四甲基氮唑蓝比色法预测胃癌细胞药物敏感性的探讨

目的通过对比胃癌患者单药与联合用药体外敏感性,为临床筛选对胃癌相对敏感的化疗药物提供参考依据。方法采用临床常用的19种化疗方案对30例胃癌的新鲜标本进行四甲基氮唑蓝比色法体外敏感性测定。结果不同个体对化疗药物的敏感性差异较大,联合用药比单个药物的平均抑制率高。结论胃癌化疗联合用药敏感性大。四甲基氮唑蓝比色法是一种简便而快速的肿瘤体外药物敏感实验方法,可为胃癌临床个体化化疗方案的选择提供参考。

氧化苦参碱对人胃癌细胞杀伤作用的机制

目的:探讨氧化苦参碱(oxymatrine,OM)对人胃癌细胞株MKN45的杀伤作用及其抗肿瘤作用的机制.方法:培养人胃癌MKN45细胞,以0.5,1,2,4,6 g/L OM处理.采用四唑蓝(MTT)比色法、流式细胞仪、聚合酶链反应(PCR),酶联免疫吸附测定(ELISA)和RT-PCR法检测OM对MKN45细胞的杀伤作用、细胞周期分布、端粒酶活性和端粒酶逆转录酶(hTERT)及其上游调控基因(c-myc,p53,mad1)表达的影响.结果:OM对MKN45细胞具有剂量依赖性杀伤作用,半数抑制浓度(IC_(50))78 g/L.OM作用48 h后,与对照组相比,在2 g/L剂量组,MKN45 G0/G1期细胞增加(62.2%±1.3% vs 56.7%±4.0%,P<0.05)、G2/M期细胞减少(5.4%±1.1% vs 10.0%±2.8%,P<0.05);在4 g/L剂量组,S期细胞减少(30.5%±1.3% vs 33.4%±1.2%,P<0.05).OM可抑制MKN45细胞的端粒酶活性,其作用呈剂量依赖性.OM可引起MKN45细胞hTERT基因表达下调,p53和mad1基因的表达升高,对c-myc基因的表达无影响.结论:OM对人胃癌细胞株MKN45具有杀伤作用,可能通过影响hTERT及其上游调控基因的表达来抑制肿瘤细胞端粒酶活性,发挥其抗肿瘤作用.

HBx基因下调p21对HepG2细胞增殖与凋亡的影响

目的:构建转基因细胞模型HepG2/HBx,观察HBx基因对HepG2细胞增殖、周期和凋亡的影响,探讨细胞周期蛋白P21在其中的作用和意义.方法:应用脂质体转染和G418筛选构建稳定表达HBx的转基因细胞HepG2/HBx,RT-PCR和Western blot鉴定HBxmRNA与蛋白的表达.分别以四唑蓝(MTT)比色法、流式细胞术检测HepG2/HBx细胞及对照组HepG2与HepG2/pcDNA3.1细胞(转染空载体pcDNA3.1的HepG2细胞)的增殖、周期和凋亡.另半定量RT-PCR检测各组细胞中细胞周期蛋白P21与抑癌基因p53 mRNA的表达.结果:HepG2/HBx细胞中有HBx mRNA和蛋白的表达.HepG2/HBx细胞生长速度加快.HepG2/HBx中G0/G1期细胞比例较对照组显著减少(43.34%±3.11%vs57.69±4.28%,P<0.01),S期细胞比例明显增加(28.69%±1.17%vs22.41%±1.99%,P<0.05),同时还发现与对照组相比其凋亡率也显著降低(1.19%±0.06%vs5.43%±0.42%,P<0.001).细胞周期蛋白p21 mRNA在HepG2/HBx细胞中的表达较对照组细胞显著降低(0.16±0.05vs0.78±0.15,P<0.001),而p53表达则无显著变化.结论:HBx基因可下调细胞周期蛋白P21mRNA的表达,可能参与HBx基因加速HepG2细胞周期进程、促进细胞增殖以及抑制细胞凋亡的作用.

