以未添加任何芹黄素（0μmol／L）组为对照组。用Hoechst33258染色后在荧光显微镜下观察培养细胞的形态学改变，采用流式细胞技术检测细胞的凋亡情况和细胞周期的变化。结果培养的细胞生长状态良好，免疫荧光法检测可见细胞对波形蛋白呈阳性反应，为细胞质中均匀的绿色荧光，确定培养的细胞为HTFs。SRB法检测结果显示，HTFs的增生值（A。）随着芹黄素浓度的增加而逐渐下降，同浓度芹黄素组HTFsA。值随着作用时间的延长逐渐下降，差异均有统计学意义（F㈣u：480．306，P=0．000；F目目=555．144，P=0．000）。0、40、80~mol／L芹黄素作用HTFs48h后BrdU的标记率分别为（87．860＋-0．632）％、（61．520＋-4．306）％、（23．480~4．472）％，各组之间的总体比较差异有统计学意义（F=299．347，P=0．000），其中40μmol／L、80μmol／L芹黄素组HTFsBrdU的标记率均明显低于0μmol／L芹黄素组，差异均有统计学意义（P〈0．05）。Hoechse33258染色发现，不同浓度芹黄素组的细胞数目减少，随着芹黄素浓度的增加，细胞核固缩和变形的细胞数目增加。流式细胞术检测发现，随着芹黄素浓度的增加，G。／G，期细胞的百分数逐渐增加，而S期和G：／M期细胞的百分数逐渐下降，差异均有统计学意义（Fc㈣1=58．621，P=0．000；Fs=32．357，P=0．001；Fc2／M=83．998，P=0．000）。0、40、80、160~mol／L芹黄素作用72h后，细胞的凋亡率分别为（4．77±0．21）％、（13．24±1．35）％、（18．33±1．86）％、（31．58±2．77）％，4个组的总体差异有统计学意义（F=204．791，P〈0．05）。结论芹黄素通过诱导细胞凋亡，并将细胞阻滞于C／C期而抽柏JHTFs的士曾堆苴椎田里剂骨和时问俯觞幛，

苯扎氯铵对人Tenon囊成纤维细胞增殖的影响

目的观察苯扎氯铵对体外培养的人Tenon囊成纤维细胞的增殖的影响。方法体外培养人眼Tenon囊成纤维细胞。配制苯扎氯铵溶液,使其浓度依次为20、2～(2×10-7)μg/mL,采用噻唑蓝(MTT)比色法检测不同浓度的苯扎氯铵作用下细胞的增殖,并在光学显微镜下观察细胞的形态变化。结果较高浓度组(浓度≥0.2μg/mL)的苯扎氯铵对人Tenon囊成纤维细胞存在明显的杀伤作用,20μg/mL时细胞几乎全部死亡,A值与阴性对照相比明显减少(P<0.01),浓度为2和0.2μg/mL时细胞形态变化明显。较低浓度组(浓度<0.2μg/mL),A值和细胞形态较阴性对照均没有明显变化(P>0.05)。比较不同时间下的剂量效应曲线,4和24h没有显著差异(P>0.05)。结论苯扎氯铵0.2μg/mL及以上浓度对体外培养的成纤维细胞具有细胞毒性,低浓度时则对细胞增殖没有明显的影响。

TGF-β_2特异性siRNA载体干扰人结膜囊成纤维细胞表达的研究

目的:探讨人转化生长因子TGF-β2特异性siRNA真核表达载体转染人结膜囊成纤维细胞后对其TGF-β2mRNA表达的影响。方法:体外分离并培养人结膜囊成纤维细胞,在培养后传代3次的细胞以TGF-β2特异性siRNA真核表达载体进行转染,并以未转染细胞作为对照。转染后分别于24,48和72h收集细胞,采用RT-PCR技术检测TGF-β2特异性siRNA真核表达载体对TGF-β2mRNA表达的影响。结果:分离的人结膜囊成纤维细胞于接种约4h左右开始贴壁,同时细胞变长成为梭形,表现出明显的成纤维细胞特性,约36h后达到融合状态;RT-PCR结果示:与对照组相比,转染24,48和72h后的细胞TGF-β2表达抑制率分别为17.40%,52.80%和79.20%,抑制效率呈现随时间延长有所加强的趋势。结论:TGF-β2特异性siRNA真核表达载体能抑制人结膜囊成纤维细胞TGF-β2mRNA的表达。

