PAD4依赖的中性粒细胞胞外诱捕网加重包虫囊液所致过敏性休克

目的探讨精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)依赖的中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)在包虫囊液所致过敏性休克(AS)中的作用和相关机制。方法将野生型(WT)和PAD4敲除(PAD4^(-/-))的C57/B6小鼠分为4组:WT组、WT模型组、PAD4^(-/-)组和PAD4^(-/-)模型组,每组10只。WT模型组和PAD4^(-/-)模型组腹腔注射包虫囊液建立包虫感染小鼠模型。1个月后,两个模型组小鼠再次注射包虫囊液,监测各组小鼠休克和死亡情况。采用qRT-PCR检测各组小鼠脾脏中中性粒细胞PAD4 mRNA表达水平,采用绿菁染色法检测各组小鼠脾脏NETs形成水平,采用流式细胞术检测各组小鼠外周血单核细胞(PBMC)中Th1/Th2细胞比例,采用ELISA检测各组小鼠血清中IL-4、IL-5和IgE水平。体外将NETs与小鼠PBMC共孵育,分为对照组和NETs组,采用流式细胞术检测各组细胞中Th1/Th2细胞比例,ELISA检测各组细胞上清中IL-4、IL-5和IgE水平。结果与WT组比较,WT模型组小鼠休克率和死亡率升高,脾脏中中性粒细胞PAD4 mRNA表达和NETs形成水平升高(P<0.05),PBMC中Th1/Th2细胞比例降低(P<0.05),IL-4、IL-5和IgE水平升高(P<0.05)。与WT模型组比较,PAD4^(-/-)模型组小鼠休克率和死亡率降低,脾脏中中性粒细胞PAD4 mRNA表达和NETs形成水平降低(P<0.05),PBMC中Th1/Th2细胞比例升高(P<0.05),IL-4、IL-5和IgE水平降低(P<0.05)。与PAD4^(-/-)组比较,PAD4^(-/-)模型组小鼠脾脏中中性粒细胞PAD4 mRNA表达和NETs形成水平、PBMC中Th1/Th2细胞比例以及IL-4、IL-5和IgE水平无显著性差异(P>0.05)。与对照组比较,NETs组Th1/Th2细胞比例降低(P<0.05),上清中IL-4、IL-5和IgE水平升高(P<0.05)。结论包虫囊液感染可诱导PAD4依赖的NETs形成,加重小鼠过敏性休克。敲除PAD4可抑制NETs形成,并通过恢复失衡的Th1/Th2细胞比例最终缓解包虫囊液所致的过敏性休克。

