顶空气相色谱法测定四价脑膜炎球菌多糖蛋白结合疫苗中残余二氧六环

目的建立并验证四价脑膜炎球菌多糖蛋白结合疫苗中残余二氧六环的检测方法。方法采用顶空气相色谱法,样品中加入碳酸钠固体,产生"盐析"效应,以增加二氧六环在顶空瓶中的浓度。通过HP-5毛细管柱(30 m×0.32 mm×0.25μm,5%Phenyl Methyl-Siloxane),氢火焰检测器测定四价脑膜炎球菌多糖蛋白结合疫苗中残余二氧六环。结果二氧六环平均回收率及变异系数分别为86.16%～106.54%和2.4%～8.7%,在0.5004～40.032mg/L范围内相关系数值r=0.999 41,线性关系好,最低检测限为0.5 mg/L,最低定量限为2.5 mg/L。结论该方法溶剂用量少、灵敏度高、出峰特异、专属性强、色谱峰型好、分离度高、出峰时间短、影响因素少,是一种易于实现仪器自动化的分析方法。

四价脑膜炎球菌结合疫苗或第四剂流感嗜血杆菌-脑膜炎C/Y结合疫苗对婴儿期曾接受HibMenCY-TT三剂免疫的儿童具有免疫原性

背景：在幼儿接种流感嗜血杆菌-脑膜炎C/Y结合疫苗（HibMenCY-TT）疫苗的第二年进行单剂四价脑膜炎球菌结合疫苗（Men ACWY-TT）或第四剂Hib Men CY-TT的安全性和免疫原性的评价。方法：健康婴儿被随机（5∶1）分组,在2、4和6个月龄接种Hib Men CY-TT和白喉-破伤风-无细胞百日咳-乙肝-灭活脊髓灰质炎病毒（DTa PHBV-IPV）疫苗;或Hib-TT和DTaP-HBV-IPV疫苗（对照组）。

新的四价脑膜炎球菌糖结合疫苗

最近有研究报告说,脑膜炎球菌性脑膜炎和败血病因其死亡率和长期伤害人的后遗症成为公共卫生持续关注的问题,所有年龄段的人群都可能感染,危险人群中疾病负担更高。

脑膜炎四价结合疫苗接种后C群抗体应答的持久性

C群脑膜炎球菌（ MenC ）病在美国占到所有脑膜炎球菌病的三分之一，常引起脑膜炎球菌病的暴发。其与白喉类毒素相结合的四价结合苗（ MenA-CYWD ）2005年被推荐用于青年人和部队新兵这样的高危人群。作者评估了MenACYWD 或脑膜炎球菌多糖疫苗（ MP SV4）接种的美国部队人员中抗MenC抗体的持久性。从国防医学监测系统中随机地选用了1200名2006年到2008年间的MenACY-WD 接种者或2002年到2004年间的MPSV4接种者。对所有选用对象评估了其对Men C 的基线血清学应答；每疫苗组中有100名在接种后6个时点进行了检测：5～7，11～13，13～19，23～25或35～37个月。抗－MenC的几何平均滴度（ GMT）用兔补体血清杀菌试验（ rSBA）测定，几何平均浓度（ GMC）用酶联免疫吸附试验（ ELISA）测定。连续的变化用威尔科特森秩和检验进行比较，rSBA滴度≥8者的比例用卡方检验。接种前 MenACWYD 组的 rSBA GMT＜8，在接种后5～7个月增至703，接种后3年降至43，下降了94％。 MenACWY D 组的GMT在接种后5～7个月显著低于 MPSV4组。 MenACWYD免疫者rSBA滴度≥8的比例在5～7个月为87％，接种后3年降至54％。两疫苗组在各时点rSBA滴度≥8的个体比例方面没有明显差异。 MenACWYD组的基线GMC为0．14μg／mL，接种后5～7月时为1．07μg／mL，3年时为0．66μg／mL，在所有时点都显著低于MPSV4组。抗MenC 的应答在用MenA-CYWD 接种后衰减；为了保持循环抗体的保护水平需要加强剂接种。

