特异性抑制转化生长因子β激活激酶1活性对妊娠期糖尿病孕妇外周血单核细胞炎症通路的影响

目的探讨特异性抑制转化生长因子β激活激酶1(TAK1)活性的变化对妊娠期糖尿病(GDM)孕妇外周血单核细胞炎症通路的影响。方法选取GDM孕妇及正常孕妇各30例,采集外周静脉血,分离单核细胞和血浆。依据细胞加药组别的不同,分为LPS刺激组(L组)、脂多糖组(LPS组)、TAK1抑制剂组(LT组)、TAK1抑制剂组(T组)及空白对照组(W组),培养、加药后Western blot检测TAK1及核转录因子-κB(NF-κB)蛋白的表达量,酶联免疫吸附法(ELISA)检测血浆中LPS浓度及各组炎症因子[白介素-1(IL-1)、白介素-10(IL-10)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)]水平,比较各组结果的差异,探讨TAK1的作用。结果 GDM孕妇与正常孕妇比较,血浆LPS浓度升高;TAK1及NF-κB蛋白表达量增加,炎症因子(IL-1、IL-10、TNF-α)水平升高,差异有统计学意义(P<0.05)。各小组间比较,L组相较于其他组的TAK1、NF-κB蛋白表达量增加,炎症因子(IL-1、IL-10、TNF-α)表达水平升高,差异有统计学意义(P<0.05);正常孕妇中,LT组、T组、W组NF-κB蛋白表达量比较,差异无统计学意义(P>0.05),LT组、T组未检测到TAK1明显表达,可检测到W组少量表达,LT组相对于T组,TNF-α、IL-1、IL-10表达水平升高(P<0.05),LT组、T组与W组上清炎症因子表达水平比较,差异无统计学意义(P>0.05);GDM孕妇中,LT组、T组、W组TAK1及NF-κB蛋白表达量比较,差异无统计学意义(P>0.05),LT组相对于T组,TNF-α、IL-1、IL-10表达水平升高(P<0.05),Pearson相关性分析发现,TAK1、NF-κB蛋白表达量与炎症因子(IL-1、IL-10、TNF-α)水平呈正相关(P<0.05)。结论 TAK1可能参与GDM孕妇外周血单核细胞炎症通路的形成,抑制TAK1的活性,可以下调通路下游关键介质NF-κB及炎症因子的表达。

下调转化生长因子β激活激酶1抑制胰腺神经内分泌肿瘤转移和侵袭

目的探究转化生长因子β激活激酶1(TAK1)在胰腺神经内分泌肿瘤(p-NENs)进展中的作用与影响。方法采用实时定量荧光聚合酶链反应(qRT-PCR)和蛋白印迹法(Western blotting)检测p-NENs细胞株(BON-1)、人正常胰腺导管上皮细胞系(hTERT-HPNE)和人胰腺导管腺癌细胞系(CFPAC-1)中TAK1表达情况。采用靶向TAK1的短发夹RNA(shRNA),以慢病毒为载体对BON-1进行基因敲降。通过四甲基偶氮唑蓝(MTT)法和EdU实验观察细胞增殖活力,Transwell实验观察细胞侵袭与迁移能力变化,Western blotting检测上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)相关标志性蛋白表达。结果BON-1中TAK1 mRNA和蛋白质水平的表达相较于hTERT-HPNE和CFPAC-1明显升高(P<0.05),抑制BON-1中TAK1的表达后,细胞的增殖能力无明显变化,但细胞的迁移和侵袭能力明显减弱(P<0.05)。与对照组相比,敲降组的EMT相关蛋白中,上皮细胞标志性蛋白E-cadherin表达升高,间质细胞标志性蛋白Vimentin和N-cadherin表达明显降低(P<0.05)。结论在BON-1中,抑制TAK1的表达能够抑制肿瘤细胞的EMT过程,降低细胞的迁移和侵袭能力,从而抑制p-NENs的进展。

