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用四环素诱导调控表达系统构建弓形虫脂肪酸合成酶FABZ缺陷株 被引量:2
1
作者 吴亮 薛兰兰 +3 位作者 王晓 吴腊梅 姜旭淦 陈盛霞 《中国寄生虫学与寄生虫病杂志》 CAS CSCD 北大核心 2014年第4期264-267,共4页
目的构建基于四环素诱导调控表达系统的刚地弓形虫β-酮脂酰ACP合成酶(FABZ)缺陷株。方法从弓形虫基因组中扩增fabz基因并构建四环素调控诱导表达载体pTetO7-Sag1-FABZ-Ty-DHFR,电穿孔法导入弓形虫TATi株,通过乙胺嘧啶抗性和极限稀释法... 目的构建基于四环素诱导调控表达系统的刚地弓形虫β-酮脂酰ACP合成酶(FABZ)缺陷株。方法从弓形虫基因组中扩增fabz基因并构建四环素调控诱导表达载体pTetO7-Sag1-FABZ-Ty-DHFR,电穿孔法导入弓形虫TATi株,通过乙胺嘧啶抗性和极限稀释法筛选FABZ缺陷株,蛋白质印迹(Western blotting)检测虫体内附加表位标签Ty的表达。在5×105个FABZ缺陷株弓形虫速殖子培养液中加入脱水四环素(终浓度为1μg/ml),Western blotting检测带有Ty标签的FABZ表达情况。结果筛选获得的缺陷株可表达带有Ty标签的转运肽型FABZ和成熟型FABZ。FABZ缺陷株弓形虫速殖子培养液中加入脱水四环素24 h和48 h后,转运肽型FABZ表达量均较对照组显著降低(P<0.05)。结论构建了由脱水四环素调控表达的弓形虫FABZ缺陷株。 展开更多
关键词 刚地弓形虫 脂肪酸代谢酶 四环素诱导调控表达系统 缺陷株
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小鼠H1foo基因四环素诱导表达系统的构建与表达 被引量:1
2
作者 李建 宁静 +2 位作者 陈西锐 宋成艳 雷安民 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第5期757-762,共6页
卵母细胞特异性连接组蛋白H1foo(Linker histone H1foo)是连接组蛋白H1(Histone 1)在卵母细胞中特异性表达的1个亚型,H1foo在卵母细胞减数分裂和成熟发育过程中起着不可替代的作用,而且H1foo也参与了重编程过程。为了在体细胞中进一步研... 卵母细胞特异性连接组蛋白H1foo(Linker histone H1foo)是连接组蛋白H1(Histone 1)在卵母细胞中特异性表达的1个亚型,H1foo在卵母细胞减数分裂和成熟发育过程中起着不可替代的作用,而且H1foo也参与了重编程过程。为了在体细胞中进一步研究H1foo的功能,本试验通过采用四环素诱导表达载体系统,用PCR的方法扩增了小鼠的H1foo基因和四环素诱导表达系统(Tet-on)的启动子区。用双酶切和连接等方法将上述元件连接到真核表达载体pVenus上,构建了重组质粒pVenus-tet-CMV-H1foo。双酶切和测序结果显示,片段连接正确,且全长测序正确。本试验所构建的四环素诱导的小鼠H1foo真核表达系统有助于人们在体细胞中更好地探讨H1foo在特定时间的作用和功能。 展开更多
关键词 小鼠 H1foo基因 四环素诱导表达系统
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四环素诱导肝脏特异表达绿色荧光蛋白转基因斑马鱼模型建立 被引量:4
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作者 张力 刘超 +3 位作者 周昕 谢英 刘树锋 徐增年 《中国实验动物学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第1期81-85,共5页
目的探索tet-on四环素诱导表达系统在斑马鱼体内应用策略与技术路线,构建四环素诱导肝脏特异表达绿色荧光蛋白的转基因斑马鱼,为条件型功能基因研究及组织特异转基因斑马鱼疾病模型的建立奠定基础。方法构建肝脏特异启动子fabp10启动rt... 目的探索tet-on四环素诱导表达系统在斑马鱼体内应用策略与技术路线,构建四环素诱导肝脏特异表达绿色荧光蛋白的转基因斑马鱼,为条件型功能基因研究及组织特异转基因斑马鱼疾病模型的建立奠定基础。方法构建肝脏特异启动子fabp10启动rt TA蛋白表达的重组质粒pfabp10-rt TA,联合p TRE-Tight-BI-Ac GFP1质粒转染He La细胞后给予doxycycline诱导,Western blot法验证;pfabp10-rt TA联合p TRE-Tight-BI-Ac GFP1质粒注射斑马鱼1-细胞期受精卵后,30μg/m L doxycycline诱导,荧光筛选稳定整合个体。结果共转染pfabp10-rt TA与p TRE-Tight-BI-Ac GFP1的He La细胞经1μg/m L浓度doxycycline诱导培养液诱导,GFP表达量显著高于不加doxycycline培养液对照组;筛选获得的稳定整合斑马鱼幼鱼,在浓度为30μg/m L doxycycline条件下,肝脏明显有绿色荧光表达,对照组幼鱼肝脏位置未有明显绿色荧光。结论 Tet-On四环素诱导表达系统可用于建立四环素调控斑马鱼肝脏特异表达外源基因;利用该技术可建立诱导肝脏表达GFP建立转基因斑马鱼品系,为建立条件型转基因斑马鱼疾病模型、探索肝脏器官发生发育等研究提供良好的模式动物工具。 展开更多
