一氧化氮在小鼠囊胚发育和孵化中的调控作用

目的研究一氧化氮(NO)在小鼠囊胚发育和孵化中的调控作用和机制。方法从妊娠第2.5天雌鼠子宫角获取桑葚胚进行体外培养48 h。胚胎培养液中分别添加不同浓度N-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME)或硝普钠(SNP),以及L-NAME与SNP联合添加。分别于第4天和第5天统计囊胚发育率和孵化率,激光扫描共聚焦显微镜观察统计囊胚总细胞数和活化型含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(caspase 3)表达。结果随着L-NAME和SNP浓度增加,囊胚发育率、孵化率和囊胚总细胞数显著降低。在5 mmol/L L-NAME培养液中添加10 nmol/L SNP可显著提高囊胚发育率和孵化率;但随着SNP浓度增加,囊胚发育率和孵化率显著降低。L-NAME对囊胚细胞中活化型caspase 3表达没有显著影响,而500 nmol/L以上浓度SNP可显著提高囊胚细胞中活化型caspase 3表达,促进囊胚细胞凋亡。结论 NO在小鼠囊胚发育和孵化中可发挥重要的调控作用,囊胚细胞中NO浓度过低或过高都将会影响卵裂球分裂,降低囊胚发育率和孵化率,且过高浓度NO会引起囊胚细胞凋亡。

哺乳动物囊胚孵化调控机制的研究进展

哺乳动物囊胚在植入前,需从透明带中孵化出来才具有侵入子宫内膜的能力。囊胚孵化失败将引起女性不孕。囊胚孵化是一个受多因素精确调控的复杂过程,目前已发现的参与囊胚孵化的调控分子和信号通路,包括蛋白酶、环氧合酶-2、p38丝裂原活化蛋白激酶、激活素A和Wnt信号通路等。该文综述了有关因素对囊胚孵化的调控机制以及目前常用的囊胚辅助孵化的方法,为进一步阐明囊胚的孵化机制,为临床上对由于囊胚孵化失败引起女性不孕的治疗提供理论基础。

小鼠孵化囊胚细管法和OPS法玻璃化冷冻保存技术的研究

利用小鼠孵化囊胚为模型 ,为猪孵化囊胚的冷冻保存摸索适宜的方法和条件 :在 2 5和 37℃条件下 ,用不同含量的玻璃化溶液 (EFS和EDFS) ,对小鼠孵化囊胚实施细管法和OPS法冷冻保存。在 2 5℃条件下 ,细管一步法冷冻保存后的囊胚恢复率仅为 32 5 %～ 74 4 % ,与对照组 (10 0 % )差异极显著 (P <0 0 1) ;而细管二步法冷冻组用方法C解冻后 ,孵化囊胚恢复率达 87 0 % ,为细管法最佳组 ,但仍与对照组有显著差异 (P <0 0 5 )。在 37℃条件下 ,改用OPS法冷冻后 ,以方法A脱出抗冻保护剂 ,孵化囊胚恢复率最高值为 87 2 % (P <0 0 5 )。当采用EDFS30和EDFS4 0对孵化囊胚冷冻保存后 ,以方法C脱出抗冻保护剂 ,恢复率分别高达 97 8%和 93 3% (P >0 0 5 )。利用细管法和OPS法 2种最佳冷冻 -解冻组获得的 133和 15 4枚胚胎 ,分别移植给 12和 10只假妊娠 3～4d的受体母鼠。使 2种冷冻方法均有 6只妊娠 ,各产仔 2 2和 36只 ,产仔率分别为 35 5 %和 39 1% ,与对照组(39 8% )差异均不显著 (P >0 0 5 )。证明 2种方法对胚胎冷冻后均起到了保护作用。

程序化冷冻前后小鼠孵化囊胚和休眠胚胎的Hba-α蛋白分布和差异表达

目的利用程序化冷冻的方法,探究冷冻前、后小鼠孵化囊胚和休眠胚胎中Hba-α蛋白的分布和差异表达的变化,为今后开发和利用新型哺乳动物源抗冻蛋白提供理论依据。方法从妊娠d5小鼠体内获取孵化囊胚;从小鼠延迟着床模型获取休眠胚胎,利用Confocal显微镜和Western Blot技术对程序化冷冻前、后的各组胚胎进行Hba-α蛋白的分布和表达检测。结果孵化囊胚和休眠胚胎在程序化冷冻前、后均有Hba-α蛋白的表达;孵化囊胚经程序化冷冻后Hba-α蛋白的表达与冷冻前相比差异无显著性(P>0.05);冷冻前休眠胚胎与程序化冷冻前后的孵化囊胚相比,Hba-α蛋白的表达量显著下调(P<0.05);冷冻后休眠胚胎Hba-α蛋白的表达量显著低于其他各组(P<0.05)。结论程序化冷冻处理对小鼠休眠胚胎Hba-α蛋白的表达影响明显大于孵化囊胚;Hba-α基因具有作为新型哺乳动物源抗冻蛋白的潜力。

