法氏囊三肽囊素(Bursin)的研究Ⅰ.抗 Bursin 单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

以戊二醛法制备ＢｕｒｓｉｎＫＬＨ，免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，取脾细胞，以ＰＥＧ为融合剂，与ＳＰ２融合，用间接ＥＬＩＳＡ法筛选出与Ｂｕｒｓｉｎ－ＢＳＡ结合、不与ＢＳＡ结合的２Ｆ９－４克隆株，经鉴定，抗体属性为ＩｇＭ，Ｋ轻链。水溶性Ｂｕｒｓｉｎ可阻抑２Ｆ９－４对鸡法氏囊的反应，切片标本经ＰＢＳ处理，反应性消失，免疫组织化学染色于法氏囊上获得特征性阳性结果。

三肽囊素对鸡脾脏淋巴细胞增殖转化、IL-2和IL-6分泌及其基因表达的影响

为探讨人工合成的三肽囊素(BS)作为新型免疫增强剂的作用机制,本研究采用MTT比色法、放射免疫测定法(RIA)和相对半定量RTPCR法,分别研究了BS对体外培养的鸡脾脏淋巴细胞的增殖、对白细胞介素2(IL2)和白细胞介素6(IL6)分泌及其mRNA表达水平的影响。试验结果表明,0.5μg/ml、5μg/ml和50μg/mlBS处理36h,均可显著提高ConA诱导的脾脏淋巴细胞的增殖反应性;5μg/mlBS处理能显著促进脾脏淋巴细胞分泌IL6,显著升高IL6mRNA表达水平,但对IL2的分泌及其mRNA表达水平无显著影响。本研究结果进一步提示,BS可能主要通过激活IL6基因的表达和促进脾脏淋巴细胞的增殖反应。

三肽囊素对环磷酰胺诱导的免疫器官细胞凋亡的影响

研究了三肽囊素对环磷酰胺诱导的鸡免疫抑制模型中免疫器官细胞凋亡的影响。将 180只 1日龄粤黄鸡随机分成环磷酰胺组、正常对照组、三肽囊素组以及三肽囊素 +环磷酰胺组。利用末端脱氧核苷酸转移酶介导的 d TUP缺口末端标记法 (TUNEL) ,对不同组鸡的免疫器官细胞凋亡进行计数。结果发现 ,环磷酰胺组细胞凋亡数比对照组明显增多 (P<0 .0 5 ) ,而三肽囊素 +环磷酰胺组细胞凋亡数显著少于环磷酰胺组 (P<0 .0 5 ) ;三肽囊素组的细胞凋亡数比环磷酰胺组少 ,且差异显著 (P<0 .0 5 )。由此可知 ,三肽囊素对环磷酰胺所诱导的细胞凋亡具有抑制作用。

乳酸杆菌和囊素三肽对肉鸡生长性能、屠宰性能、肉质和血清生化指标的影响

本试验通过在基础饲粮中添加乳酸杆菌制剂或肌肉注射囊素三肽,研究乳酸杆菌和囊素三肽对肉鸡生长性能、屠宰性能、肉质和血清生化指标的影响。选用1日龄科宝肉鸡180只,随机分成4组,每组3个重复,每个重复15只鸡。Ⅰ组饲喂基础饲粮;Ⅱ组饲喂基础饲粮,并肌肉注射囊素三肽(0.01 mg/kg BW);Ⅲ组饲喂基础饲粮+0.1%乳酸杆菌制剂;Ⅳ组饲喂基础饲粮+0.1%乳酸杆菌制剂,并肌肉注射囊素三肽(0.01 mg/kg BW)。试验期42 d。结果表明:1)Ⅱ和Ⅳ组平均日采食量极显著高于Ⅰ和Ⅲ组(P<0.01),但平均日增重和料重比组间差异不显著(P>0.05)。2)Ⅱ组半净膛率极显著高于Ⅰ组(P<0.01),各组屠宰率、全净膛率、胸肌率、腿肌率差异均不显著(P>0.05)。3)Ⅱ和Ⅲ组肉色优于Ⅰ和Ⅳ组,各组pH差异不显著(P>0.05),Ⅱ和Ⅳ组滴水损失极显著高于Ⅰ和Ⅲ组(P<0.01),Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ组剪切力均极显著低于Ⅰ组(P<0.01)。4)Ⅲ组血清中总蛋白和白蛋白含量显著高于Ⅰ组(P<0.05),Ⅲ和Ⅳ组血清中甘油三酯含量显著低于Ⅰ组(P<0.05)。综合各项指标证明,乳酸杆菌和囊素三肽在一定程度上有提高肉鸡生长性能和屠宰性能的作用,并能改善肉鸡肉质及血清生化指标,但两者联合使用的效果并未优于单独使用。

