四数獐牙菜ISSR-PCR反应体系的正交优化

采用正交试验与单因素设计相结合的方法,对四数獐牙菜ISSR-PCR反应体系中的4种主要因素(Mg2+、TaqDNA聚合酶、dNTP及引物)进行优化筛选,PCR结果用统计软件SPSS16.0分析。结果显示,Mg2+、TaqDNA聚合酶、dNTP这3因素的不同水平对PCR反应结果都有显著影响,其中Mg2+的浓度影响最大。筛选出各反应因素的最佳水平,建立四数獐牙菜ISSR-PCR反应的最佳体系(25μL)为3.0 mmol/L Mg2+,250μmol/L dNTP,0.6μmol/L引物,1UTaqDNA聚合酶,40 ngDNA,2.5μL10×buffer。这一体系的建立为今后利用ISSR技术进行四数獐牙菜遗传多样性分析以及物种保护奠定了技术基础。

高效液相色谱法同时测定四数獐牙菜中4种有效成分含量

建立了反相高效液相色谱法同时测定四数獐牙菜中的落干酸、獐牙菜苦苷、龙胆苦苷、芒果苷含量的方法。测定方法:在检测波长254 nm、柱温30℃、流速1 ml/min时,用ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm i.d.,5μm)柱,以甲醇和水(含0.04%H3PO4)在0～20min内由20%至35%线性梯度洗脱。试验结果:4种成分均达到基线分离,落干酸、獐牙菜苦苷、龙胆苦苷、芒果苷的线性范围分别为0.05～0.625μ(g r=0.999 9)、0.095～2.9μ(g r=0.999 8)、0.049～2.56μ(g r=0.999 7)、0.006～2.8μ(g r=0.999 9);回收率分别为101%(RSD=4.3%)、98.7%(RSD=3.3%)、99.5%(RSD=3.5%)、102%(RSD=1.0%)。结论:测定方法快速,结果准确、可靠。

基于不同DNA序列对四数獐牙菜系统位置分析

以扁蕾属植物为外类群,基于trnL-trnF序列、rpl16序列以及ITS序列,采用最大简约法对四数獐牙菜的系统位置进行了分析。结果显示:尽管在ITS系统发育树t、rnL-trnF系统发育树和rpl16系统发育树中所用的种和数量有所不同,所得到的3种系统发育树的拓扑结构也不一致,但四数獐牙菜的系统位置在3种系统发育树中的结果基本一致。在trnL-trnF系统发育树中,四数獐牙菜与花锚属的H.elliptica、H.brevicornis和H.weddelli-ana形成了一个单系群;而在ITS和rpl16系统发育树中,四数獐牙菜与歧散獐牙菜先聚在一起,再与花锚属的植物聚为一支支持率较高的单系支。研究表明,四数獐牙菜与Anagalidium属的歧散獐牙菜的亲缘关系最近,其次是与花锚属的植物,而与獐牙菜属植物的亲缘关系较远。本实验系统发育的结果支持将四数獐牙菜从獐牙菜属中分出而归入Anagalidium属的观点。

四数獐牙菜的胚胎学及其系统学意义(英文)

四数獐牙菜花药四室，药壁发育为双子叶型；绒毡层腺质型。小孢子母细胞减数分裂为同时型，四分体的排列方式为四面体形；成熟花粉为３细胞。子房２心皮，２心皮连接处强烈内凸，４列胚珠。薄珠心，单珠被，直生胚珠。胚囊发育为蓼型。胚乳发育为核型。胚胎发育为茄型酸浆Ⅰ变型。反足细胞在胚囊成熟时期宿存。果实成熟时，种子只发育至球型胚阶段。承珠盘存在。与已研究的獐牙菜种类的胚胎特征相比较，该种存在三个显著的特点：直生胚珠，心皮连接处强烈内凸，承珠盘存在。这三个特征目前仅在龙胆族中的花锚属中发现。经过性状分析，它们均是演征，此三个共有演征表明四数獐牙菜与花锚属是一单系群，它们的亲缘关系最近。这与Ｙｕｎ＆Ｋｕｐｆｅｒ（１９９５）的分子证据部分吻合，因为分子系统树上的花锚单系支包括花锚、四数獐牙菜和北美的密花属（广义獐牙菜属中的密花组），而后者的胚胎学特征未有任何报道。胚胎学研究暗示四数獐牙菜的分类学等级有待重新评价，广义的獐牙菜属有可能不是一单系发生群。

HPLC同时测定四数獐牙菜中3种有效成分含量

采用高效液相色谱法同时测定四数獐牙菜中獐牙菜苦苷、龙胆苦苷、獐牙菜苷的质量分数。结果显示,3种化学成分均达到基线分离,獐牙菜苦苷、龙胆苦苷、獐牙菜苷的线性范围分别为0.15-21.05mg/L（R=0.999 8）、0.25-28.05mg/L（R=0.999 9）、0.10-20.00mg/L（R=0.999 8）,回收率分别为99.1%（RSD=1.94%）、101.5%（RSD=2.05%）、96.0%（RSD=1.94%）,表明该测定方法快速,结果准确、可靠,可用于四数獐牙菜中獐牙菜苦苷、龙胆苦苷、獐牙菜苷的质量分数测定。