多房棘球蚴囊液对沉默DDIT4后小鼠肝细胞生物学功能的影响

目的探讨多房棘球蚴囊液(Hydatid cyst fluid,HCF)对沉默DNA损伤诱导转录因子4(DNA damage-inducible transcript 4,DDIT4)后小鼠肝细胞生物学功能的影响。方法1.采用免疫蛋白印迹法(Western Blot)、实时荧光定量法(RT-qPCR)检测经HCF处理的小鼠肝细胞中DDIT4蛋白的表达量,以检测转染效率;2.选用慢病毒转染小鼠正常肝细胞DDIT4后做HCF处理,采用细胞计数试剂8法(CCK-8)检测各组小鼠肝细胞的细胞活性;3.用Western Blot法检测Beclin-1、Caspase-3、LC3等凋亡自噬相关蛋白水平;4.用透射电镜观察HCF对小鼠肝细胞超微结构的影响。结果1.经HCF作用后慢病毒转染小鼠肝细胞的DDIT4基因及蛋白表达水平检测结果显示,LV-Ddit4-RNAi 1、LV-Ddit4-RNAi 2、LV-Ddit4-RNAi 3组分别与LV-Ddit4-NC组比较,前三组DDIT4蛋白含量显著下降,LV-Ddit4-RNAi 3组尤为显著(P<0.01)。2.LV-Ddit4-RNAi 0.4、0.8 mg/mL组细胞OD值明显大于LV-Ddit4-NC 0.4、0.8 mg/mL组(P<0.01);与HCF共培养48 h后,沉默DDIT4组细胞形态接近正常AML-12细胞的形态,多呈椭圆形或者圆形,且细胞生长密度较LV-Ddit4-NC组明显为高。3.与LV-Ddit4-NC con组比较,LV-Ddit4-NC 0.4 mg/mL HCF组和LV-Ddit4-NC 0.8 mg/mL HCF组的LC3-II、Beclin-1、Caspase-3蛋白表达水平显著增高(P<0.01);分别与LV-Ddit4-NC 0.4、0.8 mg/mL HCF组比较,LV-Ddit4-RNAi 0.4、0.8 mg/mL HCF组的LC3-II、Beclin-1、Caspase-3蛋白表达水平显著降低,均具有统计学意义。4.两对照组细胞胞质未见明显损伤,线粒体基质较均匀,粗面内质网未见明显扩张,自噬水平低;LV-Ddit4-RNAi 0.4、0.8 mg/mL组细胞损伤较轻,未见粗面内质网扩张,胞质内存在较多脂滴,自噬数量增多;LV-Ddit4-NC 0.4、0.8 mg/mL组细胞损伤严重,粗面内质网严重扩张,胞质内存在大量脂滴,可见大量自噬结构。结论HCF对沉默DDIT4后小鼠肝细胞生物学功能的影响:1.AML-12细胞增殖;2.AML-12细胞凋亡、自噬数量减少。

绵羊细粒棘球蚴囊液抗原诱发小鼠免疫反应及保护性免疫的研究

本文用绵羊细粒棘球蚴囊液抗原制剂,给小鼠3次腹腔注射诱发初次免疫,然后腹腔移植泡球蚴组织作攻击感染,观察保护性免疫。实验提示,注射免疫原制剂后1月能诱发小鼠免疫反应,间接血凝试验(IHA)可测出血清抗体;攻击感染后23周,IHA阳性率达94.4％,而未诱发初次免疫的对照鼠IHA阳性率为90.0％,表明无论是初次免疫或攻击感染,均能诱发小鼠产生抗体,二者无显著差别(P>0.05);但IHA血清滴度1:256百分率分别为94.1％和55.5％,有显著差别(P<0.01),表明攻击感染有强化初次免疫的作用。攻击感染后23周,对比免疫鼠和对照鼠的腹腔泡球蚴湿重均值和病理分级率均无显著差别(P>0.05),提示本文小鼠初次免疫未显保护性免疫之效。

立体定向囊液引流结合伽玛刀治疗囊性脑转移瘤

目的探讨立体定向囊液引流结合伽玛刀在治疗囊性脑转移瘤中的作用。方法应用立体定向囊液引流结合伽玛刀治疗脑转移瘤患者79例,伽玛刀治疗的处方剂量为12～28 Gy(平均18.7 Gy)。结果囊液抽吸前肿瘤体积为4.5～72.3 ml(平均25.6 ml),抽吸或引流囊液3.5～45.4 ml(平均16.2 ml),抽吸后肿瘤体积为1.8～30.1 ml(平均12.3 ml),体积缩小率为15%～68%(平均52%),肿瘤局部控制率为93.1%,总生存期为16个月,1年和2年生存率分别为57.1%和32.1%。结论立体定向囊液引流结合伽玛刀治疗囊性转移瘤是可行的。

细粒棘球蚴囊液对体外培养小鼠T淋巴细胞影响的初步研究

目的:观察细粒棘球蚴囊液对体外培养的BABL/c小鼠T淋巴细胞的影响。方法:BABL/c小鼠脾细胞与100μl、200μl、300μl、500μl不同浓度的细粒棘球蚴囊液共培养,流式细胞仪检测CD3+CD4+/CD3+CD8+T淋巴细胞亚群和CD4+CD25+T细胞,RT-PCR法检测Foxp3基因的表达量;相同浓度的囊液和BABL/c小鼠脾细胞悬液共培养,在0、12、24、36、48小时收集细胞,检测T淋巴细胞亚群和Foxp3基因表达情况。结果:随着囊液浓度的增加,CD4+T细胞比例逐渐下降,CD8+T细胞比例上升,CD4+/CD8+的比值下降;CD4+CD25+T细胞则没有随着囊液量的增加而上升,而是在100μl组达到高峰值。RT-PCR的结果显示,在低浓度100μl和200μl组的时候Foxp3 mRNA的相对表达量最高。结论:细粒棘球蚴囊液促使CD4+/CD8+的比值下降,Treg细胞增加,可能在包虫免疫逃逸过程中发挥一定作用。

