至真方固体双向发酵工艺的建立及其药效评价

目的以中药固体双向发酵方法,建立至真方的新型发酵工艺。方法①通过文献研究拟定候选发酵菌种。对候选发酵菌种进行平板混合实验,考察各菌种间生长兼容性。采用CCK-8细胞增殖抑制实验,比较不同发酵条件下所得产物对人结直肠癌细胞(HCT-8)的半数抑制浓度(IC50),评判发酵体系的优劣,从而确定发酵菌种、发酵时长等关键发酵参数,建立发酵工艺。②通过HCT-8细胞增殖抑制率,以及巨噬细胞(RAW264.7)NO释放率和吞噬活性测定,比较至真方发酵前后的体外药效差异。结果黑曲霉和酵母菌为最优发酵菌种组合,4 d为最优发酵时长。在此发酵条件下,发酵组对HCT-8细胞的IC50为67.41μg·mL^(-1),生药组对HCT-8细胞的IC50为1032μg·mL^(-1);与生药组比较,发酵组能显著抑制RAW264.7释放炎症因子NO,并显著提升其吞噬活性。结论该研究建立了至真方固体双向发酵新工艺。在该发酵体系下,至真方的体外抗结直肠癌活性、抗炎活性和促免疫活性得到显著提升。

柳松茸薏苡仁固体双向发酵物中多糖和蛋白质含量测定

目的：建立柳松茸与薏苡仁固体双向发酵产物中多糖、蛋白质的含量测定方法。方法：采用紫外分光光度法测定多糖和蛋白质含量,检测波长分别为530nm和595nm。结果：多糖浓度在0.008~0.080mg/mL范围内与吸收峰面积具有良好线性关系,回归方程为Y=15.986X-0.0126,r=0.9993,发酵产物多糖含量为54.54%;蛋白浓度在0.0078~0.0321mg/mL范围内与吸收峰具有良好线性关系,回归方程为Y=20.08263X＋0.14522,r=0.9993,发酵产物中蛋白含量为0.0994%。结论：该研究建立的方法简便、快速、准确、重复性好,为柳松茸薏苡仁固体双向发酵产物中多糖及蛋白质的含量测定提供了参考依据。

黄芪-茯苓双向固体发酵菌质对高尿酸血症小鼠的改善作用研究

目的:探究黄芪-茯苓双向固体发酵菌质对高尿酸血症小鼠的整体改善作用。方法:采用含4%氧嗪酸钾与20%酵母混合制成的饲料建立高尿酸血症小鼠模型。将60只小鼠随机平均分为正常组,模型组,苯溴马隆组(20 mg·kg^(–1)),菌质低剂量(250 mg·kg^(–1))、中剂量(500 mg·kg^(–1))、高剂量(1000 mg·kg^(–1))组,连续灌胃给药42 d后,检测小鼠血清中尿酸(UA)、肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)、天冬氨酸氨基转移酶(ALT)、丙氨酸氨基转移酶(AST)、肝脏黄嘌呤氧化酶(XOD)、肾脏白细胞介素(IL)-1β、IL-6和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平;并取小鼠肾脏固定、苏木素-伊红(HE)染色,观察各组组织病理学变化。结果:与正常组相比,高尿酸血症模型组小鼠的UA水平显著升高(P<0.0001)。菌质各剂量组与高尿酸血症模型组相比,UA水平均有不同程度的下降(P<0.0001),其中菌质高剂量组下降幅度最大,但三组之间差异无统计学意义。与正常组相比,高尿酸血症模型组小鼠BUN水平显著升高(P<0.01),Cr水平显著升高(P<0.0001),肝脏XOD活性明显升高(P<0.0001),血清AST和ALT水平显著升高(P<0.001),IL-1β、IL-6和TNF-α水平显著提高(P<0.0001)。与模型组相比,菌质中剂量组小鼠BUN水平显著下降(P<0.01);苯溴马隆阳性组、菌质高、中剂量组小鼠Cr水平显著下降(P<0.01);苯溴马隆阳性组、菌质各剂量组小鼠的XOD活性均明显降低(P<0.0001);菌质各剂量组小鼠血清ALT、AST水平显著下降(P<0.01);菌质各剂量组的IL-1β、IL-6水平均显著下降(P<0.0001),但TNF-α的水平差异无统计学意义。模型组肾脏病理切片未见明显病变。结论:黄芪-茯苓双向固体发酵菌质可以显著改善高尿酸血症小鼠的病理状态。