藏药四数獐牙菜的质量标准研究

目的:建立藏药四数獐牙菜药材的质量标准。方法:采用《中国药典》方法测定水分、总灰分、酸不溶性灰分和浸出物的含量,采用显微、薄层色谱法建立药材鉴别方法,采用HPLC法测定药材中龙胆苦苷的含量。结果:确定了四数獐牙菜药材的显微鉴别特征,建立了以龙胆苦苷为指标的薄层鉴别及含量测定方法。四数獐牙菜药材中龙胆苦苷的平均含量为3.11%。结论:该方法操作简便,准确可靠,重现性好,可用于藏药四数獐牙菜药材的质量控制。

常用“蒂达”类藏药材四数獐牙菜的成分分析

目的:建立高效液相色谱法同时测定四数獐牙菜中獐牙菜苦苷、龙胆苦苷、当药苷、当药醇苷、1-羟基-3,4,5三甲氧基[口山]酮含量的方法。方法:采用Waters SunFire C18柱(4.6 mm×250 mm,5µm);以0.05%磷酸溶液-甲醇为流动相进行梯度洗脱;柱温30℃,流速1.0 mL·min^(-1),检测波长254 nm。结果:獐牙菜苦苷、龙胆苦苷、当药苷、当药醇苷、1-羟基-3,4,5三甲氧基[口山]酮分别在0.0320~0.3202μg(r=0.9997)、0.3788~3.7881μg(r=0.9998)、0.0124~0.1237μg(r=0.9995)、0.0032~0.0321μg(r=0.9998)、0.0031~0.0308μg(r=0.9994)进样质量范围内呈良好的线性关系,加样回收率分别为98.69%、97.81%、92.21%、93.44%、92.77%,RSD(r=6)分别为0.76%、1.77%、1.98%、1.59%、1.79%。7批样品中獐牙菜苦苷、龙胆苦苷、当药苷、当药醇苷、1-羟基-3,4,5三甲氧基[口山]酮的测定结果分别为0.1924%~0.3740%、2.1426%~4.4514%、0.1122%~0.1973%、0.0286%~0.0339%及0.0043%~0.0938%。结论:该方法简便、高效、灵敏、准确、经济实用,具有良好的重复性和稳定性,对于四数獐牙菜的质量控制、综合利用提供了有效参考依据。

3种獐牙菜属植物花蜜腺的发育解剖学研究

獐牙菜属的红直獐牙菜、抱茎獐牙菜和四数獐牙菜 3种植物花蜜腺都属花被蜜腺 ,其结构相似 ,均由分泌表皮和产蜜组织组成 ,为结构蜜腺 ,是花冠基部薄壁组织恢复分生能力形成的。分泌表皮无气孔器。原蜜汁由蜜腺周围的维管束提供 ,经产蜜组织加工后 ,由分泌表皮外薄的角质层泌出。四数獐牙菜花蜜腺裸露、凸起 ,而另 2种植物花蜜腺凹陷为囊状 ;红直獐牙菜为脱落蜜腺 ,而抱茎獐牙菜和四数獐牙菜为宿存蜜腺。其花蜜腺的性状基本印证了 3种獐牙菜属植物的系统位置。

两种人工栽培藏茵陈生物学特性的研究

通过椭圆叶花猫(Halenia elliptica D.Don)、四数獐牙菜(Swertia tetraptera maxim)的人工栽培试验表明:两种藏茵陈植物都为两年生草本,第一年仅以叶簇形态生枝条不伸长,只进行营养生长,生长第二年枝条才开始伸长,开花结实后完成生活史;两种藏茵陈播种时间都以秋播为宜,有利于自然通过低温春化作用打破种子休眠,促进翌年春天种子萌发,显著提高田间出苗率;两种藏茵陈通过人工栽培,其茎、叶都比野生植物生长高大、粗壮,可大幅提高生药产量,是保护珍稀野生植物资源的有效途径之一;两种藏茵陈50%以上的种子在土壤中有较长期的休眠特性,一般在一年中的春秋两季萌发,所以适当增加播种量第二年后可使田间一年、二年生植株同时生长,对生药生产可连年持续收获产品,免去了对土壤的耕、翻、耙、种等作业,从而可有效降低栽培成本。

空间格局和物种组合对三个植物种行为的影响

以青藏高原东部高寒草甸弃耕地种子大小不同的3个常见物种:2个1年生物种鼬瓣花(Galeopsis bifida)和菊叶香藜(Chenopodium foetidum)及1个2年生物种四数獐牙菜(Swertia tetraptera)为试验材料,通过单播、2个、3个物种的混播,分别以2个密度(高密度和低密度),按照随机或者种内积聚的空间格局形式播种,研究空间格局、物种组合对不同种子大小植物行为的影响。结果表明:1)空间格局和物种组合对3物种的出苗率没有显著影响,但在一定程度上影响着物种竞争能力等级,大种子鼬瓣花在种间竞争中占据着优势地位,小种子菊叶香藜在种内集聚格局下获益;四数獐牙菜的种子大小介于二者之间,其种间竞争的结果表现复杂;2)集聚格局下菊叶香藜的幼苗死亡率低,地上生物量比随机格局下显著高;集聚格局下鼬瓣花死亡率高,通过密度-格局作用,高密集聚下的地上生物量才表现显著较低;3)与其他物种混播相比,鼬瓣花单播下死亡率高,地上生物量低;当混播中存在四数獐牙菜时,菊叶香藜的死亡率比单播下高,物种组合对其地上生物量没有显著影响;四数獐牙菜与鼬瓣花混播时死亡率最低,3个物种混播时其死亡率最高。