泡球蚴囊液对大鼠肝星状细胞MAPK信号通路5个相关基因的影响

目的探讨泡球蚴囊液对大鼠肝星状细胞丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号通路5个相关基因的影响。方法采用大鼠肝星状细胞株HSC-T6与不同蛋白浓度的泡球蚴囊液(0.01、0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.9、1.7、3.4、6.8和13.5 mg/ml)共培养24 h后收集细胞,同时收集对照组(未加泡球蚴囊液干预)细胞,显微镜下观察HSC-T6细胞的形态变化。利用荧光实时定量PCR检测大鼠肝星状细胞的细胞外调节蛋白激酶(ERK)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)和丝裂原活化蛋白激酶(p38)的表达情况。结果蛋白浓度为13.5 mg/ml泡球蚴囊液与HSC-T6细胞共培养24 h后,大部分细胞发生固缩,呈脱落前兆。6.8 mg/ml囊液组部分细胞固缩,呈脱落前兆;而部分HSC-T6细胞收缩,呈长梭形,细胞生长出许多细长的伪足,是正常状态的2倍以上。3.4 mg/ml囊液组部分细胞呈收缩的长梭形,生长出许多细长的伪足,但大部分细胞仍呈现为贴壁的胞体较大的不规则多边形,且伸出较短的伪足与其他细胞连接成片状。<1.7 mg/ml囊液组与对照组细胞形态上无差异。实时荧光定量PCR检测显示,泡球蚴囊液浓度>0.4 mg/ml时,ERK1/2、JNK1/2和p38 m RNA水平显著增加;囊液浓度为6.8 mg/ml时,ERK1/2、JNK1/2和p38 m RNA较对照组高表达(P<0.05)。结论浓度为6.8 mg/ml的泡球蚴囊液可显著影响大鼠肝星状细胞ERK1/2、JNK1/2和p38 m RNA水平。

双向电泳及免疫印记法对囊尾蚴囊液抗原的分析、纯化及鉴定

目的 通过分析、纯化囊液抗原 ,筛选高免疫反应性和高特异性抗原组分 ,用于囊虫病免疫诊断。 方法 用分辨率极高的双向电泳法对囊液抗原进行分离、纯化 ,并通过免疫印记 ,用囊虫病人血清、包虫病人血清和其它异源血清筛选特异性抗原组分 ,为建立新一代免疫学诊断方法奠定基础。 结果 得到了等电点为 9 4,分子量为14KD和 16 6KD两组抗原组分 ,特异性达 10 0 % ,并且仅被急性感染的囊虫病人血清识别 ,而不被囊虫完全钙化病人血清识别。 结论 得到了高免疫反应性和高特异性的蛋白纯品 。

猪囊虫囊液游离氨基酸组分的研究

应用氨基酸自动分析仪测定猪囊虫囊液的游离氨基酸组分及含量。从14只猪的皮下肌肉囊虫及10只猪的脑囊虫的囊液进行测定。在两者囊虫囊液所测定的18种氨基酸中,均以内氨酸含量最高;在皮下肌肉囊虫囊液,其次为甘氨酸和脯氨酸,在脑囊虫囊液,则以苏氨酸为次。用配对T检验方法比较7只猪的皮下肌肉和脑囊虫囊液中各种氨基酸含量表明,在不同部位囊虫囊液所含的15种氨基酸中,有12种含量存在显著差异,特别是苏氨酸、丝氨酸、丙氨酸、锁氨酸和酪氨酸出现差异非常显著。本研究结果提示上述氨基酸代谢差异,可能与猪囊虫在宿主的寄生部位不同有关.

