副溶血弧菌calR的基因敲除株与回补株构建

目的构建副溶血弧菌calR的基因突变株和回补株,为研究CalR的功能奠定基础。方法 PCR扩增calR基因的同源臂融合片段,并直接克隆入自杀质粒p DS132中。通过接合转移的方式将重组自杀质粒转入副溶血弧菌RIMD2210633株(WT)中,利用同源重组的方法替换原始calR基因以构建calR无痕突变株(ΔcalR)。PCR扩增calR的基因序列,并将其直接克隆入p BAD33质粒中,构建回补质粒。将回补质粒转入到ΔcalR中,即得回补株(ΔcalR/calR∷p BAD33)。将vop N的启动子区克隆入p HRP309质粒的β-半乳糖苷酶基因上游,构建Lac Z重组质粒,并将该重组质粒分别转入WT/p BAD33、ΔcalR/p BAD33和ΔcalR/calR∷p BAD33中,通过测定并比较3株菌中β-半乳糖苷酶活性的差异来判定CalR对vop N的调控关系。结果与结论 Lac Z结果表明,CalR负调控vop N的转录,且回补株的回补效果良好,表明成功构建了副溶血弧菌calR基因的突变株和回补株,为后续对CalR的功能研究打下了基础。

耐辐射奇球菌pprM基因回补株的构建与鉴定

目的 构建耐辐射奇球菌prM基因缺失回补菌株,为进一步研究PprM蛋白的功能奠定实验基础.方法 设计并合成HA-pprM基因（HA为流感病毒血凝素）全长的引物,以无突变的pGEX-6p-1-pprM载体为模板,PCR扩增出携带NdeⅠ酶切位点的HA-pprM基因全长,经NdeⅠ酶切后,与pRADK载体连接并转化大肠杆菌,经培养、提取质粒及纯化后,采用酶切鉴定以及基因测序方法确认插入序列的正确性;采用CaC12法将构建好的重组质粒pRADK-HA-pprM转化到耐辐射奇球菌pprM基因缺失的菌株中,通过Western blot验证HA-PprM融合蛋白的表达.结果 构建的重组质粒pRADK-HA-pprM经NdeⅠ酶切鉴定结果符合目的条带大小（438 bp）,测序结果显示插入的寡核苷酸序列及方向与预期的一致,Western blot结果显示HA-PprM融合蛋白的相对分子质量约为13 000.结论 笔者成功构建了重组质粒pRADK-HA-pprM,为进一步研究与PprM蛋白相互作用的靶DNA的筛选奠定了良好的基础.

肠炎沙门菌spvD基因缺失与回补株的构建及其对Caco-2细胞毒力的研究

目的探讨肠炎沙门菌spvD基因对人克隆结肠腺癌Caco-2细胞侵袭力及胞内增殖力的影响。方法利用自杀质粒介导的同源重组技术构建spvD基因缺失株,PCR扩增并克隆spvD基因于pBAD33表达载体获得回补质粒,导入相应缺失株得到回补株,并将pBAD33导入野生株及缺失株作为空载对照。荧光定量反转录聚合酶链式反应检测spvD mRNA表达水平。以Caco-2细胞作为体外模拟人肠上皮细胞模型,分别将野生株、缺失株及回补株与其共培养,探究spvD基因对Caco-2细胞的毒力。使用LSD-t检验进行3组间spvD mRNA表达水平比较及胞内活菌数比较,使用χ^(2)检验进行3组间侵袭率的比较。结果以野生株spvD mRNA表达量作为单位“1”,缺失株为“0.00”、回补株为“2.60”(LSD-t野生株,缺失株=1.11,P=0.31;LSD-t_(野生株,回补株)=-1.77,P=0.13;LSD-t_(缺失株,回补株)=-2.88,P=0.03),该结果证实了缺失株及回补株的成功构建。上述3组肠炎沙门菌对Caco-2细胞的侵袭实验结果显示,野生株侵袭率为0.23%,缺失株侵袭率为0.16%,回补株侵袭率为0.16%,差异无统计学意义(χ^(2)=1.13,P=0.570)。通过比较细菌干预Caco-2细胞后不同时间点胞内活菌数,发现在干预16 h时,野生株(6.50×10^(6) CFU/ml)、回补株(7.25×10^(6) CFU/ml)胞内活菌数明显增多,均高于缺失株(1.90×10^(6) CFU/ml)(LSD-t野生株,缺失株=7.95,P=0.00;LSD-t_(野生株,回补株)=-1.27,P=0.25;LSD-t_(缺失株,回补株)=-9.22,P=0.00)。结论尚不能认为spvD基因影响肠炎沙门菌对Caco-2细胞的侵袭力,但该基因可促进肠炎沙门菌在Caco-2细胞内增殖。