猴头菌与人参双向固体发酵菌质体外抗氧化活性分析

目的:为了更好地研究与利用猴头菌及人参的药用价值。方法:本文以猴头菌为发酵菌种,人参为药性基质(PGP组)进行双向固体发酵,得到猴头菌-人参双向固体发酵菌质(HEP组),通过苯酚-硫酸法、考马斯亮蓝法测定不同发酵时期的发酵菌质组及人参药性基质组的不同醇沉组分多糖及蛋白质的含量,并采用DPPH·法、·OH法、ABTS+·法测定不同醇沉组分的抗氧化能力。结果:总糖含量以40%醇沉组分最多,发酵至第9 d时,发酵菌质组40%醇沉组分HEP-40总糖含量达到0.98 mg/g,人参基质组40%醇沉组分PGP-40总糖含量达到1.03 mg/g,还原糖、蛋白质含量以90%醇沉组分的最多,发酵至第30 d时,发酵菌质组90%醇沉组分HEP-90还原糖含量达到0.18 mg/g,人参基质组90%醇沉组分PGP-90还原糖含量达到0.24 mg/g;发酵至第40 d时,HEP-90蛋白质含量达到0.54 mg/g,PGP-90蛋白质含量达到0.46 mg/g。菌质组各醇沉组分在发酵至第24 d时对DPPH自由基的清除能力均达到较好的效果,发酵菌质中不同醇沉组分多糖HEP-40、HEP-70、HEP-90的DPPH自由基清除率分别为37.66%、60.06%、73.58%;当发酵至第40 d时,HEP-40、HEP-70、HEP-90对羟自由基的清除率分别为33.71%、54.32%、94.90%;当发酵至第40 d时,HEP组的ABTS自由基清除能力达到峰值,HEP-40、HEP-70、HEP-90对ABTS自由基的清除率分别为44.83%、87.90%、98.90%。结论:猴头菌与人参进行双向固体发酵后,发酵产物(HEP组)中的药效活性成分与未经发酵处理的人参(PGP组)中的药效活性成分相较抗氧化能力显著提升。

人参双向固体发酵过程中化学成分的变化

采用紫外分光光度法测定人参双向发酵过程中总皂苷和总多糖含量;采用高效液相色谱法测定人参双向发酵过程中代表性单体化合物Rg1、Re、Rb1含量;通过薄层色谱法鉴定、高效液相色谱法测定人参稀有皂苷Rg3、Rh1、Rh2、人参皂苷CK含量,研究了人参双向固体发酵过程中化学成分的变化规律。在发酵30 d后,人参药材经过生物转化以后总多糖含量增加26.86%,总皂苷含量减少7.70%,人参皂苷Rg1、Re、Rb1含量分别减少52.76%、10.86%、9.82%,Rg3、Rh1含量明显增多,分别达到0.90 mg/g和0.09 mg/g。人参在发酵过程中不仅利用了人参中的多糖,而且还生成了其他种类的多糖;人参皂苷发生了部分的转化,人参皂苷Rg1、Re、Rb1在发酵过程中被转化成了稀有人参皂苷Rg3、Rh1。

赤芝双向固体发酵钩吻根前后的谱、效、毒研究

目的:考察赤芝菌对钩吻双向固体发酵的减毒存效作用及其化学成分变化。方法:选用药用赤芝菌,在一定条件下对钩吻进行双向固体发酵炮制;以钩吻生品为对照,观察发酵前后钩吻对小鼠急性毒性(LD50)的变化情况,并比较它们对醋酸腹腔刺激所致小鼠扭体作用及热板所致小鼠痛阈值的影响,HPLC考察其主要毒性生物碱含量的变化情况。结果:(1)钩吻生品的LD50为0.25 g/kg;经赤芝菌发酵30 d后,LD50为11.04 g/kg,较生品提高了44倍;(2)钩吻发酵后仍然保留镇痛药效,其小鼠最大安全给药量由生品0.08 g/kg,上升到6 g/kg,最大安全剂量提高了75倍。(3)经过双向发酵,钩吻原有毒性生物碱成分含量降低,并有多个新化学成分产生。结论:赤芝菌双向固体发酵对毒性中药钩吻具有减毒、存效的作用。