转化生长因子β激活激酶1介导的细胞自噬在小鼠脑缺血-再灌注损伤中的作用

目的评价转化生长因子β激活激酶1(TGFβ-activated kinase-1,TAK1)介导的细胞自噬在小鼠脑缺血-再灌注(ischemia-reperfusion,IR)损伤中的作用。方法雄性昆明小鼠72只,8周龄,体重(25.0±3.5)g,采用随机数字表法分为六组:空白对照组(C组)、假手术组(S组)、IR组、TAK1短发夹RNA(shRNA)慢病毒组(T组)、阴性对照慢病毒组(Y组)和生理盐水组(NS组),每组12只。T组、Y组和NS组分别以1μl/min侧脑室注射TAK1shRNA慢病毒、阴性对照慢病毒和等量生理盐水10μl。2周后IR组、T组、Y组和NS组制备脑IR损伤模型,缺血2h后恢复灌注;S组分离颈总动脉但不夹闭,其余手术步骤同IR组。再灌注24h后进行神经功能缺陷评分(neurological severity scores,NSS);NSS评分完成后处死小鼠,取脑组织测定脑梗死体积;Western blot法检测小鼠脑组织TAK1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1和p62蛋白含量。结果 IR组、T组、Y组和NS组NSS评分和脑梗死体积百分比明显高于C组(P<0.05);T组NSS评分和脑梗死体积百分比明显低于IR组(P<0.05)。IR组、Y组和NS组脑组织TAK1蛋白含量明显高于C组(P<0.05);T组脑组织TAK1蛋白含量明显低于IR组(P<0.05)。IR组、T组、Y组和NS组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值、Beclin1蛋白含量明显高于C组(P<0.05),p62蛋白含量明显低于C组(P<0.05);T组脑组织LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值、Beclin1蛋白含量明显低于,p62蛋白含量明显高于IR组(P<0.05)。结论 TAK1介导的细胞自噬参与小鼠脑缺血-再灌注损伤机制。

泼尼松龙可抑制转化生长因子β激活激酶1诱导的成骨细胞凋亡

背景:研究显示转化生长因子β激活激酶1(transforming growth factor beta activated kinase 1,TAK1)在骨、关节的发育以及骨形态信号转导中发挥着重要作用,与骨关节炎的发生也存在一定的相关性。目的:探究泼尼松龙通过抑制TAK1表达对诱导成骨细胞凋亡的影响。方法:将M3T3-E1成骨细胞经原代培养后传代培养。取第3代细胞分为3组,正常细胞组(对照组)、阴性转染+泼尼松龙组、TAK1 siRNA转染+泼尼松龙组。采用碱性磷酸酶染色和钙结节染色评估成骨细胞分化能力的变化;采用免疫印迹法(Western blot)检测细胞内磷酸化(p)-TAK1、TAK1、磷酸化c-jun氨基末端激酶(p-JNK)、JNK蛋白表达,MTT法检测M3T3-E1细胞增殖情况;流式细胞仪检测细胞周期以及细胞凋亡变化。结果与结论:①TAK1 siRNA转染+泼尼松龙组细胞的碱性磷酸酶红染程度较少,阴性转染+泼尼松龙组次之,正常细胞组碱性磷酸酶染色最多;钙结节染色显示与正常细胞组相比,阴性转染+泼尼松龙组钙结节数量明显减少,TAK1 siRNA转染+泼尼松龙组结节数量最少;②荧光显微镜显示,阴性转染+泼尼松龙组细胞出现破碎,形态发生改变,TAK1 siRNA转染+泼尼松龙组破碎细胞数量明显增加;③Western Blot显示,3组间p-TAK1、p-JNK蛋白表达量逐渐降低(P<0.05);④MTT检测显示,3组间TAK1 siRNA转染+泼尼松龙组细胞增殖抑制率最高(P<0.05);在12-48h随着时间的延长,细胞增殖抑制率呈逐渐上升趋势,在72h时开始下降;⑤流式细胞仪检测结果显示,TAK1 siRNA转染+泼尼松龙组G2期细胞比例高于其他2组,S期细胞比例显著低于其他2组(P<0.05);⑥TAK1 siRNA转染+泼尼松龙组细胞凋亡率明显高于正常细胞组、阴性转染+泼尼松龙组(P<0.05);⑦结果说明,沉默TAK1表达后能够增强泼尼松龙诱导成骨细胞凋亡的作用,可能与JNK信号通路相关。