关键词 斑马鱼 四环素诱导系统 肝脏 绿色荧光蛋白
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四环素诱导的YAP1敲减系统的建立及其对胃癌细胞功能的影响 被引量:1
4
作者 王贺 刘俊 +5 位作者 黄硕 丁晓琛 乔一桓 姜勋亮 闫静川 李纪鹏 《西安交通大学学报(医学版)》 CAS CSCD 北大核心 2020年第5期690-695,共6页
目的建立一种四环素(tetracycline,DOX)诱导的基因敲减系统,并利用此系统研究YAP1对胃癌细胞功能的影响。方法构建pLKO.1-tetON-YAP1敲减的慢病毒载体,酶切和测序方法检测载体构建成功与否;慢病毒感染胃癌细胞系SGC-7901和MKN-28,建立DO... 目的建立一种四环素(tetracycline,DOX)诱导的基因敲减系统,并利用此系统研究YAP1对胃癌细胞功能的影响。方法构建pLKO.1-tetON-YAP1敲减的慢病毒载体,酶切和测序方法检测载体构建成功与否;慢病毒感染胃癌细胞系SGC-7901和MKN-28,建立DOX诱导的YAP1敲减的胃癌细胞系;RT-PCR检测YAP1 mRNA相对表达量,Western blotting检测YAP1蛋白水平变化;平板克隆实验检测细胞增殖情况;划痕实验和Transwell实验检测细胞迁移的情况。结果构建四环素诱导的YAP1敲减的病毒质粒,酶切鉴定结果显示,在6000 bp和3000 bp处各有一条带,测序结果与设计的shRNA序列一致。包装慢病毒并感染胃癌细胞系SGC-7901和MKN-28,DOX诱导组中,感染pLKO.1-tetON-YAP1的病毒的细胞中YAP1 mRNA的相对表达量和蛋白水平明显下调;而未诱导组则无明显变化。平板克隆形成实验结果显示,DOX诱导后shYAP1组克隆形成数明显降低;未诱导组无明显变化。划痕实验和Transwell迁移实验结果显示,DOX诱导后shYAP1组表达后细胞迁移能力受到抑制,未诱导组无明显变化。结论成功建立了四环素诱导的慢病毒系统,利用此系统敲减胃癌细胞YAP1基因,胃癌细胞增殖和迁移能力受到抑制。 展开更多
关键词 四环素诱导表达系统 SHRNA 胃癌 YAP1基因 增殖 迁移
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四环素诱导的猪黑素皮质激素受体-4基因真核表达载体的构建 被引量:3
5
作者 解宇 汪亮 +2 位作者 张冬杰 刘娣 孙亚蒙 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2013年第1期13-16,共4页
猪黑素皮质激素受体-4(melanocortin-4receptor,MC4R)基因是影响猪生长肥育的主效基因之一,为了进一步研究MC4R基因的生物学功能,制备高成活率转基因猪,通过采用条件性诱导表达载体系统,PCR方法扩增了猪MC4R基因完整编码区,四环素诱导... 猪黑素皮质激素受体-4(melanocortin-4receptor,MC4R)基因是影响猪生长肥育的主效基因之一,为了进一步研究MC4R基因的生物学功能,制备高成活率转基因猪,通过采用条件性诱导表达载体系统,PCR方法扩增了猪MC4R基因完整编码区,四环素诱导表达系统(Tet-on)的启动子调控区与转录调节元件。采用双酶切和连接等方法将上述元件连接到pcD-NA3.1(+)上,构建了重组质粒pcDNA3.1(+)-rtTA-PTight-MC4R。经双酶切和测序鉴定,结果显示片段正向连接且片段全长测序正确。试验成功构建了四环素诱导的pcDNA3.1(+)-rtTA-PTight-MC4R真核表达载体,并能在时间特异性方面调控MC4R基因的表达。 展开更多
关键词 MC4R基因 四环素诱导表达系统
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四环素调控表达系统调节EGFP和HBV前核心蛋白在哺乳动物细胞中表达 被引量:1
6
作者 朱晓东 姚丰 田波 《自然科学进展》 北大核心 2002年第11期1209-1212,共4页
构建新型四环素调控的增强绿色荧光蛋白(EGFP)基因和乙肝病毒(HBV)前核心蛋白基因的表达载体,利用脂质体转染哺乳动物细胞,流式细胞术检测结果说明:应用此系统四环素可使EGFP在CHO细胞中的表达提高18倍,在SSMC-7721细胞与HEK293细胞中... 构建新型四环素调控的增强绿色荧光蛋白(EGFP)基因和乙肝病毒(HBV)前核心蛋白基因的表达载体,利用脂质体转染哺乳动物细胞,流式细胞术检测结果说明:应用此系统四环素可使EGFP在CHO细胞中的表达提高18倍,在SSMC-7721细胞与HEK293细胞中的表达分别提高5倍和接近2倍,并且,四环素可有效地诱导HBV的前核心蛋白基因在肝癌细胞系中的表达。 展开更多