2～59岁健康人群接种ACYW135群脑膜炎球菌多糖疫苗的免疫原性观察

目的评价ACYW135群脑膜炎球菌多糖疫苗在2～59岁健康人群中的免疫原性。方法 2～59岁健康人群接种者随机抽样(n=60),接种一剂四价脑膜炎球菌多糖疫苗。采集接种前和接种后1个月血清,采用体外杀菌试验(Serum bactericidal assay,SBA)检测血清中抗A、C、Y、W135群脑膜炎球菌的血清杀菌滴度。结果免疫前、后血清抗A群脑膜炎球菌的血清杀菌滴度GMTs(95%CI)分别为1241(736,2091)和7559(5520,10351)(P<0.05);抗C群脑膜炎球菌的血清杀菌滴度GMTs(95%CI)分别为4(9,21)和4787(2947,7775)(P<0.05);抗W135群脑膜炎球菌的血清杀菌滴度GMTs(95%CI)分别为16(9,28)和368(162,883)(P<0.05);抗Y群脑膜炎球菌的血清杀菌滴度GMTs(95%CI)分别为120(58,246)和1373(687,2745)(P<0.05)。免疫前和免疫后血清抗A群脑膜炎球菌的杀菌滴度≥128的比例分别为87(77.4,95.1)%和100(83.2,100)%;抗C群脑膜炎球菌的比例分别为17(8.3,28.5)%和97(88.5,99.6)%;抗W135群脑膜炎球菌的比例分别为13(5.9,24.6)%和68(55.0,79.7)%;抗Y群脑膜炎球菌的比例分别为57(43.2,69.4)%和85(73.4,92.9)%。免疫后较免疫前抗A群、C群、W135群和Y群脑膜炎球菌杀菌抗体滴度≥4倍升高的比例分别为50(27.2,72.8)%、97(88.5,99.6)%、62(43.2,73.9)%和55(41.6,67.9)%。结论虽然免疫前人群由于地方和国家免疫计划的实施已具有较高水平的抗A群脑膜炎球菌的血清杀菌滴度,但接种ACYW135群脑膜炎球菌多糖疫苗后可以使其保护水平进一步提高,并使人群对C群、W135群和Y群脑膜炎球菌的低水平杀菌抗体滴度均显著升高达到保护水平,证明ACYW135群脑膜炎球菌多糖疫苗在2～59岁健康人群中具有比较好的免疫原性。

2000—2013年加拿大安大略省C群和Y群侵入性脑膜炎球菌病(IMD)的流行病学调查:疫苗项目影响评价

2004和2005年,安大略省引入公共资助项目C群脑膜炎球菌结合疫苗免疫接种,引入对象为1岁龄儿童和青少年（接近12岁）。2009年,在7年级的学生中用四价脑膜炎球菌结合疫苗（MCV4）代替了MCCV。作者的目的是在加拿大安大略省,以人群水平确定脑膜炎球菌疫苗计划对C群和Y群侵入性脑膜炎球菌病（IMD）报告病例的影响。

ACWY四价脑膜炎球菌多糖结合疫苗的免疫策略及血清学免疫持久性研究进展

接种疫苗作为预防控制侵袭性脑膜炎奈瑟菌病(IMD)最经济有效的措施之一,如何科学制定与当前IMD流行病学特征相适应的免疫策略是影响其防控效果的关键因素。尽管我国2021年上市的ACWY群四价脑膜炎球菌多糖结合疫苗(MenACWY/MCV4)已在临床试验中证实了其免疫原性及安全性,但实践应用中仍未完全覆盖IMD高发人群,且缺乏长期的血清学免疫持久性数据。为积极响应WHO发布的2030年战胜脑膜炎的路线规划,本研究整理归纳了全球MCV4疫苗的应用现况及各国免疫策略,从基础免疫及加强免疫角度系统分析了血清学免疫持久性数据,结果显示,MCV4基础免疫的初免年龄越大,血清学免疫持久性越好;与W群、Y群和C群相比,抗A群脑膜炎奈瑟菌(Nm)血清杀菌活性衰减最快。在完成基础免疫后的3~6年加强1剂MCV4,可诱导持久的免疫反应及快速的免疫记忆。鉴于当前青少年是我国IMD高发及Nm高携带率群体,我国MCV4的应用年龄范围需基于严谨科学的临床试验数据逐步扩大,并探索评估加强免疫策略的必要性及相应的实施程序。