藤梨根乙酸乙酯提取物对肺癌A549细胞增殖的影响

目的探讨藤梨根乙酸乙酯提取物影响肺癌A549细胞生长增殖的作用机制。方法体外培养肺癌A549细胞,分别给予不同浓度的藤梨根乙酸乙酯提取物进行干预,倒置显微镜观察藤梨根乙酸乙酯提取物作用后A549细胞形态学变化,四甲基偶氮唑蓝比色法(MTT)检测藤梨根乙酸乙酯提取物对A549细胞增殖活性的影响,集落形成实验观察藤梨根乙酸乙酯提取物对肺癌克隆原细胞增殖的影响,3H-掺入法检测藤梨根乙酸乙酯提取物对A549细胞DNA合成的影响,免疫组化SP法检测用药后A549细胞Ki-67抗原表达变化。结果倒置显微镜下观察细胞形态学变化、MTT实验、集落形成实验结果均显示在体外藤梨根乙酸乙酯提取物在一定浓度下可以抑制肺癌A549细胞的生长,当药物浓度在20～160μg/ml时,抑制呈现出明显的时间和剂量依赖性。并且A549细胞cpm值及增殖指数随着药物剂量的增加和作用时间的延长而逐渐降低,仍以40、80、160μg/ml组作用明显,与对照组比较差异显著,有统计学意义(P<0.05)。结论藤梨根乙酸乙酯提取物可以明显抑制肺癌A549细胞的生长、增殖,其机制可能与抑制细胞DNA合成、降低Ki-67抗原表达有关。

藤梨根提取物对肺癌A549细胞凋亡及细胞周期的影响

目的观察藤梨根乙酸乙酯提取物对肺癌A549细胞生长增殖、细胞周期及凋亡的影响。方法体外培养肺癌A549细胞,分别给予不同浓度的藤梨根乙酸乙酯提取物进行干预,台盼蓝计数活细胞绘制不同浓度药物作用后细胞的生长曲线;四甲基耦氮唑蓝(MTT)比色法测定不同浓度药物作用不同时间对A549细胞生长的抑制率;采用流式细胞术(FCM)测定肺癌细胞周期、凋亡率变化;采用透射电镜观察药物作用后细胞的超微结构变化。结果台盼蓝计数活细胞及MTT实验结果均显示当药物浓度在20～160μg/ml之间时,体外藤梨根提取物可明显抑制肺癌A549细胞的生长,呈现出明显的时间和剂量依赖性。FCM检测显示药物作用后,G0/G1期细胞数目增多,S期和G2/M期细胞数目相应减少,细胞发生G0/G1期阻滞,细胞凋亡率亦明显增加,随药物浓度增加、作用时间延长,其细胞周期阻滞作用及凋亡诱导作用逐渐增强。药物处理48 h后各组A549细胞透射电镜下均可见不同阶段典型的凋亡细胞形态学变化。结论藤梨根提取物对人肺癌A549细胞生长有明显的抑制作用,呈现时效-量效关系,其作用与使细胞周期发生阻滞和诱导细胞凋亡有关。

氨甲喋呤对映体对ECV304细胞抑制作用及其机制

目的探讨氨甲喋呤[(±)MTX]及其对映体[(+)MTX、(-)MTX]对ECV304细胞的生长抑制作用并探讨其机制。方法采用培养的ECV304细胞,应用MTT比色法分析其活性;用光学显微镜观察细胞的形态学变化;碘化丙啶(PI)单染流式细胞术检测细胞周期。结果在0.1～150μmol·L-1范围内,(+)MTX、(-)MTX和(±)MTX作用于ECV304细胞24、48、72h,均抑制细胞ECV304增殖,但抑制强度依次为(+)MTX>(±)MTX>(-)MTX,倒置显微镜观察不同浓度(±)MTX、(+)MTX和(-)MTX作用ECV304细胞不同时间后,出现细胞体积变小、核固缩等形态学改变。用10μmol·L-1的(+)MTX、(-)MTX和(±)MTX作用ECV304细胞48h后,PI单染流式细胞术检测ECV304细胞周期的影响,表明MTX消旋体及单一体干扰ECV304细胞DNA合成。结论(+)MTX和(-)MTX对ECV304细胞的抗增殖作用具有化学结构的立体选择性,(+)MTX的抗ECV304细胞增殖作用明显强于(-)MTX。