关键词 EGFP HBV 前核心蛋白 哺乳动物 基因治疗 四环素诱导表达系统 增强绿色荧光蛋白 乙肝病毒 反式显性负调蛋白 基因表达
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人端粒酶hTERT可诱导RNAi系统的建立及其对TREx-HeLa细胞生长的影响 被引量:4
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作者 柏芸 杜贻鹏 +5 位作者 骆晓枫 米洋 袁广卿 何霞 陈展辉 周俊宜 《中国病理生理杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第3期537-542,共6页
目的:建立可诱导性沉默hTERT的RNA干扰系统,并初步探讨端粒酶与细胞增殖调控之间的关系。方法:构建沉默端粒酶催化亚基hTERT的Tet-on可诱导性RNAi载体psiRNA-hH1/TO-hTERTshRNA,并稳定转染表达TR的TREx-HeLa细胞,用半定量RT-PCR检测hTER... 目的:建立可诱导性沉默hTERT的RNA干扰系统,并初步探讨端粒酶与细胞增殖调控之间的关系。方法:构建沉默端粒酶催化亚基hTERT的Tet-on可诱导性RNAi载体psiRNA-hH1/TO-hTERTshRNA,并稳定转染表达TR的TREx-HeLa细胞,用半定量RT-PCR检测hTERT的转录后水平,TRAP法检测端粒酶活性。MTT法检测细胞的增殖,流式细胞仪和Hoechst33342染色法观察细胞凋亡。结果:构建了可诱导性沉默端粒酶催化亚基hTERT的重组体psiRNA-hH1/TO-hTERTshRNA,并建立了可诱导性沉默hTERT的TREx-HeLa细胞株。短期内的端粒酶活性降低后TREx-HeLa细胞生长增殖有下降趋势,而其凋亡情况则未见明显变化。结论:本研究建立了可诱导沉默hTERT的RNAi系统,为研究端粒酶活性与细胞增殖和衰老的关系提供了实验基础。 展开更多
关键词 RNA干扰 四环素诱导RNAi系统 端粒 末端转移酶 细胞凋亡 TREx—HeLa细胞
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Tet-on系统诱导猿猴病毒40T在CHO细胞中的表达
8
作者 朱洪 孙强 +2 位作者 徐向明 孙怀昌 李厚达 《扬州大学学报(农业与生命科学版)》 CAS CSCD 北大核心 2005年第3期12-16,共5页
四环素诱导表达系统(T et-off/T et-on系统)是比较成熟的真核生物基因诱导表达系统之一,具有高效、无毒、严密开/关功能的特点。猿猴病毒40T(SV 40T)是一种病毒癌蛋白,其与肿瘤抑制蛋白p53和R b结合,并使之失活,从而消除它们抑制细胞生... 四环素诱导表达系统(T et-off/T et-on系统)是比较成熟的真核生物基因诱导表达系统之一,具有高效、无毒、严密开/关功能的特点。猿猴病毒40T(SV 40T)是一种病毒癌蛋白,其与肿瘤抑制蛋白p53和R b结合,并使之失活,从而消除它们抑制细胞生长的功能,使细胞分裂加速,形成肿瘤。利用T et-on系统首先稳定筛选获得了表达T et-on系统调节元件rtTA的阳性细胞CHO-pT et-on,再通过稳定筛选又成功得到导入其反应元件的双阳性细胞CHO-pT et-on-pTRE 2-SV 40T-Hyg,经强力霉素诱导表达了目的基因SV 40T,建立了T et-on基因诱导表达系统的细胞诱导表达研究平台。 展开更多
关键词 猿猴病毒40T 四环素诱导表达系统 强力霉素
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诱导型eIF3g人工microRNA表达载体的构建及应用 被引量:4
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作者 褚丽莎 韩娜 +1 位作者 宋向阳 曹江 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2011年第2期135-138,共4页
目的:构建可用四环素调控的针对人eIF3g的人工microRNA表达载体,用于抑制肿瘤细胞中eIF3g的表达。方法:利用网络资源设计针对人eIF3g的人工microRNA,以PCR方法克隆,经DNA测序验证后亚克隆至四环素调控表达系统的pRevTRE2载体上,得到pRev... 目的:构建可用四环素调控的针对人eIF3g的人工microRNA表达载体,用于抑制肿瘤细胞中eIF3g的表达。方法:利用网络资源设计针对人eIF3g的人工microRNA,以PCR方法克隆,经DNA测序验证后亚克隆至四环素调控表达系统的pRevTRE2载体上,得到pRevTRE2-eIF3g-microRNA。