C/EBPα参与小鼠胰岛β细胞囊泡谷氨酰胺转运子2基因表达的调控

目的:探讨转录调节因子CCAAT增强子结合蛋白α(C/EBPα)在小鼠胰岛β细胞株MIN6的囊泡谷氨酰胺转运子2(VGLUT2)基因表达过程中的调控作用。方法:克隆小鼠VLGUT2基因的启动子区,并对其中C/EBPα的结合位点进行了核酸定点突变,以荧光素酶活力方法观察突变后的启动子活性改变情况。通过电泳迁移率实验(EMSA)检测C/EBPα与含有小鼠VGLUT2启动子区核酸序列的核苷核探针的结合能力,以CEBPαsiRNA特异性抑制转录调控因子C/EBPα的基因表达,通过荧光素酶,RT-PCR和Western blotting方法观察抑制C/EBPα基因表达后小鼠VGLUT2的基因表达情况。结果:在对小鼠VGLUT2启动子区C/EBPα结合位点进行核酸定点突变后,小鼠VGLUT2启动子活性下降约50%,EMSA实验表明C/EBPα可与小鼠VGLUT2启动子区结合,当以C/EBPαsiRNA特异性地下调C/EBPα的表达时,小鼠VGLUT2的启动子活性、mRNA和蛋白水平也相应各自下降约60%、40%及45%。结论:C/EBPα参与了小鼠VGLUT2的基因表达调控。

GGA2在囊泡转运和相关疾病中作用的研究进展

囊泡转运(vesicle transport)是大分子及颗粒性物质在细胞器间的跨膜转运方式,参与细胞多项重要的生命活动,如激素分泌、神经递质的释放及信息传递、天然免疫等,反式高尔基体网络(trans-Golgi network,TGN)-内体(endosome)运输作为其中一条途径,参与跨膜蛋白回收和重复利用[1]。TGN-内体运输缺陷引起的蛋白平衡紊乱和细胞功能紊乱,与恶性肿瘤、神经退行性疾病及糖尿病等多种疾病联系密切[2],如胶质瘤细胞中转接蛋白(adaptor pro-tein,AP)复合物1σ3的减少可抑制肿瘤增殖、侵袭和迁移[3];高尔基体相关、含γ-衔接蛋白耳(gamma-adaptin ear,GAE)的ADP核糖基化因子(ADP-ribo-sylation factor,ARF)结合蛋白3(Golgi-associated GAE-containing ARF-binding protein 3,GGA3)功能丧失引起β-分泌酶1(β-secretase 1)轴突积聚导致阿尔茨海默病早期病变[4]。

大鼠脊髓内囊泡膜谷氨酸转运体1和囊泡膜谷氨酸转运体2阳性纤维和终末在生后发育中的分布和表达变化

目的探讨囊泡膜谷氨酸转运体1(VGLUT1)和VGLUT2阳性纤维和终末在生后第0天(P0)至第22天(P22)大鼠脊髓内的分布情况和表达变化。方法对生后发育P0~P22大鼠的颈膨大和腰膨大部位,进行VGLUT1和VGLUT2免疫组织化学染色。结果 P0~P22大鼠颈膨大和腰膨大脊髓内均可观察到VGLUT1和VGLUT2阳性纤维和终末,但未观察到胞体样结构。VGLUT1和VGLUT2阳性纤维和终末的分布呈现明显的互补分布,尤其是以脊髓后角更加明显。其中,VGLUT1阳性纤维和终末在P0主要见于颈膨大和腰膨大脊髓后角Ⅲ~Ⅴ层,中间部和前角很微弱。脊髓发育至P3,不仅Ⅲ~Ⅴ层VGLUT1的表达进一步增强,且向外侧部扩展,并在后角基底部Ⅵ层和前角的外侧部(Ⅸ层)也可观察到较强的VGLUT1阳性纤维,呈现一条明显由背内向腹外的带状分布趋势。P7时此带状分布更加明显,并随着发育逐渐向内、外扩展,至P22时已广泛分布于除Ⅱ层之外的整个脊髓。而VGLUT2阳性纤维和终末在P0时即密集出现于脊髓后角Ⅰ~Ⅱ层以及前角的外侧边缘区域;之后随着发育,VGLUT2阳性纤维和终末的分布模式并未发生明显改变,但其密度逐渐有所增加,特别是Ⅰ~Ⅱ层内VGLUT2阳性产物的表达尤为明显。另外,在脊髓白质后索内可见VGLUT1阳性皮质脊髓后束纤维由颈髓(P3)逐渐下降至腰髓(P7)的发育过程。结论 VGLUT1和VGLUT2阳性纤维和终末在脊髓发育过程中呈现明显不同,且表现出互补分布的特点,这对于进一步理解VGLUT1和VGLUT2在脊髓生后发育过程中不同功能特点可能有意义。