四价脑膜炎球菌多糖疫苗中结合物多糖抗原含量双抗体夹心ELISA检测方法的建立及验证

目的建立一种检测A、C、W135和Y群四价脑膜炎球菌多糖疫苗中各血清群多糖蛋白结合物的双抗体夹心定量ELISA检测方法,并进行验证。方法以白喉类毒素无毒变异体（CRM197）特异性单抗为包被抗体,HRP标记的脑膜炎球菌A、C、W135和Y群多糖特异性单抗为捕获抗体,建立可定量检测脑膜炎球菌各血清群结合物多糖含量的双抗体夹心ELISA法,确定方法的最佳线性范围和检测限,并对方法的特异性、准确性和重复性进行验证。结果定量检测A群脑膜炎球菌结合物（GAMP-CRM197）多糖抗原含量的双抗体夹心ELISA法的线性范围为3.75~120 ng/ml,检测限为3.75 ng/ml;定量检测C群脑膜炎球菌结合物（GCMP-CRM197）多糖抗原含量的双抗体夹心ELISA法的线性范围为1.875~30 ng/ml,检测限为0.938 ng/ml;定量检测W135群脑膜炎球菌结合物（GWMPCRM197）多糖抗原含量的双抗体夹心ELISA法的线性范围为7.5~240 ng/ml,检测限为7.5 ng/ml;定量检测Y群脑膜炎球菌结合物（GYMP-CRM197）多糖抗原含量的双抗体夹心ELISA法的线性范围为1.875~60 ng/ml,检测限为0.938 ng/ml。A、C、W135、Y群双抗体夹心ELISA法均能特异性地检测相应的结合物多糖抗原含量,而不与其他群的结合物多糖抗原发生交叉反应;A、C、W135、Y群双抗体夹心ELISA法的回收率均在80%~120%之间,检测相应的结合抗原样品时,变异系数（CV）均小于15%。结论建立的双抗体夹心ELISA法特异性较强,准确性较高,重复性良好,可用于四价脑膜炎球菌多糖疫苗中各血清群结合物多糖抗原的定量检测。

差异火箭免疫电泳定量检测四价脑膜炎球菌结合疫苗游离多糖方法的建立及验证

目的建立差异火箭免疫电泳（differential rocket immunoelectrophoresis,DRIEP）定量检测四价脑膜炎球菌结合疫苗游离多糖的方法,并对该方法进行验证。方法制备非均一性抗体琼脂糖凝胶,建立脑膜炎A群、C群、Y群、W135群游离多糖的DRIEP定量检测法,并对该方法的专属性、分离效果、线性、重复性及稳定性进行验证。分别采用DRIEP法及DOC沉淀化学法对11批各群脑膜炎球菌单价结合物进行检测。结果各群多糖抗原只与其相应特异性抗体发生结合,无交叉反应;各群结合物或混合物中的TT可完全与多糖分离;A群、W135群游离多糖定量对照品在2.5~20μg/ml范围内,C群、Y群游离多糖定量对照品在2~10μg/ml范围内,与沉淀峰高度呈良好线性关系,R2均〉0.99;各群单价结合物的9次检测结果的CV值均〈15%;多价脑膜炎球菌结合疫苗中各群游离多糖含量均比较接近。DRIEP法检测值较DOC沉淀化学法高约1/2倍,但两种方法检测结果的高低趋势具有相似性。结论DRIEP法可用于四价脑膜炎球菌结合疫苗中游离多糖的定量检测,提高了该疫苗的质控水平。

C、Y、W135四价多糖脑膜炎球菌发酵罐培养工艺的研究

探讨在发酵罐中应用A、C、Y、W135培养四价多糖脑膜炎球菌的具体效用。方法 确定研究时间,2022年1月至2022年10月时段,对培养基组成、发酵时间、补料形式、数量、搅拌速度、接种浓度、等分析,借助培养动力学的研究,对比4组培养方式的特点及差异进行分析。结果 A、C、Y、W135四种方式的应用,从脑膜炎球菌培养方面,其特性无明显差异,在各类方式的最高培养浓度时间、菌体收获率有所差异。在对于培养过程中,营养需求一致,发酵动力学、补料有差异。结论 目前,在发酵罐中,实施完全培养基,需要设定合理条件,定时补充进料,此方式对脑膜炎球菌生产具有积极意义,应在该领域广泛应用。