将四环素调控表达系统的Tet-off质粒转染K562细胞获得稳定转染克隆后,再利用带有报告基因GFP的pRevTRE2-GFP转染选择调控能力较好的K562/Tet-off细胞株,将pRevTRE2-eIF3g-microRNA转染K562/Tet-off细胞,Westernblot检测eIF3g的表达,以研究eIF3g人工microRNA的作用效果。结果:DNA测序结果显示,针对人eIF3g的人工microRNA的克隆正确。pRevTRE2-GFP转染结果表明所选择的K562/Tet-off细胞株有较好的诱导功能。Westernblot结果显示,转染pRevTRE2-eIF3g-microRNA的K562/Tet-off细胞可用四环素调控eIF3g人工microRNA的表达从而抑制K562细胞中eIF3g的表达。结论:成功构建了可用四环素调控的eIF3g人工mi-croRNA表达载体,能有效调控K562细胞中eIF3g的表达。 展开更多
关键词 eIF3g MICRORNA 四环素诱导表达系统
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Tet-on慢病毒系统表达弓形虫ROP18的研究 被引量:2
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作者 王晓 朱君 +8 位作者 吴亮 吴腊梅 刘原 苏丹华 丁宁 赵康容 姜旭淦 陈盛霞 曹建平 《中国寄生虫学与寄生虫病杂志》 CAS CSCD 北大核心 2015年第1期25-28,共4页
目的用Tet-on慢病毒载体系统构建稳定表达弓形虫棒状体蛋白18(ROP18)的293T细胞株。方法PCR扩增ROP18基因序列插入慢病毒载体p LVCT-t TR-KRAB中,构建带有ROP18活性片段的慢病毒载体p LVCT-t TRKRAB-ROP18。经鉴定后将该重组载体(6μg)... 目的用Tet-on慢病毒载体系统构建稳定表达弓形虫棒状体蛋白18(ROP18)的293T细胞株。方法PCR扩增ROP18基因序列插入慢病毒载体p LVCT-t TR-KRAB中,构建带有ROP18活性片段的慢病毒载体p LVCT-t TRKRAB-ROP18。经鉴定后将该重组载体(6μg)与辅助质粒ps PAX2(4μg)和p MD2.G(2μg)共同转染293T细胞,荧光显微镜下观察细胞荧光。于转染后48和72 h收集含有慢病毒颗粒上清液,感染293T细胞。以1μg/ml强力霉素(DOX)诱导293T细胞表达ROP18,荧光显微镜下观察细胞荧光,RT-PCR法检测293T细胞中的ROP18表达情况。结果 PCR扩增rop18片段为960 bp,与预期大小一致。经PCR和酶切鉴定重组慢病素载体构建成功。转染48 h后,293T细胞于荧光显微镜下可见绿色荧光。经DOX诱导24 h即可观察到293T细胞中明亮绿色荧光。RT-PCR检测结果显示,293T细胞ROP18可产生960 bp特异条带,与预期结果一致。结论采用Tet-on慢病毒载体系统构建了稳定表达弓形虫ROP18的293T细胞株。 展开更多
关键词 刚地弓形虫 棒状体蛋白18 慢病毒 四环素诱导调控表达系统
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β-神经生长因子的诱导表达及其对角膜缘干细胞的作用 被引量:1
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作者 高杰 丁玲 +3 位作者 胡蓉 黄悦 苏敏 李红 《解剖学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第4期421-427,共7页
目的运用Tet-on 3G四环素诱导表达系统探讨β-神经生长因子(β-NGF)在人胚肾(HEK293FT)细胞中的过表达情况及其对角膜缘干细胞(LSCs)的作用。方法将p LVX-TRE3G-IRES-β-NGF和p LVX-Tet3G慢病毒在空白的HEK293FT细胞进行扩增,收获慢病毒... 目的运用Tet-on 3G四环素诱导表达系统探讨β-神经生长因子(β-NGF)在人胚肾(HEK293FT)细胞中的过表达情况及其对角膜缘干细胞(LSCs)的作用。方法将p LVX-TRE3G-IRES-β-NGF和p LVX-Tet3G慢病毒在空白的HEK293FT细胞进行扩增,收获慢病毒,再共转染HEK293FT细胞,同时用不同剂量强力霉素(Dox)诱导β-NGF表达(分为未转染组、1000、100和1000μg/L Dox诱导表达组)。48 h后收集细胞,免疫印迹法(Western blotting)检测各组细胞内β-NGF表达情况。体外分离培养LSCs,慢病毒共转染LSCs,分为对照组(未转染组)和诱导表达组[实验组A(慢病毒载体Dox 1000μg/L)、实验组B(慢病毒载体Dox 100μg/L)、实验组C(慢病毒空载体Dox 1000μg/L)],诱导表达48 h后细胞免疫荧光染色检测NGF及相关蛋白(p63、p38、Trk A)的表达情况。结果NGF在转染细胞内被诱导表达,随着Dox剂量增加,表达量增强,差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组及实验组C相比,实验组A的p63表达降低,Trk A表达降低,p38表达增加,差异有统计学意义(P<0.05);与对照组及实验组C相比,实验组B的p63表达增加,Trk A表达增加,p38表达降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论运用Tet-on 3G四环素诱导表达系统,可成功诱导表达不同剂量β-NGF蛋白,低剂量Dox诱导下NGF产生的微环境可促进LSCs的体外扩增,并能维持LSCs的干细胞特性。 展开更多