转化生长因子β激活激酶1抑制剂对糖尿病小鼠肾脏的保护作用及机制

目的探讨转化生长因子β激活激酶1（TGF-βactivated kinase-1，TAK1）抑制剂（5Z-7-oxozeaenol，OZ）对糖尿病db／db小鼠肾脏的保护作用及机制。方法健康雄性db／db小鼠随机分为db／db组（n=12）和db／db＋OZ组（n=12），另取WT小鼠（n=12）作为对照组。OZ2mg／kg隔日腹腔注射。第8、12周末测定血糖、体质量、肾质量及24h尿白蛋白排泄率；光镜、电镜观察。肾组织病理改变；免疫组化检测NF—kBp65、单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）与TNF-α表达；Western印迹检测磷酸化（P）-TAK1、转化生长因子B活化激酶结合蛋白1（TAB1）、p-p38MAPK及白细胞介素1p（IL-1p）蛋白表达；实时定量PCR检测细胞间细胞黏附分子1（ICAM-1）与MCP-1mRNA表达。结果8～12周时db／db小鼠血糖、体质量、肾质量及24h尿白蛋白排泄率显著高于对照组（P〈0．01），而db／db＋OZ组上述指标低于db／db组（P〈0．05）。8～12周db／db小鼠病理形态学表现为肾小球体积增大、细胞外基质增多，TAKl抑制剂可显著改善肾组织病理改变。免疫组化显示8～12周时db／db小鼠肾组织NF—KBp65、MCP-1和TNF-α表达显著高于对照组（P〈0．05），而db／db＋OZ组上述指标显著低于db／db组（P〈0．05）。Western印迹结果显示8—12周时db／db组小鼠p-TAKl、TAB1、p-p38MAPK和IL-1β蛋白表达显著高于对照组（P〈0．05），而db／db＋OZ组上述指标低于db／db组（P〈0．05）。实时定量PCR结果显示，db／db小鼠ICAM-1、MCP-1mRNA表达显著高于对照组（P〈0．01），而db／db＋OZ组上述指标显著低于db／db组（P〈0．05）。结论TAK1抑制剂可能通过抑制MAPK及NF—KB信号通路来抑制炎性反应，从而减轻糖尿病肾脏损伤。

转化生长因子β激活激酶1在非小细胞肺癌中的表达及意义

目的 探讨转化生长因子β激活激酶1（transforming growth factorβ-activated kinase 1,TAK1）在人非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）中的表达及意义。方法 行手术治疗NSCLC患者90例,采用免疫组织化学方法检测90份NSCLC组织（NSCLC组）及40份癌旁正常组织（对照组）中TAK1蛋白表达,分析TAK1表达量与NSCLC患者临床病理特征的关系。结果NSCLC组TAK1阳性表达率（80.0%）高于对照组（17.5%）,差异有统计学意义（P〈0.05）;NSCLC患者TAK1阳性率在不同临床分期（χ~2=7.647,P=0.006）、分化程度（χ~2=10.852,P=0.004）及有无淋巴结转移（χ~2=5.511,P=0.019）上差异有统计学意义。结论 TAK1可能与NSCLC的发生、发展有关。

转化生长因子β激活激酶-1在乳腺癌组织中的表达及临床意义

目的探讨转化生长因子β激活激酶-l(TAK1)在乳腺癌组织中的表达及临床意义。方法2011年8月一-2013年2月随机选择病理科送检的乳腺标本180例,其中正常乳腺组织80例,乳腺纤维瘤组织60例,乳腺癌组织40例,均进行免疫组化分析TAK1表达情况,并对乳腺癌的病理特征进行相关性分析。结果正常乳腺组织细胞排列有序,细胞形态完整;乳腺纤维瘤组织显示大量腺腔或细胞条索;乳腺癌组织显示为癌组织呈条索或岛屿状分布,在间质内浸润性生长。TAK1在3组中的阳性表达率分别为7.50%、46.67%和70.00%,组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。TAK1的阳性表达率在不同腋窝淋巴结转移状况和临床分期中对比差异有显著性(P<0.05),乳腺癌患者不同年龄、BMI与病理类型中的对比差异无显著性(P>0.05)。结论FAK1在乳腺癌组织中呈现高阳性表达,并且与病理学转移、临床分期有明显相关性,可能是导致乳腺癌发生发展的因素之一。

转化生长因子β激活激酶1对缺氧缺血性脑损伤中小胶质细胞焦亡的调控作用

目的初步探讨转化生长因子β激活激酶1(transforming growth factor beta-activated kinase 1,TAK1)对缺氧缺血性脑损伤(hypoxic-ischemic brain damage,HIBD)中小胶质细胞焦亡的调控作用。方法分离胎鼠原代小胶质细胞,随机分为4组接受不同处理,分别为对照组、5z-7-oxozeaneol(5z-7)组、氧糖剥夺(oxygen-glucose deprivation,OGD)组和OGD+5z-7组,其中5z-7为小分子TAK1抑制剂。应用分子生物学及形态学方法对处理后的0 h、6 h及24 h各组磷酸化TAK1(phosphorylated TAK1,P-TAK1)水平及NOD样受体家族蛋白3(NOD-like receptor pyrin domain containing 3,NLRP-3)、凋亡相关点状蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD,ASC)寡聚体、Gasdermin D-N端(GSDMD-N)、白细胞介素1β(interleukin 1β,IL-1β)等焦亡相关蛋白表达水平与乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)及小胶质细胞焦亡水平进行检测和比较。结果(1)与对照组相比,OGD组0 h上述蛋白表达水平及LDH值差异无统计学意义(P>0.05),6 h、24 h时P-TAK1水平降低,NLRP-3、ASC寡聚体、GSDMD-N、IL-1β、LDH水平升高(P<0.05),电镜下见小胶质细胞胞膜连续性破坏、胞浆溢出、核内染色质边聚等焦亡表现;(2)5z-7组、OGD+5z-7组6 h、24 h P-TAK1水平分别低于对照组、OGD组,而NLRP-3、ASC寡聚体、GSDMD-N、IL-1β、LDH水平升高(P<0.05)。结论TAK1磷酸化水平的下调对HIBD中小胶质细胞的焦亡具有促进作用,且该作用与上调NLRP-3的表达及ASC的寡聚化水平有关。