miR-26对TGF-β_(2)诱导的人Tenon氏囊成纤维细胞迁移、细胞外基质蛋白表达的调控作用及其机制

目的观察miR-26对转化生长因子β_(2)(TGF-β_(2))诱导后人Tenon氏囊成纤维细胞(HTFs)的细胞迁移及细胞外基质(ECM)蛋白表达的调控作用,并探讨其可能的作用机制。方法切取青光眼手术患者的结膜囊组织,以组织贴壁法体外培养HTFs。取传至第3~5代的HTFs,随机分为空白组(不予转染)、TGF-β_(2)组(不予转染)、TGF-β_(2)+miR-26 mimics组(转染miR-26类似物)、TGF-β_(2)+mimics NC组(转染miR-26类似物阴性对照物),TGF-β_(2)+miR-26 inhibitors组(转染miR-26抑制物),TGF-β_(2)+inhibitors NC组(转染miR-26抑制物阴性对照物),转染24 h后除空白组外均加入TGF-β_(2)5μg/L刺激48 h。采用划痕实验检测细胞迁移率,Western blotting法检测Ⅰ型胶原蛋白(COLⅠ)、纤维连接蛋白(Fibronectin)、CTGF(荧光素酶报告基因实验证实miR-26和CTGF存在靶向关系)蛋白,实时荧光定量PCR法检测CTGF mRNA。将对数生长期的HTFs分为空白转染组(不予转染)、TGF-β_(2)+miR-26 inhibitors组(转染miR-26 inhibitors)、TGF-β_(2)+miR-26 inhibitors+si-NC组(转染miR-26 inhibitors+阴性对照siRNA)、TGF-β_(2)+miR-26 inhibitors+si-CTGF组(转染miR-26 inhibitors+CTGF-siRNA),转染处理24 h后均加入TGF-β_(2)5μg/L刺激48 h,比较四组细胞迁移率及COLⅠ、Fibronectin蛋白表达。结果六组细胞迁移率及COLⅠ、Fibronectin蛋白表达:空白组、TGF-β_(2)+miR-26 mimics组<TGF-β_(2)组、TGF-β_(2)+mimics NC组、TGF-β_(2)+inhibitors NC组<TGF-β_(2)+miR-26 inhibitors组(P均<0.05)。六组CTGF mRNA相对表达量:空白组<TGF-β_(2)组、TGF-β_(2)+mimics NC组、TGF-β_(2)+miR-26 mimics组、TGF-β_(2)+inhibitors NC组、TGF-β_(2)+miR-26 inhibitors组(P均<0.05)。六组CTGF蛋白相对表达量:空白组、TGF-β_(2)+miR-26 mimics组<TGF-β_(2)组、TGF-β_(2)+mimics NC组、TGF-β_(2)+inhibitors NC组<TGF-β_(2)+miR-26 inhibitors组(P均<0.05)。四组细胞迁移率及COLⅠ、Fibronectin蛋白表达:TGF-β_(2)+miR-26 inhibitors+si-CTGF组<空白转染组<TGF-β_(2)+miR-26 inhibitors组、TGF-β_(2)+miR-26 inhibitors+si-NC组(P均<0.05)。结论miR-26可以抑制TGF-β_(2)诱导后HFTs的细胞迁移及ECM蛋白合成,该作用可能是通过转录后水平靶向CTGF来实现的。