川芎咔啉碱的合成及其对血管内皮细胞损伤的保护作用

目的:探讨川芎咔啉碱的新合成方法及其对血管内皮细胞损伤的保护作用。方法:以色胺为原料,经Pictet-Spengler环合反应,脱氢芳化反应制得川芎咔啉碱。用过氧化氢诱导血管内皮细胞损伤,以MTT法检测细胞的活力,计算细胞增殖率。结果:川芎咔啉碱的化学结构由元素分析、红外光谱、核磁共振波谱分析证实。川芎咔啉碱对H2O2引起的人胎儿脐静脉内皮细胞(HUVECs)的损伤具有保护作用,当浓度达到1.2mmol/L时保护作用最大。在浓度0.1～1.2mmol/L范围内,存在剂量依赖性关系。结论:川芎咔啉碱对H2O2诱导的HUVECs的损伤具有保护作用,提示可能对内皮损伤时的修复具有重要的意义。

ATP生物发光法与MTT法检测卵巢癌体外化疗敏感性的比较

目的比较ATh法与MTT（四唑蓝）法对卵巢癌细胞体外化疗敏感性的预测价值。方法分别以ATP法和MTF法检测5种化疗药物对卵巢癌3AO细胞株的抑制作用。结果（1）ATP法与MTT法相关性良好（r＝0．9031）。（2）ATP法更加灵敏、稳定。ATP法在80个细胞时即可测出发光强度的改变；而MTT法细胞数达300时才能测出OD值变化。试验所需细胞浓度，ATP法与MTT法分别为1×104－5×104个／ml和1×106-5×106个／ml，ATP法比MTT法低得多。结论ATP法作为检测卵巢癌细胞体外化疗敏感性的手段优于MTT法。

海带硫酸多糖对人宫颈癌细胞株增殖和凋亡的影响

目的:探讨海带硫酸多糖(LPS)对人宫颈癌细胞株HeLa的体外生长、凋亡及细胞周期的影响。方法:以不同浓度的LPS处理HeLacell,用四甲基偶氮唑蓝比色法(MTT)测定细胞增殖情况,细胞染色法观察细胞凋亡的形态,用流式细胞仪记录细胞周期改变、bcl-2及NF-κBp65基因表达情况。结果:LPS使细胞增殖能力下降,细胞出现凋亡的形态学改变,细胞周期受到阻滞,bcl-2蛋白与NF-κBp65的表达随着LPS浓度的增加与作用时间的延长而降低。结论:LPS明显抑制人宫颈癌细胞株的生长,并通过影响bcl-2、NF-κBp65基因蛋白的表达促进宫颈癌细胞凋亡。

重组人白细胞介素11生物学活性测定方法研究

目的建立重组人白细胞介素 11(rhIL 11)生物活性测定方法。方法运用单克隆方法筛选出rhIL 11敏感细胞株T 10 ,采用溴化四唑蓝比色法进行rhIL 11生物活性测定 ,采用四参数方程对测定结果进行计算。结果以世界卫生组织国际标准品作为参照品 ,与美国Genetics公司rhIL 11上市产品NeumegaTM进行测定比较 ,结果显示国内同类产品与其生物活性一致 ,RSD均小于 10 %。结论此方法可用于rhIL