硫辛酰胺对高糖条件下肾小管上皮细胞氧化应激及转化生长因子β激活酶1和核转录共抑制因子蛋白表达的影响

目的通过观察高糖环境下给予硫辛酰胺(dl alpha lipoamide,ALM)干预后对细胞氧化应激水平、转化生长因子β激活激酶1(TAK1)及核转录共抑制因子(SnoN)蛋白表达的影响,探讨ALM减轻高糖诱导诱导的肾小管纤维化病变的可能机制。方法将体外培养的肾小管上皮细胞(NRK 52E)分为3组:正常糖培养组(NG)、高糖组培养组(HG)、高糖培养条件下加入ALM刺激组(ALM);采用细胞免疫荧光及Western Blot技术,进行细胞鉴定;氧化应激试剂盒检测体外培养的各组肾小管上皮细胞(NRK 52E cells)氧化应激水平;Western Blot技术检测高糖环境下NRK 52E细胞中,硫辛酰胺对TAK1、SnoN蛋白表达的影响;流式细胞技术和Western Blot技术检测ALM对大鼠肾小管上皮细胞纤维化过程的抑制作用。结果所培养细胞为肾小管上皮细胞并对高糖刺激敏感;高糖条件下给予ALM干预后,T SOD活性增强,MDA水平减少,且TAK1、p TAK1(Thr184/187)及CollagenⅢ蛋白表达水平减少,SnoN及钙黏蛋白(E cadherin)蛋白水平的表达上调。结论高糖环境下给予ALM干预后,肾小管上皮细胞的氧化应激水平降低,伴随TAK1的表达减少和SnoN蛋白表达增加,从而抑制肾小管上皮细胞向间质细胞转分化的发生及细胞外基质沉积,最终延缓肾小管上皮细胞纤维化的发生发展。

荔枝核总黄酮通过抑制TLR4-TAK1抗大鼠肝纤维化的机制分析

目的探讨荔枝核总黄酮对四氯化碳(CCl 4)诱导的肝纤维化模型的抗肝纤维化作用机制。方法利用40%CCl 4-花生油溶液背部皮下注射构建肝纤维化大鼠模型,将造模成功的大鼠分为模型组、扶正化瘀组、荔枝核总黄酮低、中、高剂量组,另设空白组。连续灌胃给药8周后,取肝左大叶进行HE染色,观察肝脏组织病理变化;RT-qPCR法检测各组大鼠肝脏ColⅠ、ColⅢ、α-SMA mRNA的表达水平;并通过Western blotting检测大鼠肝脏Toll样受体-4(TLR4)、转化生长因子β激活激酶1(TAK1)、磷酸化转化生长因子β激活激酶1(P-TAK1)、氨基末端蛋白激酶(JNK)、磷酸化氨基末端蛋白激酶(P-JNK)的表达情况。结果肝组织HE染色显示,与肝纤维化模型大鼠比较,荔枝核总黄酮各剂量均能不同程度的改善大鼠肝脏炎症浸润情况。肝纤维化相关因子检测显示,荔枝核总黄酮各剂量肝脏ColⅠ、ColⅢ与α-SMA mRNA表达下降(P<0.05或P<0.01)。Western blotting检测结果显示,与模型组比较,荔枝核总黄酮低、中剂量组肝脏TLR4、P-TAK1蛋白表达下降(P<0.05),低剂量组的肝脏P-JNK蛋白也降低(P<0.05)。结论荔枝核总黄酮能减轻CCl 4诱发的大鼠肝纤维化,此作用可能与抑制肝脏TLR4-TAK1通路有关。

