靶向凝血因子FⅨa-FⅧa复合物结合位点的新型抗栓抗体

目的·制备以内源性凝血途径中关键的凝血因子Ⅸa(coagulation factorⅨa,FⅨa)为靶点的单克隆抗体,并研究其抗栓功能及作用机制。方法·通过免疫小鼠、杂交瘤技术、单克隆抗体细胞表达纯化技术,制备高纯度的抗FⅨa单克隆抗体;通过酶联免疫吸附测定筛选与FⅨa具有高亲和力的单抗,利用活化部分凝血活酶时间(activated partial thromboplastin time,APTT)和凝血酶原时间(prothrombin time,PT)评估单抗的抗栓效果;然后利用发色底物法检测其对FⅨa酶活性的影响;采用计算机模拟蛋白-蛋白对接的方法预测抗体与FⅨa相互作用可能的结合位点,并通过竞争实验(间接通过发色底物法)对这一结合位点进行验证。结果·制备得到1种高亲和力抗FⅨa的单克隆抗体FⅨa-4;虽然它不影响PT和FⅨa的酶活性,但可显著延长APTT至88.8 s,是对照组(25.5 s)的3.5倍,并且具有浓度依赖性。蛋白-蛋白对接预测结果发现,FⅨa-4不直接与FⅨa的底物催化位点结合,而是占据了FⅨa和FⅧa的结合区域。竞争实验进一步验证了上述结果,FⅨa-4以剂量依赖的方式抑制FⅩa的生成,FⅨa-4的浓度达到400 pmol/L即可使FⅩa的生成几乎完全被抑制,而FⅧa可纠正抗体的抑制作用达到近50%。结论·获得抗FⅨa的单抗FⅨa-4;FⅨa-4与FⅧa竞争性结合FⅨa阻碍了FⅧa-FⅨa复合物形成,阻断FⅩ向FⅩa的转化,该抗体主要通过抑制内源性凝血途径发挥抗栓作用。

山羊β-酪蛋白基因启动子指导的转基因小鼠乳汁高效表达人凝血因子Ⅸ

为探讨应用转基因动物乳腺生物反应器高效表达人凝血因子IX(humanclottingfactorIX ,hFIX)的可行性 ,构建了包括山羊 β 酪蛋白基因启动子和外显子 1、内含子 1、外显子 2共约 6 .7kb片段以及hFIX全长cDNA序列和部分经改造的内含子 1的乳腺表达载体 ,通过转基因技术获得 12个原代转基因小鼠 (9♀ ,3♂ ) ,整合率为 11.2 %。经ELISA和Westernblot鉴定 8只转基因母鼠乳汁中有hFIX的表达并拥有很高的凝血活性 ,其中一只的表达量高达5 2 .9mg/L ,其凝血活性亦高达 2 79.2 %。FISH实验表明不同的转基因小鼠外源基因整合于小鼠的不同染色体上。结果证明所构建的山羊 β 酪蛋白基因启动子乳腺表达载体能有效指导hFIX基因在小鼠乳腺中高效表达 ,并能保持hFIX的生物活性。

应用荧光原位杂交检测人凝血因子Ⅸ在转基因小鼠染色体上的整合

应用荧光原位杂交 (FISH)技术检测两个转基因小鼠家系从F1到F4 代的整合情况。阳性转基因小鼠 98%～ 10 0 %的中期分裂相 ,85 %～ 94%的间期核出现杂交信号 ;阴性对照小鼠 10 0 %的中期分裂相、95 %～ 96 %的间期核未出现杂交信号。结果表明 ,该FISH实验条件能对转基因整合位点进行高效特异检测。本文分析的两家系转基因小鼠均为单位点整合 ,但整合位点不同。各家系内F1到F4 代的转基因小鼠均可检出整合染色体 ,且整合位点相同 ,表明外源基因稳定整合并遗传给后代。