囊泡单胺转运体2与糖尿病相关的研究进展

囊泡单胺转运体2(VMAT2)是神经内分泌细胞膜上必不可少的蛋白质,参与转运细胞内单胺类递质,在体内分布广泛。近年来,VMAT2在胰腺中的定位及生理功能初步被阐明。随着分子影像学和神经内分泌学的蓬勃发展,VMAT2作为B细胞的潜在分子标志物,在活体外利用其特异性配体,通过正电子断层扫描评价胰岛B细胞量、早期预测与诊断糖尿病的方法备受关注。该文就VMAT2与糖尿病的相关研究进展予以综述。

单胺类囊泡转运体2抑制剂治疗迟发性运动障碍研究进展

迟发性运动障碍（tardive dyskesia,TD）是一种长期服用抗精神病药物所引起的严重药物副反应,其主要临床症状以口-舌-咽三联征以及躯干肌张力增高和躯体的舞蹈样动作为主。虽然很多研究显示第二代抗精神病药物的使用可以显著降低TD的发病风险,但是美国的CATIE研究的结局不支持此结论。

糖尿病伴抑郁患者囊泡单胺转运蛋白2基因的多态性

目的:探讨囊泡单胺转运蛋白2基因(VMAT2)多态性与糖尿病患者抑郁状态相关性。方法:糖尿病患者106例,其中合并抑郁(HAMD评分>20分)的患者50例。分析患者的VMAT2基因多态性分布。用logistic回归分析筛选影响抑郁发生的独立危险因素。比较不同基因型的糖尿病合并抑郁患者基线HAMD评分。结果:伴抑郁组rs363371基因位点的GG基因型比率均高于不伴抑郁组(24.0%vs.8.9%,P<0.05)。家庭人均月收入≤3000元、并发症≥2种、rs363371(GG基因型)为糖尿病合并抑郁的独立危险因素(OR=1.86、2.40、1.87,均P<0.001)。rs363371(GG基因型)患者的HAMD评分高于AA基因型、AG基因型[(27.6±3.0)vs.(22.2±2.2),(23.7±2.7),P<0.05]。结论:VMAT2上的rs363371(GG基因型)是糖尿病患者伴发抑郁的危险因素。

囊泡乙酰胆碱转运蛋白显像剂^(123)I-IBVM的制备及SPECT脑显像

目的:研究脑囊泡乙酰胆碱转运蛋白(VAChT)显像剂123I-5-(三丁基锡-3-苯基哌啶基)-2-羟基萘(123I-IBVM)的制备及其SPECT脑显像。方法:用放射性碘氧化反应法进行IBVM前体的123I标记,用半制备高效液相色谱法(HPLC)分离纯化标记产品123I-IBVM,并测定其标记率、放化纯度及光学纯度;用123I-IBVM进行正常老年人的SPECT脑显像。结果:碘氧化反应法标记IBVM前体标记方法简便,产出率大于50%,标记产品123I-IBVM的放化纯度及光学纯度均大于95%,其在正常老年人的SPECT脑显像图像清晰。结论:123I-IBVM注射液安全、有效,可用于VAChT的SPECT脑显像研究。

囊泡单胺转运蛋白2的研究进展

囊泡单胺转运蛋白2(VMAT2)是囊泡单胺转运蛋白家族(VMATs)成员之一,主要参与单胺类神经递质的转运。VMAT2既可转运突触前释放的神经递质至囊泡中,又可将胞质内有害的单胺隔离到囊泡中。VMAT2功能丧失会导致单胺类囊泡隔离减少,胞浆中单胺聚集。VMAT2缺失会引起亨廷顿病、迟发型运动障碍、帕金森病等中枢神经系统疾病。