囊素和法氏囊超滤物对杂交瘤细胞抗体分泌的影响

以分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞为对象,通过间接ELISA法测定抗体的OD490值。结果表明,随着囊素和法氏囊超滤物浓度的增加,细胞抗体分泌逐渐增加,当囊素浓度为50μg/mL、超滤物浓度为2.5mg/mL时,OD490值达到最高,分别比对照组增加8.83％和5.72％（P<0.01）;随着浓度的继续增加,OD490值开始下降。同时观察到,处理48h后,500μg/mL囊素组和5mg/mL法氏囊超滤物组有部分细胞死亡,1000μg/mL囊素组及40,20,10mg/mL法氏囊超滤物组细胞全部死亡,其它组细胞正常。动态试验表明,加入50μg/mL囊素后3h,OD490值增加最高,达24.93％（P<0.01）。因此,囊素和法氏囊超滤物能直接与杂交瘤细胞作用,并提高其抗体分泌水平。

囊素对猪口蹄疫灭活疫苗的免疫增强作用

用提取的天然囊素（10ug／mL）和O型口蹄疫灭活疫苗协同免疫45日龄仔猪，研究了其对。型口蹄疫灭活疫苗免疫效果及仔猪增重的影响。将32头健康45日龄仔猪随机分为4组，0．5mL疫苗＋囊素免疫2次（Ⅰ）组、1、0mL疫苗＋囊素免疫2次（Ⅱ）组、1．0mL疫苗＋囊素免疫1次（Ⅲ）组和1．0mL疫苗免疫2次（Ⅳ）组（疫苗对照组），用液相阻断酶联免疫吸附试验（LB—ELISA）检测各组猪免疫前及一免后第14、28、42、60、74、88、102d的口蹄疫血清抗体效价并称重。结果。Ⅱ组抗体水平显著高于Ⅳ组（P〈0．01），Ⅰ组、Ⅲ组和Ⅳ组间差异不显著（P〉0．05）；一免后第60～110d仔猪平均日增重囊素组明显高于对照组（P〈0．05）。结果表明，囊素可以提高口蹄疫灭活疫苗的免疫原性，提高猪增重，促进生长发育。

枯草芽胞杆菌和三肽囊素对肉鸡生长性能、血液生化和抗氧化指标的影响

选取144只1日龄科宝-500肉鸡,随机分为4组,每组3个重复,每个重复12只。对照组(Ⅰ)和三肽囊素组(Ⅱ)饲喂基础饲料,枯草芽胞杆菌组(Ⅲ)和枯草芽胞杆菌加三肽囊素复合组(Ⅳ)在基础饲料中添加枯草芽胞杆菌1.0×106cfu/g,Ⅱ、Ⅳ组在4日龄和7日龄注射0.01 mg/kg的三肽囊素,试验期为42 d,探讨枯草芽胞杆菌与三肽囊素对肉鸡生长性能、血液生化和抗氧化指标的影响。结果表明:与对照组相比,Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ组试验前期和全期日增质量显著提高(P<0.05),Ⅳ组料重比最低,较对照组降低4.37%(P>0.05);21日龄时,Ⅲ、Ⅳ组血清总蛋白含量分别比对照组提高19.60%、27.68%(P<0.05),白蛋白含量分别比对照组提高16.72%、18.03%(P<0.05);21日龄的Ⅲ组和42日龄的Ⅳ组的CAT、GSH-Px酶活力显著高于对照组(P<0.05),42日龄时试验组血清MDA显著低于对照组。由此可见,添加枯草芽胞杆菌及其与三肽囊素联合应用能改善肉鸡生长性能,提高血清总蛋白和白蛋白含量,增加CAT和GSH-Px的酶活力。

囊素三肽的基因克隆和表达

以合成的BS1、BS2为引物扩增囊素三肽(BS)8串联片段(BS8),克隆至pBAD/Thio-TOPO载体,用pBAD/TOPO○RThio大肠杆菌表达系统进行表达,含BS8融合蛋白的分子量大小约为19kD,BS8融合蛋白主要以可溶形式存在。用蛋白质纯化树脂50%Ni-NTA纯化融合蛋白,高纯度的融合蛋白经透析除咪唑、浓缩后,再经胰蛋白酶水解获得大量BS单体。高压液相色谱分析表明,经过DEAE阴离子交换层析,获得纯化的BS单体。