逆转录病毒载体转染的人凝血因子Ⅸ基因在人脐带组织源间充质干细胞中的表达

为了研究逆转录病毒(pLEGFP-N1)转染的人凝血因子Ⅸ(hFⅨ)基因在人脐带间充质干细胞中的表达,应用DNA重组技术将hFⅨcDNA构建入pLEGFP-N1载体,转导入包装细胞系Pheonix细胞,应用病毒上清感染人脐带组织源间充质干细胞(hUCT-MSCs),经G418筛选10天后获得全部的转染阳性细胞,从蛋白质水平和其功能活性上检测hFⅨ的表达。结果显示:配养上清液中可检测到hFⅨ的表达,每24小时分泌量达2.68±0.36μg/106细胞。Western blot检测表明,转导hFⅨ的hUCT-MSCs能分泌预期分子大小的hFⅨ入上清。功能性凝集测定实验表明了转导FⅨ的hUCT-MSCs2天培养上清中hFⅨ的活性为100%-130%。结论:pLEGFP-N1-hFⅨ能有效地转导hUCT-MSCs,并在其子代细胞中表达具有凝血活性的hFⅨ,这为hUCT-MSCs成为血友病B基因治疗的细胞载体研究奠定了基础。

小鼠胚胎干细胞凝血因子Ⅸ基因的定向敲除

目的：将小鼠胚胎干细胞中凝血因子Ⅸ（ｍＦⅨ）基因定向敲除，为建立血友病Ｂ的转基因小鼠模型奠定基础；摸索建立ＥＳ细胞基因打靶技术体系。方法：将线性化的针对小鼠ｍＦⅨ基因组的基因打靶置换型载体（ｐＭＦⅨＤＥＬ）ＤＮＡ用电穿孔法转入小鼠ＥＳ细胞，经过Ｇ４１８和ＧＡＮＣ分组药物选择，用ＰＣＲ和基因组Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交两种方法，鉴定药物抗性细胞中发生同源重组的情况。结果：（１）从药物抗性细胞克隆中鉴定获得了４个发生了按所设计的方式进行了同源重组的ＥＳ细胞克隆；（２）观察到在ＥＳ细胞中，ｐＭＦⅨＤＥＬ载体ＤＮＡ与内源ｍＦⅨ基因发生同源重组的频率平均为１．６７×１０－６。结论：得到了４个ｍＦⅨ基因已被敲除的ＥＳ细胞克隆；建立了ＥＳ细胞基因打靶的技术体系。

凝血因子 Ⅸ复合物制备工艺的优化及性质研究

目的 用国产凝胶制备高质量的凝血因子 复合物。方法 以新鲜冰冻血浆为原料 ,经过国产DEAE-琼脂糖快流速阴离子交换层析及 Ca3(PO4 ) 2 吸附法制备凝血因子 复合物。对制备获得的凝血因子 复合物进行凝血活性测定 ,高分子量杂蛋白定量检测以及 SDS- PAGE、免疫电泳 (IE)、交叉免疫电泳 (CIE)等性质分析 ,并且与用进口 DEAE- Sepharose CL- 6 B制备获得的凝血因子 复合物相比较。结果 两步的活性回收率分别为93.6 7± 2 .5 6 % (n=6 )和 88.71± 2 .39% (n=6 )。凝血因子 (F ) :C比活为 7.36± 0 .96 U/ mg(n=6 )。性质分析结果显示 ,本工艺制备的凝血因子 复合物不仅充分保留了有效成分 ,而且制品的纯度和血栓安全性有明显提高。结论 国产凝胶完全能取代进口凝胶用于制备高质量、低成本的凝血因子

批式吸附法制备人凝血因子Ⅸ复合物(英文)

目的 制备纯度较高 ,潜在血栓性小的凝血因子Ⅸ (FⅨ )复合物。方法 以人新鲜冰冻血浆为原料 ,采用SD病毒灭活工艺 ,经国产DEAE SepharoseFastFlow胶批式吸附和Ca3 (PO4) 2 吸附制备凝血因子Ⅸ复合物。结果 两步的活性收率分别为 ( 89.94± 1.31) % (n =7)、( 82 .2 7± 2 .18) % (n =6 ) ,制品的FⅨ∶C比活为 ( 16 .2 8± 2 .80 )IU/mg。FIX的量为 ( 12 6 .82±11.6 0 )IU/瓶 ( 2 0 0PE)。结论 本工艺实用性较高 ,可用于制备低成本 ,高质量的凝血因子Ⅸ复合物。