小鼠丘脑背内侧核内VGLUT2阳性神经元传入联系的形态学研究

目的:利用狂犬病病毒(RV)介导的逆行跨单级突触追踪技术,观察丘脑背内侧核(MD)内囊泡膜谷氨酸转运体2(VGLUT2)阳性神经元的全脑突触前神经元分布。方法:将RV的辅助病毒注射至VGLUT2-ires-Cre转基因小鼠右侧MD,两周后将RV注入相同区域。一周后灌注取材,进行全脑扫描,观察RV标记的突触前神经元在全脑的分布。结果:将RV病毒注入VGLUT2-ires-Cre小鼠MD后,在皮质和脑干内可观察到密集的突触前神经元。皮质内逆标神经元多分布于运动皮质、内侧前额叶皮质、眶额皮质和岛叶;丘脑内多见于丘脑网状核和下丘脑外侧区等;而脑干逆标神经元则主要分布在臂旁外侧核、中脑导水管周围灰质和中缝核等部位。结论:MD内VGLUT2阳性神经元一方面可接受来自脑干的上行纤维的投射,或丘脑网状核的信息调控;另一方面作为高阶丘脑也可接受皮质的下行投射,参与脑内的多种功能。以上结果为研究MD的功能及相关神经环路的机制提供了形态学基础。

胞外囊泡中linc-VLDLR表达与食管癌发生及耐药的关系

目的探讨胞外囊泡(EVs)中linc-VLDLR的表达与食管癌的发生及耐药的关系。方法以不同浓度阿霉素(ADM)作用于食管鳞癌Eca109细胞24h,采用MTT法检测ADM对Eca109细胞的半数抑制浓度(IC_(50))。以IC_(50)浓度为基准设置3个ADM浓度干预Eca109细胞24h,提取培养液中EVs。荧光定量RT-PCR检测EVs中linc-VLDLR mRNA表达。以EVs干预Eca109细胞48h,随后以不同浓度ADM再作用于细胞24h,MTT法检测IC_(50);EVs干预Eca109细胞48h,流式细胞术检测细胞周期;荧光定量RT-PCR检测Eca109细胞中linc-VLDLR及三磷酸腺苷结合转运蛋白G2(ABCG2)mRNA表达。结果 ADM作用Eca109细胞24h的IC_(50)为0.44±0.02μg/ml,选取0、0.2、0.4、0.8μg/ml ADM浓度作用Eca109细胞24h后提取上清液中的EVs(EVs1–4)。EVs4中linc-VLDLR表达水平明显高于EVs1–3(P<0.01)。EVs1–4干预Eca109细胞48h,EVs4组IC_(50)值明显高于EVs1–3及对照组(P<0.05)。流式细胞术检测显示EVs4组Eca109细胞增殖指数(PI)明显高于EVs1–3及对照组(P<0.01)。EVs4干预Eca109细胞48h后,Eca109细胞中linc-VLDLR及ABCG2基因表达水平明显高于EVs1–3及对照组(P<0.05)。结论 linc-VLDLR及ABCG2基因在食管癌细胞中高表达,参与了食管癌耐药形成。耐药细胞释放的EVs可以上调食管癌细胞中ABCG2表达,调控细胞耐药性,其作用与EVs上携带的linc-VLDLR基因有关。