体外人外周血单个核细胞热原检测法用于ACYW135群脑膜炎球菌多糖疫苗的方法学研究

为考查体外人外周血单个核细胞热原检测法对ACYW135群脑膜炎球菌多糖疫苗的适用性,选取不同厂家共10批供试品,使用体外人外周血单个核细胞热原检测法,采用加样回收干扰实验考察供试品是否存在干扰。结果表明,大部分供试品在最大有效稀释倍数内,IL-6法干扰实验的回收率在50%~200%,且热原物质含量均低于标准限值,均为合格样品。研究表明,体外人外周血单个核细胞热原检测法可用于ACYW135群脑膜炎球菌多糖疫苗热原检测。

猪链球菌病与副猪嗜血杆菌病二联四价灭活疫苗的研制

为研制安全有效的猪链球菌病和副猪嗜血杆菌病二联四价灭活疫苗,将分离的猪链球菌(Streptococcus suis,SS)血清2型SS2-NT株、9型SS9-CZ株与副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)血清4型HPS4-YC株、5型HPS5-SQ株菌液灭活后稀释至所需浓度,再与Montanide GEL 02 PR佐剂混合,制备猪链球菌病和副猪嗜血杆菌病二联四价灭活疫苗。将制备的疫苗接种2~3周龄仔猪,首免后第21天进行二免,二免后第14天进行野生菌攻毒。同时设立商品化疫苗免疫的阳性对照组和无菌生理盐水处理的阴性对照组。该疫苗免疫仔猪后,仔猪体温、精神状况、食欲等均正常,颈部疫苗注射部位无肿胀、硬块、结节等不良反应,无死亡发生,表明该疫苗有良好安全性。血清抗体检测结果显示,二免后第14天,本试验疫苗组仔猪产生了较高水平的SS血清抗体及HPS血清抗体,抗体效价显著高于商品化疫苗对照组。免疫猪野生菌攻毒后,所研制疫苗对SS2-NT株、SS9-CZ株、HPS4-YC株和HPS5-SQ株的免疫保护率分别为80%、100%、80%、100%。本研究结果表明,我们研制的疫苗能诱导仔猪产生较高的抗体,并能够对血清2型、9型猪链球菌以及血清4型、5型副猪嗜血杆菌强毒菌株提供高效的免疫保护,具备疫苗市场开发的潜在价值。

肺炎球菌PsaA抗原及其在结合疫苗中的应用

目的应用基因工程技术表达和制备肺炎链球菌表面黏附素A（ pneumococcal surfaceadhesin A, PsaA），并与细菌荚膜多糖耦联制备成多糖蛋白结合疫苗，探讨PsaA作为肺炎球菌蛋白载体在增强结合疫苗中其他细菌多糖抗原的免疫原性的同时，还能获得对肺炎球菌的抗体反应，从而达到用一种结合疫苗能诱导出针对两种细菌的抗体免疫应答的目的。方法从肺炎链球菌基因组中扩增psaA基因，将目的基因插入原核表达载体pET-28a，获得重组质粒pET28a-psaA，通过转化进入大肠杆菌BL21中，经IPTG诱导，采用DEAE．阴离子交换层析法纯化基因重组rPsaA蛋白。将纯化到的rPsaA蛋白与A群脑膜炎荚膜多糖（group A meningococcal polysaccharide, GAMP）耦联成多糖蛋白结合疫苗后，用小鼠动物模型进行免疫实验，检测该疫苗的免疫原性，用ELISA法测定该疫苗在小鼠体内产生的针对肺炎球菌和脑膜炎球菌两种病原菌特异性抗原的抗体水平。结果成功克隆基因重组表达质粒，而且表达的PsaA蛋白在载体上的组氨酸标签之前终止表达，不带有组氨酸标签，保证疫苗的安全性。SDS—PAGE技术分析表明：rPsaA蛋白高效表达，约为菌体蛋白的60％，蛋白质相对分子质量约为37×10’，而且蛋白的可溶性好，不形成包涵体，用DEAE-阴离子交换层析法纯化其纯度可达80％以上。纯化到的PsaA蛋白与荚膜多糖耦联成功，应用于小鼠免疫实验，PsaA蛋白载体能显著增强A群脑膜炎荚膜多糖抗原的免疫原性，并同时产生针对肺炎球菌蛋白抗原和脑膜炎球菌多糖抗原的特异性抗体。结论利用基因工程技术获得无组氨酸标签的PsaA蛋白，并将它与A群脑膜炎荚膜多糖耦联，可以在增强荚膜多糖抗原免疫原性的同时，提高疫苗的免疫保护效果，探讨了给儿童接种一种疫苗能同时预防肺炎和脑膜炎两种传染病的可能性。