多头绦虫抗原特性的研究（1）——囊液和囊壁粗抗原的免疫原性

用羊脑多头蚴囊液和囊壁粗抗原以１２ｍｇ／只的免疫剂量与等体积的白油－司班佐剂乳化，分３次免疫羊。于第３次免疫后１４ｄ，经口攻击感染多头绦虫虫卵２５００枚，攻击后２２５ｄ，剖杀检查免疫效果。结果囊壁粗抗原免疫组羊只全获保护，囊液粗抗原免疫组羊只（３／４）获保护，另１只羊脑中有直径０．６ｃｍ钙化的多头蚴病灶，其间为干酪样物质。而感染对照组羊脑中均有多头蚴寄生，其中１只羊脑中有３个多头蚴包囊，致使羊的脑组织极度萎缩，呈一层薄膜包围在包囊周围。免疫羊血清抗体滴度与免疫保护力之间呈正相关关系。

猪囊尾蚴囊液抗原制备及ELISA检测条件的优化

本试验采用SephadexG-200层析技术纯化猪囊尾蚴(Cysticercus cellulosae)的囊液粗抗原。共获得两种(CF_1、CF_2)层析抗原,以酶联免疫吸附试验(ELISA)判定抗原的最适包被浓度以及抗体的最适稀释倍数,各阶段最适反应条件,结果证明CF_1具有特异性强、敏感性高、稳定性好、重复性强的特点可以作为免疫诊断囊尾蚴病猪IgG。

子宫内膜异位症血清和囊液CA125的测定及临床意义

目的探讨CA125与子宫内膜异位症(EM)的关系。方法分别测定卵巢子宫内膜异位囊肿(巧囊)和非子宫内膜异位症的卵巢良性囊肿患者血清及囊液CA125水平。结果巧囊组囊液CA125高于血清CA125水平(P<0.01);巧囊组血清和囊液CA125均高于对照组(P<0.01);且分别与病情程度成正相关(r=0.8564,r=0.8118,P<0.01);血清CA125与痛经严重程度呈正相关(r=0.5545,P<0.01);而囊液CA125水平与痛经严重程度无明显相关性(P>0.05)。结论CA125与子宫内膜异位症的发生、发展及预后有关;血清和囊液CA125随着病情程度增加而升高,血清CA125与痛经程度呈正相关,测定CA125有助于EM的诊断及病情、预后的判断。

原头蚴及囊液促进小鼠脾细胞产生IL-2

目的观察细粒棘球绦虫幼虫原头蚴及囊液对体外培养小鼠脾细胞产生IL-22的影响。方法取Balb/c小鼠脾细胞,分别加入不同浓度原头蚴或囊液共培养48 h,检测上清液IL-22表达量及细胞IL-22 m RNA的相对表达量。同浓度原头蚴或囊液分别在0、12、24、36和48 h收集细胞,流式细胞术检测CD4+IL-22+T细胞比例变化。RPMI 1640培养基与脾细胞共培养设为对照组。结果与对照组相比,ELISA和q RT-PCR检测显示在原头蚴为1 000/ml和囊液蛋白质量浓度为2.05 mg/ml时脾细胞产生IL-22增加;流式细胞术检测原头蚴组及囊液组CD4+IL-22+T细胞比例逐渐增加。结论原头蚴及囊液均可促进小鼠脾细胞产生IL-22增加,提示IL-22可能参与宿主防御细粒棘球蚴感染。

