污水中四环素类抗性基因的深度处理研究进展

四环素类抗生素在养殖、医疗行业的大量使用对细菌造成了持续的选择压力,导致四环素类抗性基因(tetracycline resistance gene,TRGs)在环境中广泛分布;多种TRGs被列为Ⅰ级环境风险等级,严重威胁人类健康和生态安全。污水处理厂(wastewater treatment plants,WWTPs)是TRGs的重要储存库,同时也是消减抗性基因的重要途径。总结了WWTPs中TRGs的赋存特征,对比分析了常规处理工艺,重点探索了新型深度处理工艺,以期为进一步有效去除TRGs和全面防控抗生素抗性基因污染提供参考。

四环素抗性基因tet(A)荧光RAA检测方法的建立及应用

为了实现快捷、准确检测抗生素抗性基因,提高环境监测与治理能力,建立了一种基于重组酶介导等温核酸扩增技术(recombinase-aided amplification,RAA)的四环素抗性基因tet(A)的快速检测方法.该检测方法以tet(A)基因序列保守区为靶序列,设计其RAA引物,筛选并优化RAA引物探针,建立荧光tet(A)-RAA快速检测方法.结果表明,该tet(A)-RAA法在39℃恒温条件下30 min内即可特异性实现对tet(A)基因片段的有效扩增,与无抗性细菌均无交叉反应.且采用该方法对18个环境样品进行检测,阳性率为100%,与qPCR方法检测结果一致.该四环素抗性基因tet(A)的检测方法灵敏度高、特异性强、反应时间短、操作简便,可用于对抗性基因tet(A)的快速检测,也为开发其他抗生素抗性基因快速检测方法提供了参考.

我国不同利用方式土壤四环素类抗性基因积累的研究

为研究我国不同地区的不同利用方式和不同种植年限土壤中抗生素抗性基因绝对丰度的变化,揭示抗性基因在农田土壤中的积累情况,以黑龙江(HLJ)、吉林(JL)、辽宁(LN)、内蒙古(NMG)、新疆(XJ)、甘肃(GS)、云南(YN)、江苏(JS)、湖北(HB)、广东(GD)、海南(HN)、山西(SX)、河南(HEN)、山东(SD)14个省份的土壤为试材,依据土壤利用方式(露地粮田、露地菜田和设施菜田土壤)和种植年限(1~3、7~10 a和15 a以上)设置9个处理,共378个样品。采用普通PCR和荧光定量技术对四环素类抗性基因进行定性和定量分析。四环素类抗生素的4种抗性基因(tetM,tetO,tetQ,tetW)在设施菜田土壤中的绝对丰度显著高于露地粮田和露地菜田,设施菜田绝对丰度范围为3.96×10^(4)~6.36×10^(8)copies·g^(-1),露地粮田为2.16×10^(3)~2.18×10^(6)copies·g^(-1),露地菜田为1.16×10^(4)~2.48×10^(7)copies·g^(-1)。4种抗性基因的最高丰度出现在不同种植年限、不同土壤利用方式中的不同省份,但设施菜田3、7 a和15 a的各省份土壤均显著高于相同年限的露地粮田和露地菜田,设施菜田7 a和15 a显著高于3 a。露地粮田、露地菜田的4种抗性基因积累与利用年限无显著线性关系,而设施菜田的抗性基因积累与利用年限存在显著正相关关系。研究表明,四环素类抗性基因已在我国不同地区的粮田、露地菜田和设施菜田土壤中普遍存在,其丰度在设施菜田土壤中显著高于露地菜田和露地粮田土壤,且在设施菜田中与利用年限显著正相关。

氨氮对牛粪厌氧消化中四环素类抗性基因丰度及其驱动因子的影响

为探究氨氮浓度对高温厌氧消化中四环素类抗生素抗性基因(Tetracycline resistance genes,TRGs)绝对丰度变化及其微生态机制,设置氨氮浓度为600、1100 mg·L^(-1)和1600 mg·L^(-1)的牛粪高温厌氧消化体系,分析了TRGs、可移动遗传元件和细菌群落结构的变化特征及三者之间的关系。结果表明:氨氮浓度为600 mg·L^(-1)和1100 mg·L^(-1)时,高温厌氧消化的产气速率和总产气量相似;氨氮浓度为1600 mg·L^(-1)时,二者均受到抑制。tetC、tetO、tetQ、tetT和tetX的丰度在不同氨氮浓度条件下均减少,但tetA和tetG的丰度在氨氮浓度为1600 mg·L^(-1)条件下增加了1.05倍和1.85倍。不同处理中细菌群落差异明显,TRGs潜在宿主菌的种类和数目均改变。相关性分析表明TRGs潜在宿主菌的差异可一定程度解释TRGs的丰度变化,但tetA和tetG丰度在氨氮浓度为1600 mg·L^(-1)条件下的增加主要与intI1和intI2的增长有关。综上所述,牛粪中较高的氨氮浓度会增加高温厌氧消化过程中TRGs通过水平基因转移途径增殖的可能性,从而增加TRGs传播的风险。