草鱼TAB2与TAK1蛋白互作鉴定及其对两种抗菌肽基因表达的影响

为了探究草鱼TAB2(Ci TAB2)与Ci TAK1能否互作及其对2种草鱼抗菌肽基因(Cihepcidin与Ciβ-defensin1)表达的影响,实验首先采用实时荧光定量PCR(qPCR)方法分析拟态弧菌感染后Citab2和Citak1在草鱼免疫相关组织中的时空表达模式。然后利用荧光共定位、免疫共沉淀及Western blot技术鉴定Ci TAB2与Ci TAK1在细胞内共定位及相互作用情况。最后将过表达质粒pEGFP-N1-Citak1与pEGFP-N1-Citab2共同转染草鱼肾细胞(CIK细胞),检测Cihepcidin与Ciβ-defensin1的相对mRNA表达水平。结果显示,拟态弧菌感染能够显著改变Citab2和Citak1的相对表达水平,前者于感染后不同时间在各检测组织中表现出不同的时空表达模式,而后者均呈现先上调后下调的表达模式;荧光显微镜下观察到Ci TAB2与Ci TAK1共定位于转染后的HEK293T和CIK细胞的胞质中,且在HEK293T细胞内能够形成Ci TAB2-Ci TAK1蛋白复合物;共同过表达Ci TAB2与Ci TAK1后,CIK细胞内Cihepcidin与Ciβ-defensin1的相对mRNA表达水平在各检测时间点均显著上调。结果表明,Ci TAB2与Ci TAK1存在互作关系且二者互作能够促进上述两种抗菌肽的转录表达。本研究从蛋白互作调控抗菌肽表达的角度为防治鱼类弧菌病提供了新策略。

电针对佐剂性关节炎大鼠关节滑膜细胞内TAK1表达的影响

目的观察电针足三里、关元穴对佐剂性关节炎(AIA)大鼠踝关节滑膜细胞内转化生长因子β激活激酶1(TAK1)表达的影响,探索电针对类风湿性关节炎(RA)可能的干预机制。方法 40只SD大鼠随机分为空白组、模型组、甲氨蝶呤(MTX)组、电针组,每组10只。采用Fueund氏完全佐剂(FCA)法造模。电针组予以电针大鼠关元穴、双侧足三里穴,MTX组予以0.35 mg/kg剂量的MTX灌胃治疗,空白组与模型组每日予以特制大鼠固定器固定后松绑放回笼内饲养。实验期间每3天1次测量大鼠体质量、足爪容积,并对关节炎指数进行评分;采用放射免疫法检测TNF-α、用Western Blot检测TAK1、NF-κB蛋白表达。实验结束后比较各组大鼠踝关节滑膜滑膜组织中TNF-α,滑膜细胞内TAK1,胞核内NF-κB表达水平。结果与空白组比较,模型组大鼠体质量增长明显缓慢、足趾肿胀明显、关节炎指数明显升高(P<0.01),滑膜组织内TNF-α显著升高、滑膜细胞内TAK1含量显著升高、胞核内NF-κB表达显著升高(P<0.01);与模型组比较,电针组大鼠体质量增长较快、足趾肿胀较轻、关节炎指数较低(P<0.05),滑膜组织中TNF-α低于模型组、滑膜细胞内TAK1、NF-κB表达较低(P<0.05)。结论电针AIA大鼠足三里、关元等穴能够有效抗炎,其干预机制可能与抑制关节滑膜细胞内TAK1的表达,良性调控NF-κB这一炎症信号通路有关。

MicroRNA-146a通过靶向TAK1诱导胃癌SGC-7901细胞凋亡

目的:观察微小RNA-146a(miR-146a)对胃癌SGC-7901细胞凋亡的影响及其可能的分子机制。方法:将miR-146a mimic(上调miR-146a表达)和miR-146a inhibitor(下调miR-146a表达)分别转染至人胃癌SGC-7901细胞中,同时设置miRNA无义序列转染为阴性对照组(NC组)。RT-q PCR检测转染后胃癌细胞miR-146a的表达水平;CCK-8法和流式细胞术检测miR-146a对SGC-7901胃癌细胞生长活力和凋亡的影响;RT-q PCR和Western blot法检测miR-146a上调或下调对转化生长因子β激活激酶1(TAK1)/核因子κB(NF-κB)通路的影响。结果:在SGC-7901细胞中,上调miR-146a表达显著促进细胞凋亡,而下调miR-146a表达则显著抑制细胞凋亡。与NC组相比,miR-146a mimics转染SGC-7901细胞后,TAK1的mRNA和蛋白表达均明显下降,差异均有统计学显著性(P<0.05),而miR-146a inhibitors转染组TAK1的mRNA和蛋白质表达则显著增加(P<0.05),提示miR-146a负调控TAK1表达。敲低TAK1促进SGC-7901细胞凋亡(P<0.01),而TAK1过表达TAKI则抑制SGC-7901细胞凋亡(P<0.01)。此外,过表达miR-146a和敲低TAK1均能显著上调NF-κB抑制蛋白α(IκBα)和下调B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)表达。结论:本研究结果表明miR-146a通过靶向TAK1抑制NF-κB途径,从而诱导胃癌细胞凋亡。