法氏囊三肽囊素在鸭体中的组织学定位及功能的研究

以抗法氏囊三肽素(Bursin)单抗,采用免疫组化法及个体发生早期以该单抗阻抑Bursin效应,检测Bursin在鸭体定位分布及其受阻抑后所致生物学效应。结果表明,BF髓质内周缘呈现阳性细胞层、髓质中央部分有稀少阳性细胞、FAE及FAESE呈阳性、IFSE中阳性细胞散在性呈团簇状分布;Th中阳性细胞相对集中于髓质中类似Hassall小体的区域或较高密度弥散于髓质中;Sp中阳性细胞弥散于GC中或无特征性散在性分布;HG中阳性细胞呈团块状散在分布于腺泡、腺管基底膜中;LN则阳性细胞特征性存在于淋巴小结中,少数散在淋巴细胞聚集区或淋巴组织索中。不同剂量抗Bursin单抗对鸭体细胞免疫功能有较强阻抑效应,高浓度单抗阻抑作用更显著(P<0 01);对体液免疫功能亦有较强阻抑效应,不同剂量单抗间未见显著差异(P>0 05);对BF指数有较强影响,高剂量组更明显(P<0 05),且高剂量对Sp指数有一定影响;较强地抑制BF滤泡发育,高剂量组BF发育更不良。

信号转导抑制剂对囊素刺激杂交瘤细胞抗体分泌及其mRNA表达的影响

以杂交瘤细胞为模型 ,在培养液中加入不同的信号转导抑制剂和囊素 ,用间接ELISA法测定抗体分泌水平 ,用定量RT PCR法检测抗体mRNA的表达水平。结果表明 ,加入Gα 蛋白选择性抑制剂NF 0 2 3、蛋白激酶C抑制剂GF10 92 0 3X、磷脂酰肌醇 3激酶抑制剂heparin、Ca2 + /calmodulin依赖蛋白激酶Ⅱ抑制剂KN 6 2、磷脂酶C抑制剂U 7312 2和蛋白激酶G抑制剂后 ,囊素对杂交瘤细胞抗体分泌速度的影响明显 (P <0 0 1)。而加入蛋白激酶A抑制剂 4 Cyano 3 M thylisoquinoline、酪氨酸蛋白激酶抑制剂 genistein和丝裂原活化的蛋白激酶抑制剂PD 980 5 9后 ,囊素对杂交瘤细胞抗体分泌速度的影响不明显 (P >0 0 5 ) ,这 3种抑制剂对杂交瘤细胞抗体分泌速度的抑制率分别为 74 5 5 % ,91 13%和80 6 9%。加入 4 Cyano 3 M thylisoquinoline、genistein和PD 980 5 9后 ,囊素处理组与对照组γ1mRNA的表达水平差异不显著 (P >0 0 5 ) ,说明这 3种抑制剂阻断了囊素刺激的杂交瘤细胞抗体mRNA的表达。以上结果表明 ,蛋白激酶A、酪氨酸蛋白激酶和丝裂原活化的蛋白激酶参与了囊素在杂交瘤细胞中的信号转导。

噬菌体展示三肽囊素模拟肽的研究

本研究分离纯化抗Bursin单克隆抗体(2F9_4/HU2),利用噬菌体环7肽库筛选抗Bursin单克隆抗体(2F9_4/HU2)结合肽,测定阳性克隆ssDNA序列,并与Bursin序列进行同源性分析,通过ELISA法检测其结合活性和竞争ELISA法检测其抗原性,以Busin为对照,验证阳性克隆(№4)在鸡体内的生物学效应。序列分析表明,“LNXT”短肽序列可能为结合抗Bursin单克隆抗体(2F9_4/HU2)的保守序列,但与Bursin无同源性;噬菌体(№1)在序列中含有K、H、G。ELISA和竞争ELISA检测,表明Bursin对阳性克隆1、4、5、6号和抗Bursin单克隆抗体(2F9_4/HU2)的结合有一定的抑制作用:生物学活性初步验证表明,阳性克隆(№4)与Bursin具有类似作用,能促进抗体产生,有望成为一种模拟Bursin新型的免疫增强剂。

三肽囊素Bursin对鸭疫里氏杆菌病灭活苗免疫效果的影响

选择240枚静脉清晰的13日龄樱桃谷鸭胚,随机分成Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ共4组,每组60枚,第Ⅰ组为生理盐水对照组,第Ⅱ组为低浓度(10-6μg/mL)Bursin组,;第三组为中浓度( 10-3μg/mL)组,第四组为高浓度( 10-2μg/mL)组,皆于13日胚龄时分别静注生理盐水和不同浓度Bursin各0. 1mL/胚。以酶联免疫吸附试验(ELISA)检测各组鸭出壳后0、14、21、30、36、42日龄时的鸭疫里氏杆菌抗体效价。结果表明,低浓度Bursin对鸭疫里氏杆菌抗体的产生有较强的促进作用,而中、高剂量Bursin反而有一定的阻抑效应。