肝癌腹水癌细胞、白细胞体外抗癌药物敏感相关性研究

目的探讨6种抗癌药物对肝癌晚期患者腹水癌细胞、白细胞化疗药敏结果及临床个体选药中的意义。方法采用CCK-8法检测抗癌药物对细胞的抑制率。结果卡铂、顺铂、阿霉素对大部分肝癌晚期患者腹水中癌细胞的抑制率明显高于白细胞(P<0.05),而羟基喜树碱对个别患者的白细胞抑制率明显高于癌细胞(P<0.05),丝裂霉素、氟尿嘧啶对两种细胞抑制率差异无统计学意义(P>0.05)。结论通过体外对比6种抗癌药物对肝癌患者白细胞和癌细胞的抑制率,以减少白细胞杀伤作用和增强癌细胞抑制作用为条件,为肝癌晚期患者优化化疗方案,提高疗效,并为进一步的临床个体化用药的实现提供一定的实验数据。

紫杉醇、顺铂对绒癌耐药细胞抑制作用的观察

目的 探讨紫杉醇(Paclitaxel)、顺铂(Cisplatin)对耐药人绒毛膜癌细胞株JAR/KSM的体外抑制作用。方法 采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法,观察不同浓度的紫杉醇、顺铂对人绒癌JAR细胞株和耐药人绒癌JAR/KSM细胞株的抑制作用,分析耐药株和非耐药株对紫杉醇和顺铂的敏感性。结果 JAR细胞和JAR/KSM细胞对紫杉醇和顺铂均敏感,两药单独使用时,随着药物浓度增加其抑制作用也增加。耐药细胞林和非耐药细胞株对两药的敏感性无显著性差异。结论 对KSM耐药的人绒毛膜癌细胞株和非耐药人绒毛膜癌细胞株对化疗药物紫杉醇、顺铂均具有敏感性。

促肝细胞生长因子活性检测方法比较

目的比较3种可用于促肝细胞生长因子(HGF)活性检测方法的优劣,以确定HGF活性的常规检测方法。方法以人肝癌细胞HepG2为材料,分别用3H-TdR掺入法、四甲基偶氮唑蓝比色法和XTT-PMS法检测HGF的生物活性,比较线性相关系数(r)和最大刺激指数(SI)及3种方法操作的简便性。结果MTT法的灵敏度(SI=3.65)与准确度(r=0.91)均较差;XTT-PMS法虽然灵敏度(SI=7.72)不如3H-TdR掺入法(SI=23.19),但准确度(r=0.98)最佳,操作最为简便。结论3种方法中,XTT-PMS法如以标准品校正,可作为HGF活性常规检测的首选方法。

孕三烯酮对体外培养异位子宫内膜细胞生长及凋亡的影响

目的探讨孕三烯酮对体外培养的子宫内膜异位症(内异症)患者的异位子宫内膜细胞(异位内膜细胞)生长及凋亡的影响,及第10号染色体缺失的磷酸酶和张力蛋白同源物(phosphatase and tension homologue deleted on chromosome 10,PTEN)基因在异位内膜细胞表达的变化.方法以0、10-6和10-4 mol/L浓度的孕三烯酮,对体外培养的异位内膜细胞分别进行处理;采用四甲基偶氮唑蓝比色法,检测孕三烯酮对异位内膜细胞作用0～48 h的细胞抑制情况并绘制细胞生长曲线;应用透射电镜观察孕三烯酮对异位内膜细胞作用24 h时的细胞超微结构变化;采用流式细胞仪检测异位内膜细胞凋亡率及细胞周期变化;应用PTEN单克隆抗体,经流式细胞仪分析异位内膜细胞PTEN基因的表达.结果孕三烯酮作用于异位内膜细胞8、16、24、32、40和48 h的细胞生长率,在孕三烯酮浓度为10-6 mol/L时,分别为99.6%、87.3%、79.8%、62.3%、51.7%和44.2%;在10-4 mol/L时,分别为99.2%、77.1%、69.6%、51.1%、33.7%和23.6%.同一浓度各作用时间比较,差异均有统计学意义(P＜0.05).孕三烯酮作用24 h后,异位内膜细胞发生典型的细胞凋亡形态学改变.浓度为10-6、10-4 mol/L的孕三烯酮作用于异位内膜细胞后,凋亡率分别为1.3%、15.0%;浓度为0 mol/L的孕三烯酮作用后,异位内膜细胞凋亡率为0,前后两者比较,差异有统计学意义 (P＜0.05).浓度为0 mol/L的孕三烯酮作用于异位内膜细胞后,PTEN基因的表达率为60.6%,浓度为10-6、10-4 mol/L的孕三烯酮作用后,异位内膜细胞PTEN基因的表达均有不同程度的上调,分别为75.3%和85.7%,显著高于孕三烯酮浓度为0 mol/L者,前后两者比较,差异有统计学意义(P＜0.05).结论孕三烯酮能明显抑制异位内膜细胞的生长、增殖,这一效应可能与通过上调PTEN基因的表达及诱导细胞凋亡有关.