关键词 Β-神经生长因子 TET-ON 3G四环素诱导表达系统 强力霉素 角膜缘干细胞 免疫印迹法 免疫荧光 大鼠
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解纤维梭菌脱水四环素诱导的ClosTron基因打靶系统构建 被引量:2
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作者 崔古贞 花登雄 +5 位作者 管玉祝 鲍江舰 张馨月 谷俊莹 陈峥宏 洪伟 《微生物学通报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第9期2982-2990,共9页
【背景】解纤维梭菌是发酵木质纤维素生产乙醇的中温模式菌株,构建可控诱导的基因打靶技术是研究解纤维梭菌遗传调控的重要手段。【目的】在解纤维梭菌中构建脱水四环素诱导的ClosTron基因打靶系统。【方法】首先,分析解纤维梭菌对脱水... 【背景】解纤维梭菌是发酵木质纤维素生产乙醇的中温模式菌株,构建可控诱导的基因打靶技术是研究解纤维梭菌遗传调控的重要手段。【目的】在解纤维梭菌中构建脱水四环素诱导的ClosTron基因打靶系统。【方法】首先,分析解纤维梭菌对脱水四环素的敏感性,筛选合适的诱导剂浓度,并以β-葡萄糖苷酶为报告基因,检测其在解纤维梭菌中的诱导效果。然后,将脱水四环素诱导型操纵子与II型内含子元件组合,构建脱水四环素诱导的ClosTron质粒。最后,以解纤维梭菌mspI、ldh和ack为例,检测其在解纤维梭菌中的打靶效率。【结果】脱水四环素诱导系统在解纤维梭菌中能够诱导ClosTron元件表达,在mspI、ldh和ack这3个基因位点的打靶效率分别为29.48%±15.51%、23.61%±7.08%和28.09%±6.97%。【结论】在解纤维梭菌中成功构建脱水四环素诱导的ClosTron基因打靶系统,为梭菌基因工程改造奠定了基础。 展开更多
关键词 解纤维梭菌 脱水四环素诱导系统 ClosTron Ⅱ型内含子
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基于dCasMINI蛋白的CRISPRi工具设计及其效果探究
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作者 陈信文 曹佳璇 饶书权 《基础医学与临床》 CAS 2024年第6期821-827,共7页
目的探索基于去活化CasMINI蛋白(dCasMINI)的CRISPR干扰(CRISPRi)工具设计及其转录抑制效果评估。方法采用四环素诱导基因开启系统(tet-on),流式细胞测量术和实时荧光定量反转录聚合酶链反应从质粒基因、基因组外源性基因位点和内源性... 目的探索基于去活化CasMINI蛋白(dCasMINI)的CRISPR干扰(CRISPRi)工具设计及其转录抑制效果评估。方法采用四环素诱导基因开启系统(tet-on),流式细胞测量术和实时荧光定量反转录聚合酶链反应从质粒基因、基因组外源性基因位点和内源性基因位点三个层次评估dCasMINI系统在哺乳动物细胞中的转录抑制效果,并进一步设计和比较6种dCasMINI-CRISPRi工具(dCasMINI、dCasMINI-ZIM3 KRAB、dCasMINI-KRAB-MeCP2、dCasMINI-ZNF324 KRAB、dCasMINI-3x KRAB和dCasMINI-Com-KRAB-MeCP2)和不同位置单链引导RNA(single guide RNA,sgRNA)的转录抑制效果。结果dCasMINI、dCasMINI-ZIM3 KRAB、dCasMINI-KRAB-MeCP2、dCasMINI-ZNF324 KRAB、dCasMINI-3x KRAB和dCasMINI-Com-KRAB-MeCP2能够不同程度地抑制质粒基因、基因组外源性基因的转录(P<0.05);dCasMINI-ZIM3 KRAB、dCasMINI-KRAB-MeCP2、dCasMINI-ZNF324 KRAB和dCasMINI-Com-KRAB-MeCP2能够不同程度地抑制内源性基因的转录(P<0.05);不同结合位点的sgRNA具有不同的转录抑制效果(P<0.05)。结论CasMINI系统能够改造成多种CRISPRi工具进行基因敲降研究,未来有望应用在多个场景,如原代细胞表观基因编辑、体内筛选和临床治疗等。 展开更多
关键词 CRISPR干扰 dCasMINI 敲降 四环素诱导基因开启系统(tet-on)