黄芪双向性固体发酵过程中黄芪甲苷的转化研究

目的:研究黄芪双向性固体发酵前后黄芪甲苷的转化。方法:采用HPLC测定法、柱色谱分离法、波谱鉴定技术进行发酵前后的成分变化研究;观察转化产物对血管内皮细胞的抗氧化效应。结果:在黄芪发酵过程中,黄芪甲苷转化形成6-O-β-D-葡萄糖基-环黄芪醇,该转化物具有显著的抗氧化效应。结论:黄芪中有效成分黄芪甲苷经药用真菌(灵芝)双向性固体发酵后发生了生物转化,这一转化具有增效的作用。

双向固体发酵后雷公藤菌质的急性毒性研究

目的：研究雷公藤菌质的急性毒性的变化。方法：运用双向固体发酵的原理与技术,将药用真菌G接种到带皮的雷公藤基质上,在特定条件下进行发酵,得到不同发酵天数的菌质。用Bliss法计算不同发酵天数的雷公藤菌质的半数致死剂量（LD50）,测定其急性毒性。结果：不同发酵时间的雷公藤菌质组LD50均高于雷公藤生药组,其中发酵20~30d菌质的LD50较高。结论：通过双向性固体发酵可以使雷公藤的急性毒性降低,并保持一定的免疫抑制作用。

基于生物转化技术的药用真菌双向固体发酵在中药开发中的应用

生物转化和双向固体发酵技术在中药领域的应用是在继承传统中药发酵法的基础上,结合现代生物技术对中药开发利用的结果,能够显著提升传统中药的临床疗效、发现传统中药的临床新价值、显著提高中药材资源的利用率、批量创新中药,从而促进中药的产业化发展。将生物技术融入中药研究,形成有中国特色的生物转化研究体系,在很大程度上将会加速中药新药的开发和中药现代化的进程,提高我国中药行业的国际竞争力,使中药走向世界。

药用真菌双向固体发酵草乌后菌质对小鼠的急性毒性及致大鼠心律失常作用

[目的]研究药用真菌灵芝、茯苓、红栓菌和扇菇菌运用双向固体发酵草乌后菌质(分别称为灵乌菌质、茯乌菌质、栓乌菌质和扇乌菌质)对小鼠的急性毒性作用和对大鼠心脏毒性的影响。[方法]运用双向发酵技术获得菌质,根据急性毒性预试验结果进行最大耐受量试验,采用Powerlab生理信号记录系统,通过观察大鼠Ⅱ导联心电图变化研究不同药物对大鼠的心脏毒性。[结果]相同剂量下灌胃给药,在给药7 d后各处理组小鼠体重增长明显低于正常对照组;给药14 d后,灵乌菌质组体重增长很快,接近于正常对照组;与炮制品组相比,灵乌菌质组、扇乌菌质组和栓乌菌质组对大鼠心律失常发生次数有显著性降低作用(P<0.05或P<0.01),而茯乌菌质组对大鼠心律失常的影响和炮制品组没有显著差异;各发酵组间没有显著差异。[结论]灵乌菌质、扇乌菌质和栓乌菌质具有降低心律失常发生率的作用。

14个灵芝菌株的新型(双向型)固体发酵及菌质多糖含量测定

目的:探索甘草渣和14种不同的灵芝菌株的复合型双向发酵,考察灵芝发酵基质中多糖含量的变化。方法:以甘草渣为培养基质进行灵芝菌的新型固体发酵,采用苯酚—硫酸法测定发酵基质中的多糖含量。结果:经过灵芝茵发酵的菌质多糖含量,都比没有经过发酵的纯甘草渣有了不同程度的提高。结论:利用灵芝菌和甘草渣进行的新型复合发酵能够有效提高基质中的药用成分。

