脑肿瘤干细胞体外分化过程中的回逆现象分析

目的探讨脑肿瘤干细胞(BTSCs)体外分化过程中的回逆现象,为研究其分化抑制机制奠定基础。方法利用CD133免疫磁珠筛选系统,从肿瘤组织中分离获得的CD133^-细胞(BTSCs)分成4组进行培养:(1)含10%胎牛血清(FCS);(2)10%FCS+丙戊酸钠注射液(VPA);(3)无FCS+生长因子;(4)无FCS+生长因子+VPA。取不同时间点上的细胞,相差显微镜观察其形态变化;流式细胞术检测与分化相关的标志物、细胞周期和DNA倍体变化:利用免疫激光共聚焦分析与分化相关标志物的共表达情况。结果无FCS条件下培养的BTSCs呈悬浮球状生长,高表达CD133和巢蛋白(nestin),不表达胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和β-微管蛋白Ⅲ(β-TubulinⅢ)。G0/G1期细胞占大多数,G2/M期细胞接近0%,DNA都是异倍体,对VPA反应不敏感。含FCS培养的原本悬浮的细胞约4h开始贴壁,均呈圆形。此后逐渐向多形性分化,至7d时分化的细胞部分又返回至圆形,至10 d～21d时,有的还能重新恢复球形,并呈悬浮生长。培养3d、7d、10d和21d时,CD133、nestin阳性细胞数先降后升,GFAP^+和β-TubulinⅢ^-细胞数始终处于较低水平。含FCS培养液中加入VPA,细胞形态上未见上述的回逆现象,CD133和nestin表达的先降后升现象消失,GFAP和β-TubulinⅢ在第7天以后表达明显升高,但极大部分细胞共表达nestin。而神经干细胞(NSCs)在含FCS培养至10 d时,即以GFAP和β-TubulinⅢ表达为主,未见CD133^+细胞。此外,含血清培养时BTSCs仍以异倍体为主,含少量的G2/M期细胞,加VPA诱导后细胞周期和DNA倍体变化不明显。结论BTSCs在含血清条件下培养出现的多向分化表型不稳定,时有去分化所导致的回逆。加入诱导分化剂VPA培养,虽然能阻止回逆现象出现,并有代表星形胶质细胞和神经元标志物表达上升,但因其共表达nestin而仍属于未完全分化细胞,表明BTSCs分化始终处于受抑状态。