溶菌酶1在小鼠超数排卵前后孵化及休眠囊胚中差异表达的研究

目的研究溶菌酶1(lysozyme 1,LYZ1)基因在超数排卵前后小鼠孵化囊胚和休眠胚胎中的分布以及表达,探究动物胚胎着床过程中新的调节机制。方法从妊娠5 d ICR小鼠体内获取的正常孵化囊胚和超排囊胚,利用小鼠延迟着床模型于妊娠第8天获取休眠胚胎和超排休眠胚胎。利用免疫荧光和Western Blot方法检测LYZ1蛋白在四组胚胎中的分布和差异表达变化。结果 LYZ1在超数排卵前、后小鼠孵化囊胚和休眠胚胎中均有表达,且主要集中在内细胞团中,滋养层细胞和胞质中少见分布;与未进行超排的小鼠相比,LYZ1蛋白在超排后小鼠胚胎中表达量显著上调,与未营造休眠模型的小鼠相比,LYZ1蛋白在休眠模型小鼠胚胎中的表达量显著上调。结论 LYZ1蛋白在囊胚内细胞团中表达,可能参与调节胚胎内细胞团的发育;LYZ1蛋白在超排-休眠胚胎中的高表达,说明LYZ1蛋白在休眠和超数排卵的双重影响下,会因为抵御不利环境而上调。

家兔孵化囊胚玻璃化冷冻保存技术的研究

采用两种方法对家兔孵化囊胚作玻璃化冷冻保存：在 25℃室温下，将孵化囊胚直接移入 EFS40溶液中短时间平衡后，直接投入液氮中冷冻保存 (简称一步法 )；或将胚胎在 10％或 20％ EG溶液中经预处理后，再移入 EFS40溶液冷冻保存 (简称二步法 )。结果表明，一步法冷冻后的胚胎发育率为 68％，与对照组 (鲜胚 )的差异极显著 (P0. 05)。但无论是冻胚还是鲜胚，移植后均未获得产仔。

冷冻前后的低渗应激对小鼠孵化囊胚存活率的影响

本试验用10%或20%GL预处理5min,再移入GFS40中平衡0.5min二步法冷冻保存的小鼠孵化囊胚,解冻后24h内恢复率高达93%—97%,与对照组(99%)相比无显著差异(P>0.05)。新鲜孵化囊胚在低渗液中平衡30min,0.25×PBS组恢复率达92%,而0.20×PBS组恢复率仅为50%,与对照组相比差异极显著(P<0.01)。冷冻解冻后孵化囊胚直接进行低渗处理,结果0.50×PBS组的恢复率(72%)与对照组(88%)差异显著(P<0.05),而0.30×、0.25×和0.20×PBS组的恢复率分别为58%、11%和0%。解冻后经培养的孵化囊胚对低渗处理的耐受力增强,0.50×PBS处理组的恢复率达94%,与对照组(98%)相比无显著差异(P>0.05),0.30×、0.25×和0.20×PBS组的恢复率与对照组相比虽有极显著差异(P<0.01),但与解冻后直接进行低渗处理组相比恢复率有较大提高(82%—26%)。

通过优化超排后合笼时间高效获取小鼠孵化囊胚

本试验旨在优化小鼠超排后的合笼时间,高效获取小鼠孵化囊胚。试验选用150只ICR系8周龄雌性小鼠,随机分为5组,同一时间超排处理后雌、雄按1∶1于18∶00、19∶00、20∶00、21∶00合笼过夜,次日上午08∶00查栓,发现阴道栓这为妊娠第1天(D1)。取妊娠第5天(D5)小鼠处死,剪取双侧子宫角,冲取胚胎。统计每组冲取胚胎的总数及孵化囊胚/未孵化囊胚的比值,作为胚胎获取效率的评价指标;统计内细胞团数/滋养外胚层细胞团数,作为评价胚胎质量的参考指标。结果发现,在数量上组Ⅰ、组Ⅱ、组Ⅲ囊胚数差异不显著(P>0.05),但有增高趋势,组Ⅳ囊胚数显著高于其他3组(P<0.05)。组Ⅰ、组Ⅱ、组Ⅲ、组Ⅳ内细胞团数/滋养外胚层细胞团数分别为23.18%、23.55%、21.72%和23.28%,各组间差异不显著(P>0.05)。结果表明,组Ⅳ所对应的合笼时间获取小鼠孵化囊胚获取效率最高,胚胎囊胚质量无明显差异。