枢经推拿对慢性神经病理性疼痛大鼠VGLUT2及炎症因子表达的影响

[目的]从2型囊泡膜谷氨酸转运体(VGLUT2)角度探讨枢经推拿对L5脊神经结扎(SNL)模型的神经病理性疼痛大鼠的镇痛机制。[方法]将72只雄性SD大鼠随机分为空白组、假手术对照组、SNL模型组各16只,以及慢病毒干扰组、假推拿组、枢经推拿组各8只,除空白组和假手术对照组外,余组均以结扎L5脊神经致神经病理性痛的方法建立SNL模型。造模7 d后分别从空白组、假手术对照组、SNL模型组中各随机选取8只进行行为学检测及取材。慢病毒干扰组、假推拿组、枢经推拿组均在造模7 d后开始干预,空白组、假手术对照组和SNL模型组不进行干预。慢病毒干扰组:将抑制VGLUT2的慢病毒一次性注入到大鼠脊髓;假推拿组:轻轻抚摸大鼠的背部,每天1次,每次18 min,共10 d;枢经推拿组:用按摩推拿手法模拟仪依次刺激大鼠双侧的环跳穴、风市穴和阳陵泉穴,每法每穴1 min,每次18 min,共10 d;干预结束后全部组别均进行行为学检测及取材,检测脊髓腰膨大节段中VGLUT2蛋白及血清中IL-6、TNF-α的表达水平。[结果]造模7 d后,与空白组比较,SNL模型组的热痛觉阈值、机械刺激痛觉阈值、斜板试验角度均显著降低(P<0.05);VGLUT2表达及IL-6、TNF-α的水平显著升高(P<0.05)。干预10 d后,与SNL模型组比较,枢经推拿组与慢病毒干扰组的热痛觉阈值、机械刺激痛觉阈值均显著升高(P<0.05),VGLUT2表达及IL-6、TNF-α的水平显著降低(P<0.05)。[结论]枢经推拿可能通过下调VGLUT2的表达,进而抑制机体释放炎症因子以缓解疼痛症状。

基于囊泡谷氨酸转运子2功能的多阶段诱导大鼠脂肪干细胞向胰岛素分泌细胞转化情况

目的检测胰岛素和囊泡谷氨酸转运子2(VGLUT2)的表达,鉴定多阶段诱导大鼠脂肪干细胞(ADSCs)向胰岛素分泌细胞分化的情况。方法从SD雄性大鼠脂肪组织中分离ADSCs并诱导其分化为胰岛素分泌细胞,用酶联免疫吸附(ELISA)法检测第1~18天细胞上清液中胰岛素和C肽水平;用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-qPCR)法及蛋白质印迹法检测第1,2,13,18天时VGLUT2 mRNA和蛋白水平。结果成功分离大鼠ADSCs细胞,胰岛素在第1,13和18天的水平分别为(15.12±3.21),(34.52±5.19)和(18.17±4.54)mU·L^(-1);C肽在第1,13和18天的水平分别为(374.68±79.52),(576.18±113.29)和(341.58±97.39)pg·mL^(-1),VGLUT2 mRNA在第1和18天水平分别为1.61±0.49和0.72±0.29;VGLUT2蛋白在第1及18天水平分别为0.05±0.01和0.06±0.02。结论成功分离大鼠ADSCs,通过多阶段诱导为胰岛素分泌细胞。

胞外囊泡通过三磷酸腺苷结合盒转运子G2调控肺腺癌耐药的作用研究

目的探讨携带三磷酸腺苷结合盒转运子G2(ATP binding cassette transporter G2,ABCG2)胞外囊泡(extracellular vesicle,EVs)调控肺腺癌耐药作用及其分子机制。方法取人肺腺癌细胞A549,建立顺铂(cisDiaminedichloroplatinum,CDDP)耐药的肺腺癌细胞A549/CDDP;利用梯度离心法提取A549及A549/CDDP细胞释放的EVs,分别命名为EVs1及EVs2。EVs1及EVs2干预A549细胞48 h后,细胞分别命名为A549-EVs1及A549-EVs2。利用pCDNA3.1-ABCG2重组质粒转染A549细胞,建立A549/ABCG2细胞;转染空载体的A549细胞命名为A549/pCDNA3.1细胞。以MTT检测计算细胞24 h对CDDP的耐药指数;real-time PCR检测细胞、EVs中ABCG2基因表达;建立荷瘤裸鼠模型,分别接种A549及A549-EVs2细胞至裸鼠皮下,记为对照组及实验组。成瘤后腹腔注射3 mg/kg CDDP,每周1次,共2次。取皮下移植瘤组织,real-time PCR检测ABCG2基因表达,流式细胞术检测皮下移植瘤细胞凋亡率。结果以亲代细胞A549为参照,A549/CDDP、A549/ABCG2、A549/pCDNA3.1、A549-EVs1、A549-EVs2细胞24 h对CDDP的耐药指数分别为7.17、10.06、1.02、1.19、5.40。各细胞中、EVs中ABCG2基因的表达水平相比较,A549/CDDP细胞高于A549细胞,A549/ABCG2细胞高于A549/pCDNA3.1和A549细胞,EVs2高于EVs1,A549-EVs2细胞高于A549-EVs1细胞(P<0.01)。实验组移植瘤体积、细胞中ABCG2基因表达大/高于对照组,而细胞凋亡率低于对照组(P<0.05)。结论携带ABCG2基因的EVs可以调控肺腺癌细胞耐药。