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细胞周期蛋白依赖性激酶抑制蛋白2A(CDKN2A/p16^(INK4a))在MCF7细胞中的可诱导表达并引起F-actin的重分布 被引量:2
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作者 梁剑青 王嫚娜 +6 位作者 张峥嵘 袁龙 郑幽 黄红艳 孙强 王菊芳 王小宁 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2017年第4期465-470,共6页
目的使用四环素操纵子(Tet-on)可控表达系统研究细胞周期蛋白依赖性激酶抑制蛋白2A(CDKN2A/p16^(INK4a))对MCF7乳腺癌细胞形态及细胞骨架的影响。方法以p16^(INK4a)表达缺失的MCF7乳腺癌细胞为宿主细胞,用慢病毒通过"两步感染法&qu... 目的使用四环素操纵子(Tet-on)可控表达系统研究细胞周期蛋白依赖性激酶抑制蛋白2A(CDKN2A/p16^(INK4a))对MCF7乳腺癌细胞形态及细胞骨架的影响。方法以p16^(INK4a)表达缺失的MCF7乳腺癌细胞为宿主细胞,用慢病毒通过"两步感染法"建立MCF7-p Tet-on-p16^(INK4a)可诱导表达细胞系,加入诱导剂强力霉素(Dox)诱导目的基因表达;细胞计数检测细胞生长变化;采用免疫细胞化学染色检测上皮钙黏素(E-cadherin)表达,采用鬼笔环肽(phalloidin)标记纤维型肌动蛋白(F-actin),观察p16^(INK4a)对细胞间黏附连接、细胞骨架的影响;用显微镜对细胞拍照后,用Image J软件进行形态分析。结果成功建立了可诱导表达p16^(INK4a)的MCF7稳定细胞系,Dox可以有效诱导p16^(INK4a)的表达;诱导条件下稳定表达p16^(INK4a)的MCF7细胞增殖受抑制,细胞体积增大,轮廓线延长;而对照MCF7细胞F-actin主要定位于胞质,p16^(INK4a)表达的细胞内F-actin向细胞边缘分布增加。结论 p16^(INK4a)在MCF7细胞中的表达可以导致细胞体积增大、细胞间黏附连接弱化、F-actin向细胞外周重新分布。 展开更多
关键词 P16INK4A 四环素操纵(Tet—on)可诱导系统 细胞骨架 F-ACTIN
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慢病毒介导KIF4A稳定诱导敲降MCF7细胞株的建立
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作者 闫鲁霞 程蓓蓓 +1 位作者 周之春 朱长军 《天津师范大学学报(自然科学版)》 CAS 北大核心 2022年第3期55-59,67,共6页
为了构建驱动蛋白KIF4A基因稳定诱导敲降细胞株Tet-shKIF4A/MCF7,应用Tet诱导基因敲降慢病毒载体系统,将慢病毒载体质粒Tet-plko-puro-shKIF4A与包装质粒psPAX2和pMD2.G共转染至293T细胞中,产生慢病毒颗粒.使用慢病毒感染MCF7细胞,用嘌... 为了构建驱动蛋白KIF4A基因稳定诱导敲降细胞株Tet-shKIF4A/MCF7,应用Tet诱导基因敲降慢病毒载体系统,将慢病毒载体质粒Tet-plko-puro-shKIF4A与包装质粒psPAX2和pMD2.G共转染至293T细胞中,产生慢病毒颗粒.使用慢病毒感染MCF7细胞,用嘌呤霉素筛选出稳定诱导敲降KIF4A细胞株Tet-shKIF4A/MCF7.通过免疫印迹方法检测Tet-shKIF4A/MCF7细胞中KIF4A蛋白的表达水平,对诱导敲降KIF4A的四环素药物的浓度和敲降时间进行优化.应用免疫荧光染色的方法检测对照细胞和Tet-shKIF4A/MCF7细胞内的KIF4A的表达以及有丝分裂细胞形态的变化.结果表明,本研究成功构建了KIF4A基因稳定诱导敲降细胞株Tet-shKIF4A/MCF7,诱导敲降KIF4A的四环素药物最佳质量浓度为50μg/mL,最佳诱导时间为36 h.本研究为深入探究KIF4A在细胞生命活动中的功能以及细胞周期的分子作用机制提供了重要实验材料. 展开更多
关键词 慢病毒 KIF4A 四环素诱导敲降系统 MCF7细胞株
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沉默MKRN1基因表达对人胚胎肾细胞HEK-293T增殖及凋亡的影响
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作者 张艺 吴道秋 +4 位作者 汤弘婷 李梦醒 刘虹麟 陈忠良 李琴山 《中国组织工程研究》 CAS 北大核心 2023年第24期3838-3844,共7页