人凝血酶原复合物中凝血因子Ⅸ效价检测中影响因素的探讨

目的探讨人凝血酶原复合物(PCC)中凝血因子Ⅸ效价检测的影响因素,优化检测条件。方法研究不同的Ca2+浓度对一期法检测凝血因子Ⅸ效价的影响,并分别考察磷酸三丁酯、聚山梨酯-80(S/D)以及硫酸鱼精蛋白中和肝素对检测的影响。结果 Ca2+浓度为0.012 5 mol/L时,检测结果最稳定,标准曲线的相关性(r2)为0.999±0.001,回收率为(99.2±1.789)%,5次重复试验的变异系数为1.80%;S/D对PCC样品中凝血因子Ⅸ效价检测的影响无统计学意义(P>0.1);PCC样品的肝素未中和时,稀释倍数的影响较大,中和后凝血因子Ⅸ效价受稀释倍数影响较小。结论优化了凝血因子Ⅸ效价检测的影响因素,最优Ca2+离子浓度为0.012 5 mol/L;S/D试剂无影响;硫酸鱼精蛋白中和肝素后,凝血因子Ⅸ效价受稀释倍数影响较小。

我国脑血栓患者家系凝血因子Ⅸ基因SNP9的检测

目的 探讨凝血因子 基因在第六外显子 2 3384- 2 3387bp存在单核苷酸多态性 (SNP9)在我国北方人群脑血栓发病机制中的作用。方法 应用聚合酶链反应 -限制性片断长度多态性 (PCR- RFL P)的方法 ,检测 2 0例脑血栓患者和他们家系及 6 0例正常健康对照组凝血因子 第六外显子 2 3384- 2 3387bp多态性分布。结果 2 0例脑血栓患者和 40例他们的家系成员 ,在 Mn II酶切后 ,可见 30 7bp片断基因类型全部是 A。正常 6 0例健康对照组基因多态性基因型也显示为 A,而在阳性对照可见 A、G和 AG。结论 在这一等位基因位点脑血栓家系和正常人群基因多态性基因型均为 A型。这一位点基因对我国脑血栓患者的作用机制有待于进一步探讨。

人源载体pHrnF9介导的凝血因子Ⅸ基因在肠上皮sw480细胞中的表达

本研究探索肠上皮细胞和人源载体pHrnFⅨ用于血友病B基因治疗的可能性。用含人凝血因子Ⅸ(human coagulation factorⅨ,hFⅨ)基因的人源载体质粒pHrnF9转染肠上皮细胞sw480,用RT-PCR检测mRNA的转录,荧光显微镜观察转染效率,ELISA和一期法检测蛋白表达及凝血活性。结果表明:转染后的细胞中有hFⅨmRNA的转录;荧光显微镜观察到48小时转染效率最高;ELISA法测得转染后24小时细胞上清中的hFⅨ蛋白量为(11.34±0.23)ng/(106cells.24h),第48小时hFⅨ蛋白量最高,达(29.34±1.00)ng/(106cells.24h),转染后72小时降为(12.45±0.15)ng)/(106cells.24h)。一期法结果显示转染pHrnF9的sw480细胞分泌的FⅨ有凝血活性,48小时达峰值(6.07±0.17)%/106cells,第72小时降至(1.81±0.06)%/106cells。结论:肠上皮细胞sw480转染pHrnF9质粒后可表达有凝血活性的hFⅨ,肠上皮细胞有望成为血友病B基因治疗的靶细胞。

重组人凝血因子Ⅸ小基因及其无义突变体稳定细胞株的构建及意义

本研究构建重组人凝血因子Ⅸ小基因及其无义突变体稳定细胞株并探讨其意义。将人凝血因子Ⅸ(F9)小基因克隆到哺乳动物表达载体pCMV-Tag3B上;利用PCR定点突变技术得到在小基因121位氨基酸位置含有一个提前终止密码子(premature termination codon,PTC)的无义突变体;将构建的F9小基因及其无义突变体分别转染人肝癌细胞HepG2,经G418抗性筛选,单克隆化扩大培养,得到稳定细胞株,分别命名为HepG2-WT和HepG2-N。结果显示:通过酶切鉴定、PCR鉴定及DNA测序分析证明,小基因及其无义突变体表达载体构建成功;通过RT-PCR及基因组PCR均扩增到了大小正确的目的基因片段,证明了含有重组人凝血因子Ⅸ小基因及其无义突变体的稳定细胞株构建成功。结论:本研究成功构建了重组人凝血因子Ⅸ小基因及其无义突变体稳定细胞株,该细胞株可用于无义突变导致血友病的治疗药物的筛选和PTC通读药物的筛选等。