双向固体发酵前后钩吻中生物碱含量变化研究

目的研究钩吻被多种药用真菌固体发酵后生物碱含量的变化。方法运用双向固体发酵的原理与技术,将钩吻生品作为"药性基质",灵芝、云芝、茯苓等5种不同药用真菌分别接种到灭菌的钩吻"药性基质"上,在特定条件下进行发酵,得到钩吻"药性菌质"。采用HPLC法对发酵前后钩吻中钩吻碱甲、钩吻素子、钩吻素己、钩吻绿碱、胡蔓藤碱乙的含量进行测定。结果在同一发酵条件下,5种不同真菌对钩吻的发酵情况有所不同,"药性菌质"中各生物碱成分含量与钩吻生品相比,均呈不同程度下降的趋势,且色谱图中显示出一个新产生的未知成分。结论双向固体发酵后,菌丝体生长良好的钩吻发酵物中钩吻生物碱成分发生了质和量的明显变化,该法可能对钩吻的减毒增效物质基础研究具有重要意义。

基于灵芝双向固体发酵雷公藤减毒持效的研究

传统中药雷公藤具有抗炎和免疫抑制的作用,但因毒性强而极大地限制了其临床应用。以灵芝为药用真菌,采用双向固体发酵技术发酵雷公藤,并对发酵过程中得到的灵雷菌质进行抗炎活性和肝毒性评价。结果表明,接种量10 mL/100 mL、发酵30天得到的灵雷菌质(N2-G30)在3.75μg/mL的质量浓度下表现出减毒持效的作用,相比于雷公藤,可抑制脂多糖诱导的小鼠RAW264.7细胞释放促炎因子TNF-α和IL-6,并且可减轻对人正常肝细胞L02增殖的抑制作用。通过液相色谱-质谱联用(LC-MS)分析雷公藤发酵前后主要成分的含量变化,结果显示,与发酵前相比,发酵后雷公藤甲素、雷公藤红素、雷酚内酯的含量增加,雷公藤内酯甲的含量减少,这些成分的含量变化与N2-G30的减毒持效作用有关。

人参-虫草双向固体发酵过程中人参皂苷含量变化研究

研究人参-冬虫夏草双向固体发酵过程中主要人参皂苷的组成和含量变化,为发酵产物的质量控制和开发利用提供理论依据。采用高效液相色谱-质谱联用(HPLC-MS)技术对发酵过程及产物中人参皂苷进行定性定量分析。结果表明,人参-虫草双向固体发酵产物中共鉴定出11种皂苷。其在200~1500 ng/mL范围内线性关系良好(R^(2)>0.999),加标回收率范围为95.13%~105.04%,相对标准偏差(RSD)为0.85%~2.36%,精密度、稳定性、重复性试验结果的RSD均<2.6%,表明该检测方法精密度、准确度、稳定性及重复性良好。人参-虫草双向固体发酵过程中人参皂苷Rg_(1)、Re、Rb_(1)含量明显降低,人参皂苷Rh_(1)、Rg_(2)、Rd、Rg_(3)、F_(2)含量明显增加。

HPLC-DAD-ELSD法测定黄芪经九州虫草双向固体发酵前后8种成分的含量

目的:建立同时测定黄芪经九州虫草双向固体发酵前后毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素、黄芪皂苷Ⅳ、异黄芪皂苷Ⅱ、环黄芪醇、异黄芪皂苷Ⅰ等8种成分含量的方法,并探讨发酵处理对黄芪中上述8种成分含量的影响。方法:采用高效液相色谱-二极管阵列检测器-蒸发光检测器联用技术(HPLC-DAD-ELSD)进行含量测定。色谱柱为Agilent 5 TC-C18;流动相为0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B),梯度洗脱;流速为1 mL/min;柱温为30℃;DAD检测波长为260 nm;ELSD蒸发管温度为100℃;雾化器温度为80℃;载气流速为1.6 L/min;进样量为15μL。结果:8种成分在各自质量浓度范围内线性关系良好(R2均大于0.9990);精密度、稳定性、重复性试验的RSD均小于3%(n=3或n=6);平均加样回收率为97.88%~101.32%,RSD为1.22%~2.39%(n=6)。以未发酵黄芪中相应成分含量为100%计算,经九州虫草双向固体发酵后,黄芪中毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素、黄芪皂苷Ⅳ、异黄芪皂苷Ⅱ、环黄芪醇、异黄芪皂苷Ⅰ的含量变化率分别为-98.51%、-96.41%、-94.74%、-96.40%、289.20%、20.25%、-75.05%、562.46%。结论:黄芪经过九州虫草发酵后,有利于增加其主要活性成分黄芪皂苷Ⅳ、异黄芪皂苷Ⅰ、异黄芪皂苷Ⅱ的含量。