四环素抗性表型筛选外源基因高效表达克隆

目的 :应用四环素抗性表型从外源基因的cDNA文库中筛选高效表达克隆。方法 :将四环素抗性基因(TetR)克隆到载体pBV2 2 0 中构建筛选载体pBV2 2 3 ;根据氨基酸密码子的简并性 ,在保持原有氨基酸序列不变的情况下 ,人工合成外源基因的cDNA 5′端简并引物库 ,以hGM CSF基因为例进行筛选。把hGM CSFcDNA简并文库克隆到pBV2 2 3 中的TetR 上游位置 ,构建pBV2 2 3 /hGM CSF克隆文库 ,导入大肠杆菌DH5α中 ,构建转基因的细菌文库 ,在不同质量浓度 (2 0mg/L ,40mg/L ,5 0mg/L ,6 0mg/L)的四环素培养基中培养。结果 :从高浓度四环素培养基中获得高效表达的pBV2 2 3 /hGM CSF克隆 ,测序结果显示该克隆的hGM CSFcDNA 5′端序列与天然序列比较有 7个碱基发生突变 ,且符合实验设计的要求。通过基因重组 ,构建成最终的高效表达克隆pBV2 2 0 /hGM CSF ,其表达hGM CSF的量占细菌总量的 18% ,较原表达水平提高 80 %。结论 :可通过四环素抗性筛选系统筛选外源基因的高效表达克隆。

鸡粪堆肥过程中四环素类抗生素及抗性细菌的消减研究

通过实验研究了堆肥生产过程中,菌剂添加对鸡粪高温堆肥中四环素类抗生素(四环素和土霉素)降解、四环素抗性细菌和致病菌(大肠菌群和沙门氏菌)的影响。结果表明,菌剂添加可以提高鸡粪堆肥的高温期温度,促进肥料腐熟,并且能够提高土霉素的降解速率。实验组原料中76μg·kg-1的土霉素经过高温堆肥得到有效去除,而不接种菌剂的对照组中土霉素没有明显去除;原料中沙门氏菌在堆肥起始阶段(8 d)就能够杀灭,而大肠菌群一直持续检出,直到堆肥末期(47 d)才小于2 lg CFU·g-1。抗四环素细菌在堆肥过程中的数量总体呈下降趋势,堆肥成品分别比原料减少1.41 lg CFU·g-1(实验组)和1.60 lg CFU·g-1(对照组),抗性细菌占总菌数的比例呈现先上升再下降的趋势,最终比例分别为4.00%(实验组)和1.17%(对照组),均高于原料的抗性菌比例(0.40%和0.39%)。

芬顿法深度处理生物处理排水中的四环素抗性基因

以四环素抗性基因tet(L)、tet(E)为研究对象,考察了芬顿氧化技术对四环素抗性基因废水深度处理的效果.采用定量PCR与DGGE技术检测了芬顿法处理前后生物处理排水中的四环素抗性基因的丰度与废水中菌群丰度的变化.结果显示,在最佳反应条件:反应时间10min,p H值为5,[H_2O_2]/[Fe^(2+)](物质量的比)=8且H2O2的浓度达到0.2mol/L时,16Sr RNA及四环素抗性基因(tet genes)的去除效果最好.同时分析芬顿氧化前后的DGGE图谱可知,细菌菌群间的丰度有了明显的变化.相关性分析可知,各目标基因与单因素间、各目标基因之间,各样品中目标基因含量的变化与DGGE条带变化之间都没有明显相关性.结果表明,芬顿试剂可能不仅仅是通过削减单位水体中抗性菌的浓度来降低抗性基因浓度,还通过其他的方式来去除单位水体中的抗性基因的浓度,这还有待进一步研究证明.