蛋白激酶Cα对浅表膀胱癌分化及阿霉素内源性耐药的作用

目的探讨蛋白激酶C(PKC)α与浅表膀胱癌细胞分化及内源性耐药的关系。方法采用蛋白印迹法检测76例临床标本(浅表膀胱癌及正常组织)中PKCα的表达水平,对所有患者行标准化疗后随访4～24个月,分析PKCα表达及活化与复发的关系。应用人浅表膀胱癌细胞系RT4细胞,建立能够稳定表达PKCα绿色荧光蛋白(GFP)的人膀胱癌细胞系RT4/PKCαGFP。用四甲基偶氮唑蓝比色法(MTT)测定RT4/PKCαGFP和亲代细胞对阿霉素的敏感性。分别检测PKCα激活和抑制状态下RT4/PKCαGFP对阿霉素敏感性的差异。结果在癌组织中,PKCα总体表达水平和胞膜、胞浆中表达水平的比值(M/C值),均显著高于正常组织(癌组织为正常组织的2.2倍,t=1.98,P<0.05;M/C值癌组织为0.84±0.12,正常组织为0.23±0.11,t=2.62,P<0.01)。随着肿瘤分级的升高,胞膜中PKCα的相对表达的水平显著升高(P<0.01),胞浆中的相对表达水平显著下降(P<0.01),PKCα的M/C值显著升高(P<0.01),总体PKCα相对表达水平显著升高(P<0.01)。70例获随访,共复发38例。多因素分析表明,高PKCαM/C值是影响化疗后近期复发的独立预后因素(相对危险度3.98,95%可信区间1.22～5.68,P=0.03)。转染PKCα基因后,RT4细胞对阿霉素的耐药性增强(耐药指数6.97,t=3.24,P<0.01)。

腓骨肌萎缩症2L热休克蛋白B8过表达对细胞相对活力的影响

目的探讨轴索型腓骨肌萎缩症2L（axonal Charcot—Marie-Tooth disease type 2L，CMT2L）K141N突变的热休克蛋白B8（heat shock protein B8，HSPB8）对细胞相对活力的影响。方法应用脂质体转染技术，将野生型HSPB8（wtHSPB8）和K141N突变型HSPB8（K141NHSPB8）分别转染SHSY-5Y细胞，使其过量表达上述蛋白，以表达绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）为阴性对照，转染24h后用44℃致死性热休克处理40min，用四甲基偶氮唑蓝（methylthiazolyl tetrazolium，MTT）比色法检测SHSY-5Y细胞的相对活力。结果未处理组pEGFP-wtHSPB8与pEGFP-K141NHSPB8组间吸光度值比较P〉0．05，而热休克处理组pEGFP1-W1HSPB8与pEGFP-k141NHSPB8组间吸光度值比较P〈0．05，表明热休克处理后各组细胞相对活力差异有统计学意义，热休克处理后过表达wtHSPB8的SHSY-5Y细胞活力最高，过表达K141NHSPB8的细胞次之，过表达GFP空载体的细胞活力最低。结论证实了HSPB8在细胞受到致死性热休克刺激时对于保护细胞活力方面起着重要作用，K141N突变型HSPB8对细胞相对活力的保护作用较野生型HSPB8减弱。