miR-143-3p通过靶向TAK1抑制肺癌增殖和侵袭

目的:分析miR-143-3p在肺癌细胞中的表达情况以及对肺癌进展的作用。方法:通过starBase数据库和肺癌病例组织检测分析miR-143-3p在肺癌组织和正常对照组织中的表达差异;分析miR-143-3p在肺癌细胞HCC27、H1975、A549和肺上皮细胞BEAS-2B中的mRNA水平差异;采用CCK-8法检测miR-143-3p对肺癌细胞增殖活性的影响;采用Transwell实验检测miR-143-3p对肺癌细胞迁移和侵袭的影响;通过qRT-PCR检测miR-143-3p对整合素α6(ITGA6)、锚蛋白重复及PH结构域3(ASAP3)、黑色素瘤相关抗原A9(MAGE-A9)和转化生长因子β激活激酶1(TAK1)表达的影响;通过Western印迹检测miR-143-3p对TAK1蛋白表达的影响。结果:starBase分析和肺癌病例组织检测结果显示miR-143-3p在肺癌组织中低表达,同样地,miR-143-3p在肺癌细胞中的表达也显著低于正常肺上皮细胞;过表达miR-143-3p抑制了肺癌细胞的增殖活性、迁移和侵袭能力;过表达miR-143-3p显著抑制TAK1的表达。结论:miR-143-3p在肺癌中通过靶向TAK1抑制肺癌的增殖和侵袭,miR-143-3p在肺癌进展中详细的分子作用机制和信号通路仍须进一步探讨。

干扰TAK1通过下调TAB2/3来抑制肺成纤维细胞的增殖、侵袭、迁移和纤维化

目的探讨转化生长因子β激活激酶1(TAK1)对转化生长因子β1(TGF-β1)诱导的人胚肺成纤维细胞(HFL-1)的增殖、侵袭、迁移和纤维化的影响及其与TAK1结合蛋白(TAB)2/3的关系。方法将细胞分组分为Control组(未处理HFL-1)、TGF-β1组(10ng/mL TGF-β1诱导HFL-1)、TGF-β1+si-NC组(转染si-NC+TGF-β1诱导)、TGF-β1+si-TAK1组(转染si-TAK1+TGF-β1诱导)、TGF-β1+si-TAK1+pcDNA3.1组(转染si-TAK1+pcDNA3.1+TGF-β1诱导)、TGF-β1+si-TAK1+pcDNA3.1-TAB2组(转染si-TAK1+pcDNA3.1-TAB2+TGF-β1诱导)、TGF-β1+si-TAK1+pcDNA3.1-TAB3组(转染si-TAK1+pcDNA3.1-TAB3+TGF-β1诱导)。采用Western Blot和RT-qPCR检测TAK1和TAB2/3的表达。CCK-8检测细胞增殖。Transwell和细胞划痕实验检测细胞的侵袭和迁移能力。Western Blot检测迁移和纤维化相关蛋白的表达。免疫共沉淀验证TAK1和TAB2/3之间的关联。结果与Control组比,TGF-β1诱导后TAK1及TAB2/3表达升高(P均<0.05)。TGF-β1+si-TAK1组与TGF-β1+si-NC组相比其增殖、侵袭、迁移能力明显下降,迁移及纤维化相关蛋白表达明显下降(P均<0.05)。TGF-β1+si-TAK1+pcDNA3.1-TAB2/3组与TGF-β1+si-TAK1+pcDNA3.1组比增殖、侵袭、迁移能力上升,迁移及纤维化相关蛋白表达上升(P<0.05)。结论干扰TAK1通过下调TAB2/3来抑制TGF-β1诱导的肺成纤维细胞的增殖、侵袭、迁移和纤维化。