长期施用粪肥对农田土壤中细菌四环素抗性水平的影响

[目的]考查集约化养殖产生的畜禽粪便直接施入农田造成的环境风险。[方法]以长期施用化肥的土壤为对照,通过小区定点试验,研究长期施用新鲜鸡粪、新鲜猪粪后对土壤中四环素抗性细菌的影响。[结果]新鲜鸡粪、猪粪中四环素抗性细菌的数量及其占可培养细菌总数比例均远远高于施肥前的基础土样。长期施用粪肥后,土壤中四环素抗性菌数量及其占可培养细菌总数比对照均有明显增加,而且有随土壤深度的增加(0～20 cm)呈纵向增加的趋势。[结论]长期施用畜禽粪肥导致土壤中微生物抗生素抗性水平大幅增加,对环境造成了一定的潜在风险。

我国养猪业废弃物中四环素类、磺胺类抗生素及相关抗性基因污染研究进展

我国是世界养猪第一大国,生猪饲养量和猪肉产量均位居世界第一。养猪业每年所产生的粪便、废水中含有大量畜用抗生素及其代谢产物,使养猪业废弃物成为环境中重要的抗生素污染源之一,随之产生的抗性基因污染及传播问题也不容忽视。本文结合近年来国内外的研究数据,对我国养猪业废弃物中四环素类、磺胺类抗生素及其相关抗性基因的检测方法、污染状况及影响抗性基因传播的因素进行了分析,并基于控制我国养猪行业抗生素及抗性基因污染的目的,提出了今后的研究重点。

猪场土壤中5种四环素抗性基因的检测和定量

近年来由于四环素在畜禽养殖业中的大量使用,诱导了环境中四环素抗性微生物的产生,然而有关四环素抗性基因在土壤中存在、迁移和扩散的研究目前还很少.论文提取了北京一规模化养猪场周边土壤的微生物DNA,利用普通PCR检测到5种四环素抗性基因(tet(B/P)、tet(M)、tet(O)、tet(T)、tet(W)),这5种基因都属于编码核糖体保护蛋白的一类.进一步建立了定量PCR程序对这5种基因进行了定量.结果显示,除tet(T)和tet(M)含量接近外(p=0.367),其余几种基因含量之间均差异显著(p<0.05),其中tet(W)的含量最高((2.16±0.20)×108copies·g-1(干土)),比含量最低的tet(B/P)((2.89±0.54)×106copies·g-(1干土))高出约两个数量级.抗性基因tet(W)、tet(T)、tet(M)、tet(O)含量均较高,为猪场土壤中优势抗性基因.这些基因曾被报道广泛存在于猪和牛的肠道中,显示抗性基因很可能是通过基因横向转移(HGT)等机制从养殖动物体内传播到周围土壤中土著微生物体内的.论文所建立的实验方法为进一步系统研究抗生素抗性基因在土壤中的环境行为及其生态风险提供了基础.

连续施用发酵猪粪对土壤中四环素抗性基因数量的影响

为了研究连续施用发酵猪粪之后,土壤中抗性基因的数量以及发酵猪粪的施用量对土壤抗性基因的影响,采用实时荧光定量PCR方法,对稻麦轮作模式下连续6年施用4.5t/hm2和9.0t/hm2发酵猪粪的土壤进行了四环素抗性基因（TRGs）的检测和定量分析.在施用发酵猪粪的土壤中能够检测到9种TRGs.施用发酵猪粪显著增加了土壤中tet G、tet L、tet B（P）、tet O、tet W的绝对数量,其中tet B（P）、tet W、tet O的绝对数量受到了施肥用量的影响;而tet Z、tet C和tet S的绝对数量则没有受到施肥的影响.上述8种TRGs在同一施肥处理的0～5cm、5～10cm以及10～20cm土壤中的相对丰度分布均无显著差异.发酵猪粪的施用也显著增加了tet G、tet L、tet B（P）和tet O的相对丰度,但是仅有tet O的相对丰度受到了施肥用量的显著影响.本研究表明,在稻麦轮作模式下,农田土壤中的TRGs数量会受到发酵猪粪中残留TRGs的影响,连续施用该粪肥会显著增加土壤中tet G、tet L、tet B（P）和tet O的绝对数量和相对丰度.因此,需要优化畜禽粪堆肥发酵工艺,以减少抗性基因在粪肥中的残留。