HPLC测定双向固体发酵过程中人参皂苷成分的变化

目的:研究人参在双向固体发酵过程中,不同发酵时间下人参菌质中人参皂苷Re、Rg1、Rh1、Rb1、Rf、Rd及人参总皂苷的含量变化情况。方法:采用高效液相色谱法测定各发酵时间下人参菌质中人参总皂苷以及上述6种人参皂苷的含量。结果:随着发酵时间的延长,人参皂苷Re、Rg1、Rb1的含量总体呈降低趋势,人参皂苷Rd、Rh1的含量总体呈上升趋势,人参总皂苷的含量有所减少。结论:随着发酵时间的延长,人参皂苷含量发生变化,人参皂苷发生了转化。

桦褐孔菌与玉米须双向固体发酵工艺优化研究

目的:通过对桦褐孔菌与玉米须双向固体发酵工艺的研究,优化其培养条件。方法:采用固体发酵方法得到发酵产物,通过监测菌丝体生长速度获得平均生长速率、通过紫外分光光度法进行总多糖及总三萜含量测定,最后运用加权平均法确定最佳培养条件。结果:最佳培养条件为培养温度(28±2)℃,固体物料玉米须与玉米芯的最佳配比为1∶3,培养料干重90g/袋,液体菌种接种量为2ml/袋,静置培养周期为50天。结论:通过双向固体发酵技术,采用不同配比固体培养基得到的桦须菌质(HXJZ),菌丝平均生长速率趋势平稳,总多糖、总三萜生物转化率稳定,能够从一定程度上改善桦褐孔菌资源贫瘠的现状,为新药源的开发奠定基础。

松茸/薏苡仁双向固体发酵物中多糖及麦角甾醇的含量测定

目的:初探松茸菌/薏苡仁双向固体发酵工艺,建立菌质多糖、麦角甾醇含量的测定方法。方法:采用紫外分光光度法测定多糖,检测波长为530 nm;高效液相色谱法测定麦角甾醇,选择紫外检测器,检测波长为282 nm。结果:多糖浓度在0.008~0.08 mg/mL范围具有良好的线性关系,回归方程Y=15.986X-0.0126,r=0.9993,菌质多糖含量为42.77%;麦角甾醇在0.2096~1.4672μg范围内具有良好的线性关系,回归方程Y=1243.6X-37.7,r=1,菌质麦角甾醇含量为0.037%。结论:本研究建立的方法简便、快速、准确,重复性好,为松茸/薏苡仁双向固体发酵菌质多糖及麦角甾醇的含量测定提供了依据。

双向固体发酵应用于中药的研究进展

发酵作为常用的中药炮制技术之一,是指在一定条件下借助微生物和酶的催化分解作用,改变原有药性、药效的方法。现系统综述双向固体发酵技术的现状、常用的发酵菌种、发酵前后对中药毒性及药效成分的影响,并对中药发酵的发展方向提出了建议,可为后续深入研究和开发利用中药发酵技术提供参考。

提高灵芝-当归双向固态发酵基质抗氧化活性的条件优化研究

采用双向固体发酵技术,以当归为药性基质,灵芝为发酵菌种,以发酵产物的抗氧化活性为检测指标,通过单因素及正交实验,对固体发酵基质的组成及双向发酵条件进行了优化。结果表明,灵芝-当归双向固态发酵的适宜发酵基质组成为:当归粉末15%、麸皮与玉米芯混合料为83%(麸皮∶玉米芯为1∶3)、MgSO40.5%、(NH4)2SO40.5%、KH2PO41%;最佳发酵条件为:灵芝接种量12mL/100g、料层厚度2.5cm、初始pH5.5、发酵时间15d。在该条件下,发酵菌质抗氧化活性最高,其中,DPPH自由基清除率为49.03%,还原力(OD)比发酵前基质提高了6.26倍。