自制高吸水性树脂对棘球蚴囊液吸水性能的测试

目的制备淀粉类高吸水性树脂,测试其对棘球蚴囊液吸水性能及影响因素。方法以玉米淀粉和丙烯酸为原料,N,N-亚甲基双丙烯酰胺为交联剂,过硫酸铵为引发剂,采用水溶液聚合法制备淀粉接枝丙烯酸高吸水性树脂。分别测定高吸水性树脂在不同环境温度(37℃、25℃、20℃)、不同粒径对去离子水、0.9%生理盐水、无水酒精和棘球蚴囊液吸水倍率,并测定了不同粒径高吸水性树脂吸水后凝胶的保水性能。并通过光镜观察吸水前后的凝胶结构。结果自制的淀粉类高吸水性树脂在去离子水中瞬时吸水倍率在700倍以上,在棘球蚴囊液中为200～300倍,生理盐水中为25倍左右,在无水乙醇中树脂颗粒几无吸水能力。160～180目大小的颗粒其对去离子水的最大吸水倍率可达到700倍,在4～8min内即可达到吸水高峰;80～120目大小的颗粒吸水倍率亦可达700倍,但在吸水后16min时才达到吸水高峰。160～180目大小的颗粒常压室温(25℃)放置2d保水率为55%,0.5mm×0.5mm×0.5mm颗粒常压室温(25℃)放置5d保水率为58%。20℃、25℃和37℃时同样大小的树脂颗粒其吸水倍率接近。10倍光镜即可观察到树脂颗粒吸液后形成的网格状结构。结论成功制备各种粒径的高吸水性树脂颗粒,其吸水倍率可达700倍;树脂颗粒越小,其吸水速度越快,但保水效果较差;颗粒越大,吸水速度越慢,但保水效果好。温度变化对吸水速率影响不大。溶液性质,尤其是溶液含水量对树脂颗粒吸水率影响较大,因此树脂颗粒在去离子水中吸水倍率最高,其次棘球蚴囊液,生理盐水和对无水酒精几乎无吸水能力。

泡球蚴囊液对原代培养大鼠肝细胞增殖影响的初步研究

目的探讨泡球蚴囊液对体外原代培养大鼠肝脏细胞增殖的影响。方法以Wistar大鼠作肝细胞供者,采用胶原酶肝脏原位灌流消化法分离肝细胞。取1×106肝细胞接种于Ⅰ型胶原铺底35mm培养皿,无血清培养20h后以泡球蚴囊液置换培养液培养24h和48h,期间在荧光倒置显微镜下观察肝细胞形态变化,流式细胞仪测定细胞周期;另取1×105肝细胞接种于Ⅰ型胶原铺底96孔培养板,同上培养,MTT法检测泡球蚴囊液对大鼠肝脏细胞毒性作用。结果与泡球蚴囊液共培养后肝细胞贴壁生长良好,MTT法测定肝细胞存活率为77.5%～100%。培养24h后肝细胞增殖指数(PI)泡球蚴囊液处理组为(49.35±4.00)%,对照组为(82.00±6.00)%;培养48h后两组肝细胞增殖指数(PI)分别为(27.61±6.00)%和(67.00±10.00)%,差异均有显著性(P<0.05)。结论泡球蚴囊液对体外培养大鼠肝细胞无毒害作用,但对肝细胞的增殖有一定的抑制作用。

绵羊牦牛棘球蚴囊液及囊壁抗原的SDS-PAGE分析

本文应用十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对绵羊、耗牛棘球蚴囊液及绵羊棘球蚴囊壁可溶性粗抗原的蛋白组分进行了分析。使用10％凝胶,采用垂直板型电泳、考马斯亮兰R—250染色进行SDS-PAGE的结果表明,绵羊及耗牛棘球蚴囊液分别含有16及11种蛋白组分,分子量范围分别为270～16.5KD及280～17KD;主带均为8条。绵羊棘球蚴囊壁可溶性粗抗原共显示17条蛋白带,分子量范围245～17KD,主带8条。本项研究为进一步分析分离特异性抗原奠定了基础。