囊素对哺乳动物免疫促进作用的研究 Ⅱ.不同剂量囊素对猪瘟疫苗接种猪抗体水平的影响

囊素是一种新型的免疫活性物质 ,为了研究其对哺乳动物的免疫促进作用 ,探索正确的使用方法。作者采用不同剂量 (0 .0 3 ,0 .0 6,0 .0 9m L/ kg)囊素与猪瘟疫苗同时接种 3 0日龄仔猪进行试验。在接种后 2周内 ,试验猪没有出现异常临床反应 ,表明囊素与猪瘟疫苗同时使用无不良影响。在接种后 6周内 ,每隔一周检测各组猪瘟抗体水平。结果表明 :囊素按 0 .0 6m L /kg和 0 .0 9m L/ kg剂量与猪瘟疫苗同时使用组其抗体水平明显高于对照组。通过抗体水平比较及统计学分析 ,表明囊素最佳使用剂量为0 .0 6m L/ kg。

三肽囊素对环磷酰胺诱导的鸡红细胞免疫功能低下的阻断作用

本文研究了三肽囊素对环磷酰胺诱导的墟岗黄鸡红细胞免疫功能的抑制模型的影响。180只一日龄墟岗黄母鸡随机分成对照组,三肽囊素组,三肽囊素+环磷酰胺组,环磷酰胺组四个组,三肽囊素组和环磷酰胺+三肽囊素组每只鸡肌注0.01mg/kg剂量的三肽囊素;环磷酰胺组和环磷酰胺+三肽囊素组每只鸡肌注40mg/kg剂量的环磷酰胺,对照组鸡注射等量的生理盐水。结果表明,14日龄和35日龄时各试验组鸡的红细胞总数没有显著差异,而在56日龄时,环磷酰胺组显著低于其它三组(P<0.05);从14日龄开始,环磷酰胺纽的RBC-C3bR花环率显著低于其它三组,而环磷酰胺组的RBC-IC花环率显著高于其它三组,并持续到实验结束。结果提示,三肽囊素可阻断由环磷酰胺诱导的鸡红细胞免疫功能低下。

禽法氏囊三肽囊素免疫生物学及其同功能单链抗体研究进展

法氏囊 ( BF)是禽类特有的免疫器官 ,为 B细胞发育、成熟提供微环境 ,是免疫球蛋白基因转变场所 ;其免疫活性物质为三肽囊素( Bursin) ;它不仅分布于 BF,还存在于胸腺Hassall小体、哈德氏腺、脾脏、BF T细胞区及骨髓 ;它能诱导家禽和哺乳动物 B细胞前体分化 ;其靶器官是 BF,能够拮抗 IBD疫苗对 BF的损伤 ,提高 ND弱毒疫苗及油苗产生抗体水平 ;人工合成 Bursin作用的靶器官也是 BF,可促进BF发育、抗体的产生。

三肽囊素(Bursin)模拟肽阳性噬菌体对新城疫疫苗免疫效果的影响

研究了两个噬菌体展示三肽囊素模拟肽阳性噬菌体的活性。将100羽1日龄罗曼鸡随机分成5组(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组),每组20羽,在2日龄时,Ⅰ组注射4号阳性噬菌体(滴度为211),Ⅱ组注射6号阳性噬菌体(滴度为211),Ⅲ组注射6号阳性噬菌体(滴度为29),Ⅳ组注射一定剂量的Bursin,Ⅴ组为TBS对照组,在8日龄时接种新城疫(ND)Ⅳ系苗,以后每隔1周采用微量血凝抑制试验和MTT法测定各组的免疫效应。结果表明:阳性克隆(4号和6号)与Bursin在动物试验上具有相似的免疫增强作用,能提高体液免疫水平,对细胞免疫也有提高,且这种促进作用的大小与所用噬菌体滴度有关。

定向偶联制备三肽囊素人工抗原及其多克隆抗体的研制

为研制三肽囊素(Bursin,KHG-NH2,BS)抗体,采用EDC法将三肽囊素分子赖氨酰(K)上的氨基与载体蛋白(BSA、OVA)定向偶联,分别制备免疫抗原(BSA-KHG-NH2)和检测抗原(OVA-KHG-NH2)。以BSA-KHG-NH2免疫5只BALB/c小鼠,经4次免疫后,均产生了较高的抗体水平,其中5号小鼠血清抗体效价达1∶125 000。免疫小鼠血清多克隆抗体与检测抗原的结合不仅能被三肽囊素阻断,而且能被GKHG-NH2四肽特异性阻断,但不能被KHGK四肽阻断,表明本试验制备的三肽囊素人工抗原是由载体蛋白的羧基与三肽囊素分子赖氨酰(K)上的氨基定向偶联而成。利用小鼠多克隆抗体建立了三肽囊素间接竞争ELISA检测方法,线性范围为15～1 000 ng/mL,IC50为160 ng/mL。