逆转录病毒载体中正向插入内含子片段对表达人凝血因子Ⅸ的作用

目的 :探讨人凝血因子 (F )内含子 1片段正向插入逆转录病毒载体对骨骼肌细胞表达 F 的影响。 方法 :将含F 内含子 1片段的 F 微小基因 m 1和 m 2正向插入 L SN逆转录病毒载体的 Bam H 位点 ,取代 F c DNA,获得 m 1SN和 L m 2 SN载体 ,在小鼠成肌细胞进行瞬时和稳定表达试验。结果 :L m 1SN的 m 2 SN载体的病毒滴度、在成肌细胞中瞬时表达和稳定表达 F 的水平 ,均比不含内含子的 L SN增高 1～ 2倍 ,小部分病毒 RNA中的内含子在包装细胞中未被剪接去除而转入了靶细胞。结论 :人 F 内含子 1片段正向插入逆转录病毒载体对提高病毒滴度和 F 的表达水平有一定作用。

结肠灌注重组腺相关病毒2/人凝血因子Ⅸ基因载体治疗血友病B的安全性研究

目的分析结肠灌注重组腺相关病毒2/人凝血因子Ⅸ(rAAV2/CMV-hFⅨ)基因载体治疗血友病B小鼠的安全性。方法将rAAV2/CMV-hFⅨ(剂量为1×1013 v.g/kg)结肠灌注血友病B模型小鼠,分别检测抗重组腺相关病毒2(rAAV2)抗体和抗人凝血因子Ⅸ(hFⅨ)抗体,并通过组织病理学、免疫组化和PCR技术分析病毒和hFⅨ的组织分布。结果灌注后,在小鼠体内能够检测到抗rAAV2抗体和抗hFⅨ抗体;组织病理学、免疫组化和PCR技术分析结果显示灌注部位肠组织无明显病理改变,rAAV2以及hFⅨ基因仅仅在灌注的肠上皮。结论结肠灌注重组腺相关病毒基因治疗血友病B小鼠,在所观测时间内是安全的。

27例乙型血友病患者Ⅸ因子基因突变研究

采用ＰＣＲ（聚合酶链反应）及ＧＡＷＴＳ（ＧｅｎｏｍｉｃＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｗｉｔｈＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｓＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）技术，研究了江苏、湖北、山东、广东、福建、宁夏六省区２７例乙型血友病患者及其家系成员ＦⅨ（九因子）基因各２．２Ｋｂ ＤＮＡ序列。在２ｌ例中发现２０种不同类型的突变。其中１２种是未曾报道的新突变。３８％的突变发生在ＣｐＧ二核苷致序列上，进一步证实了ＣｐＧ确系突变热点。同时检出６例女性为致病基因携带者。对开展基因产前诊断及优生优育等，具有重要意义。

凝血因子Ⅸ基因剔除小鼠近交系的建立

目的 :建立可稳定遗传、临床症状显著的凝血因子 (F )基因剔除小鼠近交系。 方法 :以 PCR扩增检测小鼠尾组织 DNA,一期法检定小鼠血浆 F 活性和血浆凝血酶原时间 (PT)、白陶土部分凝血活酶时间 (KPTT)值 ;取以上结果为全阳性的小鼠以选优法进行全同胞兄妹交配 ,每代选用第一胎小鼠留种 ,第 8代开始筛选纯合子。 结果 :F8代 F 基因剔除小鼠PCR检测阳性率 92 % ,到 F1 2 代小鼠阳性率达 10 0 % ;F 活性 (2 .4 7± 1.75 ) %较正常小鼠 (14 8.18± 4 6 .98) %明显降低 (P<0 .0 1) ;F 基因剔除小鼠已近交培育到第 12代 ,遗传性状稳定 ,并有自发出血倾向。结论 :成功建立了纯合子 F 基因剔除小鼠近交系 ,该小鼠符合人血友病