背景:研究报道敲低MKRN1可以抑制肿瘤细胞的生长,但MKRN1是否作为肿瘤相关蛋白在机体发挥作用还需进一步研究。由于siRNA介导的基因沉默是瞬时表达,持续时间短且常规慢病毒技术存在脱靶效应,利用四环素调控(Tet-on)慢病毒系统构建稳定沉... 背景:研究报道敲低MKRN1可以抑制肿瘤细胞的生长,但MKRN1是否作为肿瘤相关蛋白在机体发挥作用还需进一步研究。由于siRNA介导的基因沉默是瞬时表达,持续时间短且常规慢病毒技术存在脱靶效应,利用四环素调控(Tet-on)慢病毒系统构建稳定沉默MKRN1基因的细胞系有着可逆的优势,且可规避上述缺点,对于深入研究MKRN1的生物学功能有重要的意义。目的:构建Tet-on慢病毒系统介导的MKRN1基因沉默载体,研究沉默MKRN1基因表达对人胚胎肾细胞HEK-293T增殖、凋亡的影响。方法:采用RNAi技术,针对MKRN1基因设计3条shRNA(命名为sh1,sh2,sh3),将3条shRNA序列连入四环素诱导表达载体pTripz中验证连入序列;通过三质粒系统转染HEK-293T细胞,并用含有1 mg/L强力霉素的完全培养基培养,进行慢病毒包装,收取48 h及72 h病毒液,将其浓缩后感染HEK-293T细胞,感染48 h后用荧光显微镜观察病毒感染效率。通过实时荧光定量PCR、Western blot检测MKRN1的敲减效率;Western blot检测四环素诱导表达系统是否构建成功;通过集落形成实验及Western blot检测沉默MKRN1表达后对HEK-293T细胞增殖、凋亡能力的影响。结果与结论:(1)设计的3条MKRN1-短发夹RNA(sh1、sh2、sh3),均成功连入Tet-on载体,且各组载体序列正确;通过慢病毒成功感染HEK-293T细胞;(2)实时荧光定量PCR及Western blot检测发现3条shRNA序列中1号序列敲低MKRN1水平明显降低(P<0.05),且沉默组不加入强力霉素诱导后目的基因的表达得到回复;(3)集落形成实验发现沉默MKRN1后HEK-293T细胞增殖能力下降(P<0.05);Western blot检测敲低MKRN1后,增殖细胞核抗原表达下调,细胞凋亡相关指标BAX表达增加,Bcl2表达下调,Bcl2/BAX的比值下调(P<0.001);(4)结论:采用Tet-on慢病毒载体系统构建了稳定沉默MKRN1的HEK-293T细胞株,且沉默MKRN1后能够抑制HEK-293T细胞的增殖,并促进其凋亡。通过构建稳定沉默MKRN1的HEK-293T细胞可为进一步研究MKRN1的生物学功能奠定基础,也为研究其他基因的生物学功能提供一个方法学上的参考。 展开更多
关键词 MKRN1基因 四环素诱导调控表达系统 基因表达调控 慢病毒
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稳定整合pTet-on载体小鼠胚胎干细胞株的建立 被引量:2
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作者 张梅英 李华 +8 位作者 董婉维 杨葳 秦英 汪瑛 周生来 于洋 王惟 王太一 王禄增 《中国实验动物学报》 CAS CSCD 2006年第3期161-166,F0011,共7页
目的建立稳定整合Tet-on基因的ES-D3细胞系,用于人胰岛素基因(pTRE2-human-Ins)在ES-D3细胞中诱导表达调控的研究。方法通过电穿孔转染的方法,将pTet-on质粒导入ES-D3细胞中,利用G418的药物选择特性,对转染的ES-D3细胞进行压力筛选,用PC... 目的建立稳定整合Tet-on基因的ES-D3细胞系,用于人胰岛素基因(pTRE2-human-Ins)在ES-D3细胞中诱导表达调控的研究。方法通过电穿孔转染的方法,将pTet-on质粒导入ES-D3细胞中,利用G418的药物选择特性,对转染的ES-D3细胞进行压力筛选,用PCR和Southern blot方法进行DNA整合鉴定,并用瞬时转染荧光素酶报告基因(pTRE-Luc)对筛选的Tet-on阳性克隆株的功能进行鉴定。结果经400μg/mL的G418压力筛选后,获得了11个细胞克隆株,特异性核苷酸引物检测细胞基因组DNA,有9个ES-D3细胞株可以扩增出相应的核苷酸片段,部分Tet-on阳性ES-D3株Southern blot鉴定结果表明Tet-on基因片段已整合入ES-D3细胞基因组DNA,荧光素酶报告基因功能鉴定获得1株诱导表达倍率为21.31的ES-D3细胞株,且Tet-on基因阳性ES-D3细胞的形态和生长速度与正常ES-D3细胞没有差异。结论通过电穿孔转染的方法成功地获得1株诱导表达倍率为21.31的高表达ES-D3细胞株,为进行目的基因(pTRE2-human-Ins)在ES-D3细胞中转染和诱导表达打下了基础。 展开更多
关键词 四环素诱导表达系统 电穿孔 ES-D3 细胞
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Construction of a Tapetum-Specific and Tetracycline-Inducible System 被引量:2
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作者 唐孙勇 余波澜 +3 位作者 牛恒尧 张利明 孙勇如 李文彬 《Acta Botanica Sinica》 CSCD 2003年第1期64-67,共4页