2型囊泡单胺转运体分子探针[^18F]-FP-（＋）-DTBZ对2型糖尿病患者胰岛β细胞总量的评价

目的应用2型囊泡单胺转运体分子探针[^18F]-FP-（＋）-DTBZ对2型糖尿病患者胰腺进行显像，探究2型糖尿病患者的β细胞总量（BCM），并探讨胰头和胰体尾部作为靶区域在糖尿病BCM评价方面的价值。方法注射显像剂[^18F]-FP-（＋）-DTBZ 40 min后，对8例2型糖尿病患者和7例正常对照者行20 min PET-CT检查，以脾脏作为参考组织计算胰头和胰体尾部标准化摄取比值（SUV ratio, SUVR）。结果2型糖尿病组胰头部平均SUVR（1.72±0.47），与胰体尾部平均SUVR（1.85±0.41）无统计学差异，正常对照组胰头平均SUVR（2.54±0.57）和胰体尾部平均SUVR（2.73±0.41）无统计学差异。但2型糖尿病组胰头部平均SUVR和胰体尾部平均SUVR较正常对照组胰头部（P＝0.008 8）和胰体尾部（P＝0.001 2）显著减低。结论VMAT2靶点分子探针[^18F]-FP-（＋）-DTBZ可用于2型糖尿病患者BCM的评价。

2型囊泡单胺转运体分子探针18F-FP-(+)-DTBZ定量1型糖尿病大鼠胰岛β细胞总量纵向研究

目的探讨2型囊泡单胺转运体分子探针18F-FP-(+)-DTBZ在纵向评价1型糖尿病动物模型胰岛β细胞总量的价值。方法选取Wistar大鼠为研究对象,将其分为1型糖尿病组和对照组(各6只)。1型糖尿病组按65 mg/kg的剂量腹腔一次性注射链脲佐菌素(STZ)溶液,对照组腹腔注射等体积生理盐水。注射完STZ 0.5、1、4、6、12个月,检测其体重及血糖的变化,并行18F-FP-(+)-DTBZ Micro-正电子发射断层显像(PET)/计算机体层成像(CT)。结果1型糖尿病组大鼠在造模后0.5、1、4个月胰腺平均标准化摄取值(SUV)较对照组显著降低(P<0.05),在6个月和12个月差异无统计学意义(P>0.05)。2组大鼠空腹血糖和胰腺SUV在造模后0.5、1和4个月具有显著相关性(P<0.05)。结论18F-FP-(+)-DTBZ PET显像可以用于糖尿病模型β细胞总量的动态监测。

滋肾平颤颗粒对异动症大鼠行为学及黑质纹状体DAT和VMAT2基因表达的影响

目的:观察滋肾平颤颗粒对异动症(levodopa-induced dyskinesias,LID)大鼠行为学和黑质纹状体多巴胺转运体(dopamine transporter,DAT)及囊泡单胺转运体2(vesicular monoamine transporter2,VMAT2)基因表达的影响。方法:采用6-羟基多巴胺(6-hydroxydopamine,6-OHDA)注射于大鼠脑右侧黑质造成偏侧帕金森病(Parkinson’s disease,PD)模型,进一步对PD大鼠予以左旋多巴/苄丝肼制作异动症模型。实验设立正常对照组、模型组、中药干预组、中止给药对照组和中止给药+中药干预组,分别处理或给药1个月后观察药物对LID大鼠异常不自主运动(abnormalinvoluntary movement,AIM)评分的影响,运用实时定量PCR检测黑质纹状体DAT及VMAT2 mRNA表达。结果:与模型组和中止给药对照组比较,中药干预可明显减少异动症大鼠的AIM积分;荧光实时定量PCR结果显示,模型组大鼠DAT mRNA以及VMAT2 mRNA表达率明显低于正常对照组及其他各组,中药干预组与模型组,中止给药+中药组与中止给药组比较,两种mRNA表达均上调,其中VMAT2增高的趋势更明显。结论:中药可以有效缓解异动症症状,上调DAT mRNA以及VMAT2 mRNA表达。