机采血小板悬液在保存过程中凝血因子Ⅷ、Ⅸ生物活性的变化

为了研究机采血小板悬液22℃振荡保存不同时间的凝血因子Ⅷ、Ⅸ生物活性的变化,采用SYSMEXCA-1500型全自动血凝仪对用CS-3000plus血细胞分离机采集的18份血小板悬液于22℃振荡保存条件下,测定0、12、24、48、72、96、120小时7个时间段的FⅧ∶C和FⅨ∶C的活性。结果表明:机采血小板FⅧ∶C在0时活性为(100.51±44.02)%,保存12-120小时,其活性衰减了10%-40%;FⅨ∶C在0时活性为(120.93±20.50)%,保存24-120小时,其活性衰减了10%-35%。结论:机采血小板悬液于22℃振荡保存时凝血因子Ⅷ、Ⅸ仍保持有较高的生物学活性。

多发性骨髓瘤并获得性凝血因子Ⅺ及Ⅸ缺乏首例报告

目的探讨多发性骨髓瘤并获得性凝血因子Ⅺ及Ⅸ缺乏的诊治要点。方法回顾性分析我院确诊的多发性骨髓瘤并获得性凝血因子Ⅺ及Ⅸ缺乏1例的临床资料。结果患者因胸痛1个月,发热3 d入院。入院后出现皮肤穿刺处大量出血,检查发现凝血功能异常,凝血因子活性Ⅺ∶C 0.18,Ⅸ∶C 0.49,血狼疮抗凝物(LA)88.1 s,骨髓及胸腔积液检查可见幼稚浆细胞,确诊为多发性骨髓瘤伴获得性凝血因子Ⅺ及Ⅸ缺乏。采用包括糖皮质激素的化疗方案后,患者病情得到有效控制。结论对获得性凝血因子缺乏的患者,应警惕为恶性肿瘤产生循环抗凝物所致。积极治疗原发性疾病是彻底纠正获得性凝血功能异常的关键措施。

人凝血酶原复合物中凝血因子Ⅸ效价测定影响因素的探讨

目的 探讨几种因素对人凝血酶原复合物中凝血因子Ⅸ效价测定的影响。方法 参照《中国药典》2010年版,采用不同厂家乏Ⅸ因子血浆、不同型号仪器、不同肝素中和方式、不同样品前处理方法测定人凝血酶原复合物中凝血因子Ⅸ效价,分析其对PCC中凝血因子Ⅸ效价测定结果的影响。结果 不同厂家的乏Ⅸ因子血浆对凝血因子效价测定结果有显著性差异（P〈0.05）。不同型号全自动凝血分析仪对凝血因子效价测定结果无显著性差异。当稀释倍数大于60倍时,是否中和肝素对凝血因子Ⅸ效价测定结果影响较小。当稀释倍数小于60倍时,中和肝素的检测结果高于不中和的检测结果,差异有统计学意义（P〈0.05）。样品预温与否及是否复溶15分钟,凝血因子Ⅸ效价测定结果无显著性差异。结论 不同厂家乏Ⅸ因子血浆,不同稀释倍数的肝素中和方式,样品前处理方法均影响PCC制品凝血因子Ⅸ效价的测定,在检测过程中应予以重视。加强对乏因子血浆的质量控制及操作流程的规范化,建立PCC制品凝血因子检测的室间质量评价体系。

直接注射含人Ⅸ因子cDNA质粒在小鼠体内的表达

本文报道了２种分别由人巨细胞病毒（ｈＣＭＶ）启动子和ＳＶ４０早期启动子控制的人Ⅸ因子ｃＤＮＡ质粒ｐＣＭＶ─Ⅸ，ｐＫＧ５─Ⅸ直接注射小鼠骨骼肌内，在肌细胞中可产生Ⅸ因子蛋白，并分泌至血液中，在注射后约第１０ｄ表达量最高，最高含量可达２５ｎｇ／ｍｌ。为采用直接注射法进行遗传病基因治疗提供１种可能。