siRNA靶向沉默TAK1基因对甲状腺癌细胞增殖、迁移和p38 MAPK信号通路的抑制作用

目的:探讨小干扰RNA(siRNA)靶向沉默转化生长因子β激活激酶1(TAK1)基因对甲状腺癌细胞增殖、迁移和p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路的影响,阐明沉默TAK1基因对甲状腺癌的可能作用机制。方法:采用实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)和Western blotting法检测甲状腺癌8505C、NPA、BCPAP和KMH-2细胞中TAK1 mRNA和蛋白表达水平。将KMH-2细胞随机分为空白对照组、阴性对照组和siRNA-TAK1组。对照组细胞不转染,阴性对照组细胞转染阴性对照siRNA,siRNA-TAK1组细胞转染TAK1 siRNA。采用qRT-PCR和Western blotting法检测各组细胞转染效率(即细胞中TAK1 mRNA和蛋白表达水平),MTT法检测细胞增殖活性,Transwell小室实验检测各组细胞侵袭和迁移能力,Western blotting法检测各组细胞中增殖细胞核抗原(PCNA)、基质金属蛋白酶2(MMP-2)、基质金属蛋白酶9(MMP-9)、p38和磷酸化p38(p-p38)蛋白表达水平。结果:与正常甲状腺上皮Nthyori3-1细胞比较,甲状腺癌8505C、NPA、BCPAP及KMH-2细胞中TAK1 mRNA和蛋白表达水平均明显升高(P<0.05)。与空白对照组和阴性对照组比较,siRNA-TAK1组KMH-2细胞中TAK1 mRNA和蛋白表达水平明显降低(P<0.05),细胞增殖活性、侵袭细胞数和迁移细胞数均明显降低(P<0.05),细胞中PCNA、MMP-2、MMP-9和p-p38蛋白水平明显降低(P<0.05);与空白对照组比较,阴性对照组KMH-2细胞中上述各指标差异均无统计学意义(P>0.05)。结论:siRNA靶向沉默TAK1基因可通过抑制p38 MAPK信号通路的激活进而抑制甲状腺癌细胞的增殖、侵袭和迁移过程。

TAK1通过调控p38 MAPK信号通路影响肾小管上皮细胞纤维化

目的:探讨转化生长因子β激活激酶1(TAK1)对肾小管上皮细胞纤维化的影响及机制。方法:以肾小管上皮细胞HK-2作为研究对象,用转化生长因子β1(TGF-β1)诱导肾小管上皮细胞纤维化,以real-time PCR和Western blot检测细胞中TAK1表达的变化。用TAK1 shRNA慢病毒感染肾小管上皮细胞,以real-time PCR和Western blot检测其对TGF-β1刺激下肾小管上皮细胞中TAK1表达的影响以检测干扰效果。ELISA法检测细胞分泌的I型胶原和Ⅲ型胶原水平,Western blot法检测细胞中α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、结缔组织生长因子(CTGF)和磷酸化的p38 MAPK(p-p38 MAPKThr 180/Tyr 182)的蛋白水平。用p38 MAPK激活剂处理已敲减TAK1表达的肾小管上皮细胞,检测其对细胞分泌I型胶原和Ⅲ型胶原的影响及对细胞中α-SMA、CTGF和p-p38 MAPKThr 180/Tyr 182蛋白水平的影响。结果:TGF-β1可以明显上调肾小管上皮细胞中TAK1的表达水平。TAK1 shRNA可明显下调TGF-β1刺激下的肾小管上皮细胞中TAK1的表达水平。TGF-β1处理后的肾小管上皮细胞分泌I型胶原和Ⅲ型胶原增多,细胞中α-SMA、CTGF和p-p38 MAPKThr 180/Tyr 182蛋白水平升高。敲减TAK1表达可以明显抑制TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞分泌I型胶原和Ⅲ型胶原,减少细胞中α-SMA、CTGF和p-p38 MAPKThr 180/Tyr 182的蛋白水平(P<0.05)。p38 MAPK激活剂处理可以逆转敲减TAK1表达对肾小管上皮细胞分泌Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原及α-SMA、CTGF和p-p38 MAPKThr 180/Tyr 182蛋白水平的抑制作用。结论:敲减TAK1表达能够通过抑制p38 MAPK信号通路而降低TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞纤维化水平。