小鼠孵化囊胚及其休眠胚胎程序化冷冻-解冻前后Mgst1基因的差异表达

目的通过对比小鼠孵化囊胚以及其休眠胚胎程序化冷冻并解冻处理前后Mgst1基因的相对表达情况,以及Mgst1蛋白的差异表达分布情况,分析Mgst1基因在小鼠胚胎程序化冷冻过程中发挥的作用,为胚胎抗冻机理研究提供新的理论基础。方法使用激光共聚焦扫描显微镜采集Mgst1蛋白在胚胎中表达分布的免疫荧光图像;使用qRT-PCR技术鉴定Mgst1基因在胚胎中的相对表达量。结果通过免疫荧光图像发现,Mgst1蛋白在小鼠冷冻前后的孵化囊胚与休眠胚胎中均有表达;通过qRT-PCR发现,冷冻前的孵化囊胚与休眠胚胎的Mgst1基因相对表达无显著差异(P>0.05);冷冻后的孵化囊胚Mgst1基因相对表达量较冷冻之前显著上调(P<0.05);冷冻后的休眠胚胎Mgst1基因相对表达量较冷冻之前极显著上调(P<0.01);冷冻后的休眠胚胎Mgst1基因相对表达量较冷冻后的孵化囊胚显著上调(P<0.05)。结论Mgst1基因可能在小鼠胚胎抗冻机制中发挥着重要的正调控作用。

胚胎因素对奶牛体外受精胚胎解冻孵化影响的试验研究

对胚胎因素影响奶牛体外受精胚胎培养效果进行了研究。结果发现:在胚胎因素中,胚胎类型(冻胚和鲜胚)与胚胎发育阶段对胚胎培养效果没有显著影响(P>0.05);冷冻胚胎解冻后停留时间对胚胎培养效果影响显著(P<0.01);冷冻胚胎解冻后胚胎等级对胚胎培养效果影响显著(P<0.05),解冻后A级胚胎存活率(80%,128/160)、囊胚孵化率(58.75%,94/160)显著高于B级胚胎存活率(59.38%,95/160)和囊胚孵化率(37.5%,60/160)(P<0.05);解冻水浴温度(20℃、30℃)对培养效果有极显著影响(P<0.01)。

一氧化氮抑制剂对金黄地鼠体外囊胚培养中囊胚孵出的影响

目的观察一氧化氮合酶抑制剂(L-NAME)对金黄地鼠的囊胚孵出的影响。方法将金黄地鼠受精卵分为两组,对照组将受精卵置入M199培养液中,实验组在M199培养液中添加L-NAME,培养96h后比较对照组和实验组囊胚的孵化率及囊胚总细胞数、NO产生量、组织蛋白酶cathepsin L和cathepsin P mRNA的表达量。结果与对照组相比,实验组中囊胚孵化率[(23.5±4.7%)vs.(78.2±2.6%)]、NO的产生量[(4.5±0.5)μmol/L vs.(7.2±0.7)μmol/L]以及囊胚的总细胞数[(31.0±4.1)vs.(47±3.5)]均显著降低(P<0.05)。实验组中cathepsin L[(0.25±0.07)vs.(0.70±0.08)]和cathepsin P mRNA[(0.35±0.05)vs.(0.86±0.12)]的表达量明显低于对照组(P<0.05)。结论 L-NAME抑制NO的产生,降低cathepsin L和cathepsin P mRNA的表达水平,最终导致囊胚孵化率的降低。

奶牛早期妊娠免疫调控机制的研究进展

奶牛自身免疫反应是影响早期妊娠胚胎丢失的重要因素之一。妊娠的建立和胎盘的发育依赖于免疫细胞(Tregs细胞、巨噬细胞、NK细胞等)和免疫调节因子的共同作用,来实现子宫对胚胎的容受性、胚胎植入以及妊娠母体的免疫耐受性。因此,深入了解奶牛妊娠早期各个阶段的免疫反应过程,对提高妊娠率至关重要。本文系统阐述了奶牛授精及妊娠早期的免疫调控机制,分析了母体促炎因子与抗炎因子之间的平衡及复杂的动态调节过程。这些研究为保证奶牛从受精、囊胚孵化、妊娠识别到胚胎着床等关键阶段的妊娠顺利提供理论支持,皆在推动奶牛繁育效率的提升。