土壤环境中四环素类抗生素残留及抗性基因污染的研究进展

近年来,致病菌耐药性的增加和扩散已成为全世界关注的热点问题,而人类医疗和畜禽养殖业抗生素的滥用正不断加剧这一问题.众多研究表明土壤环境作为一个巨大的抗性基因储存库,在抗性微生物和抗性基因的传播中起重要的作用,具有潜在的生态与健康风险.在总结国内外最新研究基础上,对土壤环境中典型抗生素-四环素类抗生素的主要污染源以及其在土壤中的基本环境行为等进行了分析,并探讨了土壤中四环素类抗性基因的来源、迁移和扩散及分子检测手段等问题.我国作为抗生素的生产和消费大国,抗生素污染问题较其他国家更为严重,而国内相关研究才刚刚起步,迫切需要开展有关环境中抗生素和抗生素抗性基因污染的系统研究.

水产养殖环境常见四环素类抗生素抗性基因tet(M)的演化及传播的初步分析

利用分子系统学方法分析了20条水产养殖环境中常见的四环素抗性tet(M)基因的序列特点、多态性及系统发育,并对其细菌寄主分类、环境介质来源作相关性分析。结果表明,20条基因序列有4种单倍型,其中tet(M)-b和d是两种远缘基因型,而a和c则是二者之间的序列变异。系统发育树分成三大分支,tet(M)基因在进化及传播过程与其细菌寄主的基因背景及环境介质的来源并无严格的相关性,暗示该类基因在环境中传播与进化迅速,其传播机制及环境毒性有待于深入的研究。

四环素抗性基因PCR检测及酶切分析的实验与临床研究

采用PCR技术对551份泌尿生殖道分泌物标本进行四环素抗性基因（tetM）检测，并进行敏感性及特异性试验、应用Taq-1限制性内切酶对PCR产物进行酶解消化反应结果表明四环素抗性基因决定子的阳性检出率为36．84％（20／551），大多数PCR产物在酶解后可产生3个预期酶解片段（190bp、130hp及77hp），少数则缺如此3个酶解片段。研究结果提示，用PCR方法可敏感、快速、准确及大批量筛查tetM耐药基因，在tetM决定子内可能存在核苷酸序列上的差异。

洪泽湖沉积物中四环素土霉素及相关抗性基因的分布特征及潜在风险分析

为了探讨洪泽湖沉积物中四环素、土霉素及其抗性基因的含量、分布及潜在风险,采集洪泽湖湖区42个沉积物样品,利用HPLC-MS测定了样本中常见的两种四环素类抗生素(四环素、土霉素)含量,并采用q PCR分析了样品中3种四环素抗性基因(tet A、tet C、tet M)的含量。结果显示,四环素类抗生素检出率为100%,含量范围为1.35~25.43μg·kg^(-1)。所有样品中tet A、tet C基因均有检出,且tet C基因含量最高,平均含量为9.77×106copies·g-1,只在部分样品中检测出tet M。相关结果分析表明,沉积物中的四环素类抗性基因含量与四环素类抗生素含量及有机碳的乘积呈较为明显的正相关关系(R2=0.669 4,n=42),这也表明在洪泽湖水域中,四环素类抗生素抗性基因的含量水平可能不仅与环境中的抗生素暴露水平相关,同时也有可能与有机质含量等环境因素相关。

污水处理厂中四环素类抗生素残留及其抗性基因污染特征研究进展

四环素类抗生素以其突出的抗菌性能和较低的副作用而被广泛用于细菌感染疾病的治疗和控制,污水处理系统作为环境中四环素类抗生素及其抗性基因的一个重要污染点源,已引起广泛关注。尽管如此,目前关于四环素类抗生素在污水处理过程中的降解行为及影响因子,及其对降解微生物抗药性的选择性效应方面的研究还较少。在分析总结国内外四环素类抗生素污染现状基础上,对污水处理过程中四环素类抗生素的去除行为及影响因素等进行分析,探讨了其抗性基因在污水处理过程中的污染特征,同时分析了四环素类抗生素对其抗性基因的诱导、演变和传播的影响,并对今后的研究发展方向进行了展望,以期为从污水处理系统达到控制和去除四环素类抗生素及其抗性基因提供方向和依据。