MTT分析法检测氨甲蝶呤对映体对ECV304内皮细胞的细胞毒性

目的：研究手性药物氨甲蝶呤（MTX）消旋体与单一对映体对ECV304内皮细胞的细胞毒性。方法：设置溶剂对照组及氨甲蝶呤（MTX）单一体与消旋体不同浓度组、时间组，采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法检测各组细胞存活和生长情况，分析量效关系、时效关系。结果：在0．1～5μmol·L^-1浓度范围内．（＋）MTX、（±）MTX对ECV304内皮细胞有明显抑制作用（P〈0．01）．而（-）MTX相对抑制较弱。在药物作用72h后各组的细胞抑制率均达到高峰。结论：在一定浓度范围．（±）MTX、（＋）MTX对ECV304内皮细胞有细胞毒性，而（-）MTX则相对不明显。

土大黄提取物中蒽醌类成分的含量测定及其对ECV-304细胞的增值作用

目的:探讨土大黄不同乙醇提取物对ECV-304细胞的生长抑制作用。方法:采用HPLC法测定土大黄提取物中蒽醌类成分的含量;采用培养的ECV-304细胞,应用MTT比色法分析其活性;用光学显微镜观察细胞的形态学变化。结果:土大黄95%乙醇提取物总蒽醌成分可充分提取;在0.025～10μg/ml范围内,除水提物外均能明显抑制ECV-304细胞的增值。结论:土大黄95%乙醇提取物中蒽醌类成分的含量及其对ECV-304细胞的抗增殖作用明显优于其他提取物。

表达特异性多肽的噬菌体对卵巢癌细胞生物学行为的影响

目的探讨表达特异性多肽的噬菌体对卵巢癌细胞生物学行为的影响。方法选取卵巢癌细胞株A2780、SKOV3,分别与特异性的噬菌体共同作用,通过台盼蓝拒染法、流式细胞仪、平板克隆形成实验、四甲基偶氮唑蓝比色法、Boyden小室体外侵袭实验等方法,检测卵巢癌细胞生物学行为的变化。将A2780、SKOV3细胞按实验目的分别分为3组:(1)实验组,加入可与卵巢癌细胞特异性结合的噬菌体(阳性噬菌体);(2)空白对照组,不加噬菌体;(3)阴性对照组,加入不与卵巢癌细胞结合的噬菌体(阴性噬菌体)。结果实验组、阴性对照组和空白对照组的平均活细胞比例分别为(72·1±6·2)%、(84·8±4·6)%和(93·1±2·5)%,与阴性对照组及空白对照组比较,差异均有统计学意义(P<0·05);实验组A2780和SKOV3细胞的凋亡率分别为20·39%和43·99%,而阴性对照组均未见凋亡峰的出现;实验组细胞的平均克隆形成率为4%,阴性对照组为15%,空白对照组为15%,实验组与阴性对照组及空白对照组分别比较,差异均有统计学意义(P<0.05);实验组A2780和SKOV3细胞的生长抑制率分别为11·07%和9·58%,均明显高于各自的阴性对照组(分别为2·05%和1·09%),与各自的阴性对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05);实验组A2780和SKOV3细胞的侵袭指数,都低于各自的阴性对照组和空白对照组,分别与各自的阴性对照组和空白对照组比较,差异均有统计学意义(P<0·05)。结论筛选出的特异性噬菌体对卵巢癌细胞的生长、增殖和迁移有一定的下调作用,与噬菌体结合的卵巢癌细胞表面受体可能与肿瘤的发生和转移有关。