牙鲆TAK1基因的表达分析及免疫功能探究

为探究转化生长因子β激活激酶1基因(TAK1)在硬骨鱼先天免疫中的重要作用,本研究基于实验室已建的牙鲆(Paralichthys olivaceus)转录组数据库,对牙鲆TAK1基因(PoTAK1)进行了克隆及验证。研究显示,其开放阅读框(ORF)长为1 728 bp,编码575个氨基酸,蛋白分子量(Mw)约为64.33 kDa,理论等电点(pI)为6.66,编码的蛋白在N端具有一个S_TKc结构域,在C端具有一个卷曲螺旋区域(Coiled coil region)。氨基酸多序列比对和系统发育分析表明,TAK1基因在脊椎动物中高度保守。组织表达分析显示,PoTAK1在肝脏和鳃中的表达量较高;体内攻毒实验表明,被迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)感染后,PoTAK1在脾脏和头肾中的表达量均显著上调;体外免疫刺激实验表明,Poly I:C、TNF-α和迟缓爱德华氏菌刺激后,在各时间点牙鲆鳃细胞系中PoTAK1的表达量均显著上调。亚细胞定位显示,PoTAK1主要在细胞质中表达。双萤光素酶报告实验证明,PoTAK1能够激活MAPK通路下游AP-1转录因子的活性。体外免疫调节检测实验表明,过表达PoTAK1能够上调AP-1下游IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α等促炎细胞因子的转录表达。研究结果表明,PoTAK1参与了牙鲆的先天免疫反应,并对其具有一定的调节作用。本研究有助于更好地理解PoTAK1在牙鲆抵抗外界病原体入侵过程中的作用机制。

下调miR-32对幽门螺杆菌诱导的肠上皮细胞凋亡及TAK1-p38通路的影响

目的探究下调微小RNA-32(miR-32)对幽门螺杆菌(H.pylori)诱导的肠上皮细胞凋亡及转化生长因子β激活激酶1-p38丝裂原激活蛋白激酶(TAK1-p38)通路的影响。方法体外培养正常人肠上皮细胞系HIEC-6细胞,分为空白对照组(BC组,无H.pylory感染无转染正常培养HIEC-6细胞)、H.pylory组(H.pylory感染)、H.pylory+NC组(inhibitor-NC转染+H.pylory感染)、H.pylory+inhibitor组(miR-32 inhibitor转染+H.pylory感染),CCK-8法检测各组HIEC-6细胞活性,Annexin V-FITC/PI检测各组HIEC-6细胞凋亡,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测上清液中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)表达量,实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测各组细胞miR-32、TAK1、p38 mRNA表达水平,免疫印迹(WB)检测各组细胞TAK1、p38蛋白表达水平。结果与BC组比较,H.pylory组HIEC-6细胞miR-32表达水平、凋亡率、上清液TNF-α、IL-6表达量、细胞TAK1、p38 mRNA及蛋白表达水平显著增加,细胞活性显著降低,差异有统计学意义(P<0.05);与H.pylory+NC组比较,H.pylory+inhibitor组miR-32表达水平、凋亡率、上清液TNF-α、IL-6表达量、细胞TAK1、p38 mRNA及蛋白表达水平显著降低,差异有统计学意义(P<0.05),细胞活性显著增加,差异有统计学意义(P<0.05)。结论下调miR-32可抑制H.pylory感染诱导的HIEC-6细胞凋亡,可能与抑制TAK1-p38通路,减轻细胞炎性反应有关。

CD11c^+细胞特异性敲除TAK1对刀豆蛋白A诱导的免疫性肝损伤的影响

目的:探讨CD11c^+细胞中敲除TAK1对刀豆蛋白A(Con A)诱导的小鼠免疫性肝损伤的影响。方法:采用体内CD11c^+细胞中特异性敲除TAK1的C57BL/6小鼠,经鼠尾静脉注射Con A(12mg/kg)或生理盐水,分别作为Con A敲除组和生理盐水敲除组。另选C57BL/6小鼠,鼠尾静脉注射Con A(12mg/kg)或生理盐水,作为Con A对照组和生理盐水对照组。给药6h之后测定血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸转移酶(AST)和乳酸脱氢酶(LDH)水平;检测肝、肾、胸腺等脏器系数并进行肝组织病理学观察和评分;测定血清中免疫反应相关细胞因子肿瘤坏死因子α(TNF-α)、干扰素γ(IFN-γ)、白细胞介素(IL-4/5/6/12)及肝组织中TNF-α和IFN-γ的表达水平。结果:与生理盐水对照组相比,Con A对照组ALT和LDH显著升高(P均<0.05),肝脏病理损伤明显加重,病理评分显著升高(P<0.05),血清中TNF-α、IFN-γ、IL-4/5/6水平和肝中TNF-α和IFN-γ均显著升高(P均<0.05);生理盐水敲除组肝中TNF-α水平显著降低(P<0.05)。与Con A对照组相比,Con A敲除组小鼠血清ALT、AST和LDH水平均显著升高(P<0.05),肝脏病理损伤明显加重,病理评分显著升高(P<0.05),肝组织IFN-γ水平,血清中TNF-α、IL-4和IL-6水平均显著升高(P均<0.05)。结论:在本实验条件下,CD11c^+细胞中敲除TAK1无明显肝损伤作用,但可加重Con A诱导的肝脏损伤,该作用可能与进一步激活免疫反应有关。