棘球蚴囊液对小鼠脾细胞IL-17及Smad2表达的影响

目的:观察细粒棘球蚴囊液对体外培养BALB/c小鼠脾细胞白介素(IL)-17和Smad2基因表达的影响。方法:制备小鼠脾细胞悬液,接种于48孔培养板中进行培养,以不加任何干预为对照组,囊液处理组为实验组。定时取样提取总RNA,经反转录成cDNA后用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测IL-17和Smad2基因的表达。结果:小鼠脾细胞IL-17表达在囊液处理6h和12h后升高(1.000±0.207 VS 3.672±0.746和1.000±0.154 VS 5.525±0.843),差异有统计学意义(P<0.05);小鼠脾细胞Smad2表达在培养1h后升高(1.000±0.077 VS 2.069±0.098)在12h后降低(1.000±0.110 VS 0.247±0.011),差异有统计学意义(P<0.05);协同分析发现IL-17基因与Smad2基因的表达变化呈现负相关(P<0.01),相关系数r=-1。结论:细粒棘球蚴囊液对小鼠脾细胞IL-17和Smad2基因的表达具有上调作用,推测其可能与宿主抗棘球蚴感染的机制有关。

适用于细粒棘球蚴囊液蛋白质组分析的双向电泳技术

目的建立适用于细粒棘球蚴囊液蛋白质组的双向电泳分离条件。方法冷冻干燥法制备囊液总蛋白提取物,观察不同的蛋白样品处理方法、IPG胶条pH范围和电泳上样量对双向电泳图谱的影响。结果经ReadyPrepTM2-D Cleanup Kit处理的提取物上样量为400μg,在pH7-10范围的胶条进行双向电泳分离,可获取蛋白斑点较多、重复性较好的二维电泳图谱。结论建立的细粒棘球蚴囊液双向电泳技术及图谱,可为细粒棘球蚴虫蛋白质组学的研究提供理论依据。

18例单纯性骨囊肿囊液及血清中25(OH)D_3、ALP、BALP、BGP含量的变化及其意义

目的探讨单纯性骨囊肿的发生与骨质吸收的关系及其可能的发病机制，寻找能够反映单纯性骨囊肿活动性的指标。方法对中、小型骨囊肿共13例进行手术治疗，手术时尽量抽取未混有血液的囊液送检验。对5例大型骨囊肿采用X线定位下经皮囊液抽吸，醋酸甲基强的松龙注射治疗，所抽取的囊液送检验。并定期随访，经1～4次治疗后囊腔缩小达到中型骨囊肿标准后再采取手术治疗，手术时仍然抽取囊液检验。在抽取囊液时均同时抽取同侧肢体的静脉血一同检验。同期选择18例年龄相当的儿童作为正常对照组，抽取静脉血检验，并对结果进行对比分析。检验指标均为25-羟胆固醇[25（OH）D3]、碱性磷酸酶（ALP）、骨磷碱性磷酸酶（BALP）和骨钙素（BGP）。结果ALP、BALP、BGP的含量，大型骨囊肿囊液明显高于中、小型骨囊肿囊液，而中、小型骨囊肿囊液明显高于患儿血液，25（OH）D3的含量则刚好相反，各组比较均有统计学意义（P〈0．05）。患儿血液和正常对照组儿童血液中以上指标的含量差异无统计学意义。结论单纯性骨囊肿囊液内的25（OH）D3、ALP、BALP、BGP等可以作为判断单纯性骨囊肿活动性的重要指标。单纯性骨囊肿的形成是由多种因素共同作用的结果。

绵羊棘球蚴囊液抗原在IHA中的特异性研究

本研究应用粗制绵羊包囊液作抗原致敏经戊二醛处理的鞣酸化绵羊红细胞,进行微量间接血凝试验(IHA),检测棘球蚴病羊血清400份、健康羊血清45份、细颈囊尾蚴病羊血清13份、肝片吸虫病羊血清21份、边虫病羊血清20份、多头蚴病羊血清1份,阳性反应率依次为83.1％、13.33％、33.46％、4.35％、0％、0％。以40％饱和硫酸铵盐析抗原对上述健康羊血清、细颈囊尾蚴病羊血清及96份棘球蚴病羊血清的检测结果依次为13.33％、38.46％、87.5％。对分段盐析的其他组份及葡聚糖凝胶层析抗原、醋酸盐析抗原、牦牛肺包囊液抗原、鼠包囊液抗原也进行了初步试验,均未获得满意结果。