含四环素沼肥对蔬菜品质及抗性基因的影响

为探讨含四环素沼肥的生态毒性,采用盆栽试验研究了含四环素沼肥对小白菜品质、土壤微生物群落代谢功能多样性及抗性基因的影响.结果表明：与CK相比,添加高浓度（15 mg/kg）四环素沼肥处理下,小白菜鲜质量和w（维生素C）分别降低了5.7%和16.7%,w（硝酸盐）增加了34.3%.Biolog微平板分析显示,添加高浓度四环素的沼肥显著提高了土壤微生物群落碳源利用多样性和物种丰富度.实时荧光定量PCR分析发现,在小白菜幼苗期,添加高浓度四环素的沼肥处理下,土壤中四环素类抗性基因相对丰度比CK高出0.69-4.03倍.无论沼肥中是否添加四环素,施肥后小白菜内生菌中均存在抗性基因,并且小白菜内生菌抗性基因相对丰度均以CK最高,比其他处理高出0.55~325.72倍.研究显示,添加四环素的沼肥改变了小白菜品质和产量以及土壤微生物群落碳源利用多样性和物种丰富度,增加了土壤中四环素类抗性基因丰度,降低了小白菜内生菌的抗性基因水平.

四环素类和磺胺类双重抗生素抗性菌的特性

为了研究抗生素抗性菌、抗性基因的扩散和污染对环境和人类健康可能产生的威胁,分8次采集城市污水处理厂水样,应用肉汤微量稀释法和聚合酶链式反应方法,分离、鉴定对四环素、磺胺甲恶唑敏感菌株,分析其抗生素抗性,检测抗性基因。从某污水处理厂出水中分离22株四环素类抗性菌、26株磺胺类抗性菌,检测其对常用抗生素耐受性及抗生素浓度、抗性基因含量。测得四环素类和磺胺类双重抗性菌数量为5.04×102~2.51×103 CFU/mL;抗性菌对9种抗生素具有抗性,最高耐受力为512 mg/mL,其中,对氯霉素耐受能力最强,对青霉素、氨苄青霉素、头孢氨苄、环丙沙星、庆大霉素、阿奇霉素耐受力次之,对利福平耐受力最弱;还检测到双重抗性基因,其中tetW和sul1的含量较高。结果表明:城市污水处理厂的四环素类和磺胺类抗生素含量较高,存在双重抗性菌、抗性基因。

保育和育肥猪舍气溶胶微生物组成和四环素类抗性基因丰度研究

本研究旨在比较保育舍和育肥舍气溶胶微生物组成和四环素类抗性基因丰度的差异。采集8个保育舍和8个育肥舍的空气样品,用RT-qPCR方法检测特定微生物类群的相对丰度和四环素类抗性基因的绝对丰度。结果表明:与保育舍相比,育肥舍气溶胶微生物组中厚壁菌门、乳酸杆菌属、罗伊氏乳杆菌和约氏乳杆菌丰度显著提高(P<0.05),而拟杆菌门、梭菌属和普雷沃氏菌属丰度显著降低(P<0.05);育肥舍气溶胶中TetB、TetH、TetZ、TetO、TetQ和TetW的拷贝数显著低于保育舍(P<0.05);主成分分析表明,保育舍和育肥舍气溶胶可按照微生物丰度和四环素类抗性基因丰度进行聚类。由此可见,不同猪舍类型微生物组成存在明显差异,保育舍抗性基因丰度显著高于育肥舍。

牛粪原料浓度对厌氧消化削减四环素类抗性基因的影响

为了探究不同原料浓度厌氧消化体系中四环素类抗性基因(Tetracyclineresistancegenes,TRGs)的变化,设置牛粪原料浓度为100%、75%、50%和25%,分析了TRGs、理化因子和微生物群落的变化特征及三者之间的相互关系。结果表明:不同处理之间产气速率相似,原料浓度从100%降低至25%时总产气量从358.83 mL·g^(-1)·d^(-1)增加至400.89 mL·g^(-1)·d^(-1)。消化后的大部分处理中tetO、tetQ和tetT相对丰度减小为原料的1.04%~87.06%,而tetC、tetG、tetW和tetX相对丰度增加至原料的1.32~34.99倍。与100%原料浓度相比,较低原料浓度消化后多数TRGs如tetC、tetG、tetO和tetX以及intⅠ1的相对丰度更高。不同条件下微生物群落差异明显,较低浓度原料(50%和25%)消化后优势菌门从Firmicutes变为Proteobacteria,且TRGs潜在宿主菌属的种类和数目均随着原料浓度的改变而改变。冗余分析表明,理化因子通过影响潜在宿主菌的变化从而影响TRGs的变化。综上,由废水干预的牛粪原料浓度较低的情况可能有利于TRGs潜在宿主菌的增殖,从而增加TRGs传播的风险。