转染VMAT_2基因的CHO细胞抵抗多巴胺毒性作用的研究

目的：探讨囊泡单胺转运体（vesicular monamine transporter-2，VMAT2）对多巴胺（dopamine，DA）毒性的抵抗作用。方法：采用细胞免疫荧光染色法测定VMAT2基因在转染的CHO细胞（VMAT2-CHO）中的表达：MTF比色法检测不同浓度DA作用下的野生型CHO（WT-CHO）和VMAT2-CHO细胞存活率；应用ELISA法DA检测试剂盒测定细胞内DA的水平；采用活性氧检测试剂盒测定细胞内活性氧的水平。结果：VMAT2-CHO细胞内有较强的特异性荧光表达，主要定位在核周区域，胞浆中也有散在的荧光；0．25～0．4mmol／L DA作用72h，VMAT2-CHO细胞存活率显著高于WT-CHO细胞（P〈0．05）；0．4mmol／L DA作用于WT-CHO和VMAT2-CHO细胞24h，VMAT2-CHO细胞内DA为（199．33±15．155）ng／mi，显著高于WT-CHO细胞（141．4±8．784）ng／ml（P〈0．01）；而细胞内活性氧（ROS）水平则由（144．490±5．295）U／106 cells增加至WT-CHO细胞的（217．895±15．885）U／10^6cells（P〈0．01）。结论：转染VMAT2的CHO细胞对DA引起的毒性有显著的抵抗作用。

脑蛋白水解物注射液对培养神经胶质抗原2阳性神经祖细胞的影响

背景:脑蛋白水解物注射液能缓解多种神经系统疾病的症状,但其作用机制并不明确。研究显示,脑蛋白水解物注射液在体内和体外实验中有促进神经发生的潜能。目的:观察脑蛋白水解物注射液对培养的神经胶质抗原2阳性神经祖细胞增殖和分化的影响。方法:取成年大鼠海马原代及传代培养神经胶质抗原2细胞,以免疫荧光染色法鉴定细胞性质,以乳酸脱氢酶分析法测定细胞活性,以原位缺口末端标记技术(即TUNEL法)观察细胞凋亡,BrdU掺入法鉴定新生细胞。结果与结论:脑蛋白水解物注射液干预显著减少TUNEL阳性细胞数,并明显增加神经胶质抗原2细胞数和神经胶质抗原2细胞中微管相关蛋白2a+2b、突触蛋白Ⅰ、γ-氨基丁酸和囊泡γ-氨基丁酸转运体表达水平。说明脑蛋白水解物注射液能抑制神经胶质抗原2细胞凋亡,促进神经胶质抗原2细胞增殖,并能促进神经胶质抗原2细胞向神经元(特别是γ-氨基丁酸能抑制性中间神经元)分化。

帕金森病基因治疗的理论:VMAT_2基因的表达及其对MN9D细胞多巴胺代谢的影响

目的:获得人Ⅱ型囊泡单胺转运体(vesicularmonoaminetransporter-2,VMAT2)基因,转染至MN9D细胞,通过检测细胞内外单胺类递质含量的变化评价VMAT2基因促进单胺类递质循环利用的效应。方法:从人胎脑中提取总RNA,RT-PCR方法扩增目的cDNA片段并将其重组于pGEM-Easy-T载体中,进行全序列测定。重组真核表达载体pBK-RSV-VMAT2,转染MN9D细胞,免疫细胞化学检测VMAT2的表达,HPLC检测细胞内外单胺类递质含量的变化。结果:RT-PCR扩增到1637bp的带有Kozak序列的cDNA片段。原位杂交证实pAAV-VMAT2能在COS7细胞表达;免疫组化证实转基因的MN9D细胞(实验组)VMAT2免疫着色明显高于对照组。HPLC结果表明实验组中细胞内外的多巴胺含量分别升高至(227.2±20.8)%和(302.6±15.7)%(P<0.01),而细胞外HVA、DOPAC分别降低至(48.1±5.3)%和(55.7±4.9)%(P<0.05),细胞内HVA,DOPAC分别升高至(332.1±28.2)%和(1176.8±82.5)%(P<0.01)。结论:克隆了VMAT2cDNA片断,可在真核细胞中表达。该基因的过表达可促进多巴胺的循环利用,有望用于帕金森病的基因治疗。