A regulated gene expression system would offer the unique opportunity to study the gene physiological functions at different developmental stages. For realizing gene special expression in plant anther at given time, w... A regulated gene expression system would offer the unique opportunity to study the gene physiological functions at different developmental stages. For realizing gene special expression in plant anther at given time, we constructed a new system that combined tetracycline- inducible elements with TA29 promoter, a tapetum-specific promoter of tobacco. The system was tested in transient GUS assay system by electroporation (gene gun) transformation of tobacco ( Nicotiana tabacum L. cv. Winsconsin 38) anther. In the absence of tetracycline as the inducer, no GUS activity was detected. However, strong GUS expression was observed in tapetum. tissue upon tetracycline induction, and little GUS activity was found outside the tapetum. Our results suggested that gene expression can be restricted to a specific tissue at the given time under the control of this new system, and this system would be a very useful tool for both basic plant biology research and biotechnological applications. 展开更多
关键词 TETRACYCLINE INDUCIBLE TA29 plant gene engineering
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条件化转染MT基因小鼠模型的建立 被引量:1
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作者 王延安 郑家伟 +6 位作者 费照亮 蒋欣泉 李金忠 徐骎 王铸钢 费俭 张志愿 《中华医学遗传学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2006年第3期260-264,共5页
目的建立四环素诱导调控的MT转基因小鼠模型,为血管瘤试验研究及MT致瘤机理研究奠定基础。方法通过PCR方法从鸡的基因组序列中克隆绝缘子元件;构建四环素诱导调控的条件化转基因质粒,并将其调控元件和受控元件串联成一个载体,在两元件... 目的建立四环素诱导调控的MT转基因小鼠模型,为血管瘤试验研究及MT致瘤机理研究奠定基础。方法通过PCR方法从鸡的基因组序列中克隆绝缘子元件;构建四环素诱导调控的条件化转基因质粒,并将其调控元件和受控元件串联成一个载体,在两元件之间插入绝缘子,以减轻两者之间的相互干扰。为提高转基因的表达效率,在转基因盒的上游亦插入绝缘子元件;将MT基因亚克隆至此载体;转基因载体功能行细胞瞬转试验及半定量逆转录PCR验证后,将其在体外扩增、酶切、回收,行小鼠受精卵原核注射,获得转染MT基因阳性小鼠;强力霉素体外诱导部分阳性鼠MT基因表达,使其具有血管瘤表型。结果绝缘子元件成功克隆;成功构建条件化转基因载体;体外试验证实目的基因的表达受强力霉素的严格调控;通过原核注射,获得5只转基因阳性鼠;2只行体外诱导2月后,1只出现血管瘤表型,逆转录PCR检测证实MT表达。其余3只阳性小鼠在传代建系中。结论条件化MT转基因小鼠模型成功构建,此小鼠模型能够为血管瘤的试验研究及MT致瘤机理的体内研究提供一定的基础。 展开更多
关键词 转基因 四环素诱导调控系统 显微注射 动物模型 多瘤病毒 血管瘤 小鼠 模型建立
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