脑源性神经营养因子在着床前小鼠胚胎中的表达及其对胚胎发育的影响

目的检测脑源性神经营养因子（BDNF）及其受体TrkB在植入前胚胎中的表达情况,探讨BDNF对小鼠早期胚胎发育和着床过程中的作用。方法收集小鼠受精后1～4d的胚胎,利用免疫组化和逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测BDNF及其受体TrkB在各阶段胚胎中的表达情况。将2细胞阶段的胚胎放入添加不同浓度的BDNF的培养基中,添加或不添加TrkB受体阻断剂k252a/k252b,观察胚胎发育情况,并对形成的囊胚进行细胞计数。在注射人绒毛膜促性腺激素（HCG）后72h、76h、84h和88h分别腹腔注射10μg K252a/k252b,收集胚胎,计算扩张期囊胚数和囊胚细胞数。结果 BDNF及TrkB均表达于小鼠植入前各阶段的胚胎中,在培养基中添加BDNF后能够促进小鼠胚胎的体外发育,能够提高囊胚形成率和囊胚孵化率,并能够提高滋养层细胞数,此作用能够通过TrkB受体阻断剂k252a而阻断。体内研究进一步证实,k252a处理后能够抑制囊胚细胞数而明显抑制早期胚胎发育。结论 BDNF/TrkB信号系统可能通过某种自分泌或旁分泌的作用方式促进植入前胚胎的发育,同时也可能参与胚胎的着床过程。

几种辅食喂养对昆明小鼠胚胎的影响

为了提高昆明小鼠不同发育阶段的胚胎质量,在对成年昆明小鼠繁育研究中,对照组用全价颗粒饲料喂养,实验组分别添加麦芽、瓜籽和速补-18喂养,分别在D4、D8和出生后观察每组小鼠的妊娠阳性率,D4孕小鼠产生的平均囊胚数目、小鼠囊胚形态、贴壁率、扩展率及其子宫形态;D8和出生后观察胚胎着床数。结果表明,添加速补组的妊娠阳性率、囊胚孵化率、贴壁率、扩展率和胚胎着床数明显高于其它实验组。

添加植物抗冻蛋白提高猪胚胎冷冻保存成活率的初步试验

本试验采集7天猪扩张囊胚和孵化后囊胚,在1.5M甘油冷冻液中添加二种浓度(0.5mg/ml,5mg/ml)植物抗冻蛋白(AFGPs),用慢速降温方法冷冻。猪胚胎冷冻-解冻后,体外培养12小时,发育率分别为25％(1/4)和80％(4/5);24小时发育率分别为0％(0/4)和40％(2/5),孵化囊胚率分别为0％(0/5)和20％(1/5),而对照组冷冻-解冻后培养发育率12小时和24小时均为0％(0/4)。试验表明,在冷冻液中添加一定浓度的植物抗冻蛋白,可提高猪胚胎冷冻-解冻后的成活率。

程序化冷冻前后小鼠休眠胚胎中Apol8蛋白分布和表达

旨在研究小鼠孵化囊胚和休眠胚胎程序化冷冻前、后Apol8蛋白定位和相对表达量变化。通过超排技术获取小鼠体内孵化囊胚,通过小鼠延迟着床模型获取休眠胚胎,通过Confocal显微镜和Western Blot技术对孵化囊胚和休眠胚胎程序化冷冻前后Apol8蛋白的分布和表达进行检测。结果表明:作为抗冻潜力蛋白,在程序化冷冻前、后孵化囊胚和休眠胚胎Apol8均有表达。程序化冷冻后孵化囊胚中Apol8的表达量是冷冻前1.2倍(P<0.01),程序化冷冻后休眠囊胚中Apol8的表达量是冷冻前2.0倍(P<0.01),程序化冷冻后休眠胚胎Apol8表达量是冷冻后孵化囊胚的1.25倍(P<0.01)。程序化冷冻后休眠胚胎Apol8相对表达量变化明显大于孵化囊胚,Apol8蛋白具有作为新型哺乳动物源抗冻蛋白的潜力。

影响奶牛体外受精胚胎培养效果的胚胎因素

对胚胎因素影响奶牛体外受精胚胎培养效果进行了研究。结果发现,在胚胎因素中,胚胎类型(冻胚和鲜胚)与胚胎发育阶段对胚胎培养效果没有显著影响(P>0.05);冷冻胚胎解冻后停留时间对胚胎培养效果影响极显著(P<0.01);冷冻胚胎解冻后胚胎等级对胚胎培养效果影响显著(P<0.05),解冻后A级胚胎存活率(80%,128/160)、囊胚孵化率(58.75%,94/160)显著高于B级胚胎存活率(59.38%,95/160)和囊胚孵化率(37.5%,60/160)(P<0.05);解冻水浴温度(20℃、30℃)对培养效果有极显著影响(P<0.01)。