荧光假单胞菌脂肪酶(PFL)的固定化及催化合成乙酸肉桂酯

为提高酶促合成食品添加剂乙酸肉桂酯的效果,选用荧光假单胞脂肪酶(PFL)为生物催化剂,肉桂醇为底物,乙酸乙烯酯为酰化试剂和溶剂,研究了PFL在反应器内壁上的固定化、及其催化转酯反应合成乙酸肉桂酯的动力学。结果表明,相对于塑料(PMMA和PET),在玻璃壁上的固定化PFL,吸附牢固,活性高。酶的固定化中,水可以明显优化PFL,但是不能稳定PFL;如果添加亲水性大分子羧甲基纤维素(CMC),则可以更好地稳定PFL。催化转酯18h,在玻璃壁上的CMC-固定化PFL可转化底物99%,再次使用时仍可转化83%的底物;而水-固定化PFL可转化底物98%,但再次使用时仅转化底物76%;酶粉转化底物86%,再次使用时转化底物62%。可见,在玻璃载体上的CMC-固定化PFL可更有效地催化合成乙酸肉桂酯。

PDA／SiO2大孔复合材料固定化荧光假单胞菌脂肪酶

以具有三维骨架结构的大孔聚合物为模板制备SiO2大孔材料，通过多巴胺在SiO2大孔材料孔道表面的原位聚合制得聚多巴胺表面功能化修饰的二氧化硅大孔材料（PDA/SiO2）。应用SEM、EDX、MIP、BET、TG—DTA和FTIR等技术对修饰前后的材料进行表征。以PDA／SiO2为载体固定荧光假单胞菌脂肪酶（PFL）．优化固定化条件并对比游离脂肪酶和固定化脂肪酶的性质。结果表明SiO2大孔材料具有三维连续贯通的孔道结构，孔径分布在300～500nm，聚多巴胺修饰后形成聚多巴胺／二氧化硅复合纳米薄膜构筑的大孔材料。在固定化时间为14h、pH值为8、初始脂肪酶浓度为0．4mg·mL-1时，固定化效果最佳，酶活回收率达246％。与游离脂肪酶相比，固定化脂肪酶有更宽的温度和pH适用范围、热稳定性显著提高，并展现出良好的储存稳定性和操作稳定性。固定化脂肪酶的Km低于游离脂肪酶的，酶与底物的亲和性较好。

荧光假单胞菌脂肪酶固定化及催化制备生物柴油的工艺研究

研究了不同因素对制备固定化荧光假单胞菌脂肪酶的影响及固定化酶的酶学性质,并初步探讨了利用该固定化酶制备生物柴油的工艺。以海藻酸钠明胶为复合载体,采用包埋法制备固定化荧光假单胞菌脂肪酶,考察了载酶量、颗粒直径等因子对固定化效果的影响,并用制备的固定化酶进行了酶促酯交换合成生物柴油的工艺研究,考察了反应条件如酶量、反应温度、甲醇流加方式、醇油比等因素对甲酯得率的影响。试验结果表明,制备固定化荧光假单胞菌脂肪酶的最优条件为:每克载体给酶量为300 IU,选用6号注射器针头(内径为0.5 mm);通过酯交换,催化大豆油合成生物柴油的最佳反应工艺参数为:固定化酶25%,醇油比4:1,含水量6%,反应温度40℃;此条件下反应35 h后,甲酯的最高得率可达82%。

铜绿假单胞菌S8脂肪酶酶学性质及固定化研究

以耐甲醇铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）S8为出发菌株,通过摇瓶发酵产脂肪酶,对发酵脂肪酶粗酶液进行酶学性质及固定化研究。结果表明：该脂肪酶反应的最适温度为35℃,最适p H值为7.0,在p H 6.0～8.0酶活较稳定。以硅藻土为载体,采用吸附法,对脂肪酶进行固定,脂肪酶的最佳固定化条件为：载体硅藻土与脂肪酶质量比为10,固定化温度为30℃,缓冲液p H值为7.5,固定化时间为2.5 h。

固定化假单胞菌脂肪酶催化(R,S)-3-羟基丁酸乙酯转酯化拆分

设计制备出比表面积290.6 m2/g、平均孔径和孔体积16.5 nm和1.66 cm3的功能化介孔载体G-NH2-MCF,G-NH2-MCF共价结合假单胞菌脂肪酶(Pseudomonas sp Lipase,PSL),获得了固定化酶PSL/G-NH2-MCF。在甲苯溶剂中,乙酸乙烯酯作酰化剂,固定化酶PSL/G-NH2-MCF催化(R,S)-3-羟基丁酸乙酯的转酯化拆分反应,转化率为15.6%,(S)-3-羟基丁酸乙酯的对映体过量值(eeS)为17.8%,(R)-3-乙酸基丁酸乙酯对映体过量值(eeP)为96.2%,对映选择性参数E为61;而在相同条件下,使用游离酶PSL催化拆分反应,转化率、eeS、eeP和E值分别为2.16%,1.95%,88.2%和16,PSL经G-NH2-MCF固定化后催化性能得到明显提高。同时研究了固定化酶PSL/GNH2-MCF催化(R,S)-3-羟基丁酸乙酯转酯拆分的反应条件对转化率和对映选择性的影响规律。

响应面法优化洋葱假单胞菌产脂肪酶液体发酵工艺

用响应面法对洋葱假单胞菌G-63液体发酵产脂肪酶条件进行了优化。首先运用单因子试验筛选出麦芽糖和豆粉水解液为最适碳源和氮源。在此基础上,通过Plackett-Burman设计试验,对影响产酶条件的11个相关因子进行评估并筛选出具有显著效应的3个因子:橄榄油、豆饼粉水解液以及初始pH值。在用最陡爬坡实验逼近以上3个因子的最大响应区域后,采用响应面分析法,确定出橄榄油、豆粉水解液的最佳浓度和最佳初始pH值分别为4.337%,1.956%和8.38。优化后液体发酵培养基中脂肪酶活力提高到44.39 U/mL,比初始酶活13.45 U/mL提高了3.3倍。

洋葱假单胞菌(Pseudomonas cepacia)PCL-3产脂肪酶发酵条件研究

研究了洋葱假单胞菌(Pseudomonas cepacia)PCL-3发酵产碱性脂肪酶培养条件的优化。采用单因子试验筛选出糊精为最适碳源,蛋白胨和尿素为复合氮源。通过Plackett-Burman设计试验,对影响产酶条件的8个相关因子进行评估并筛选出具有显著效应的3个因子:尿素、接种量以及初始pH值。用最陡爬坡实验逼近显著因子的最大响应区域后,采用响应面分析法,确定尿素、接种量以及初始pH值最优值分别为0.15%,3.05%和8.59。优化后液体发酵培养基中脂肪酶活力提高到48.88U/ml,比初始酶活25.37U/ml提高了1.93倍。10L的发酵罐中,脂肪酶活力在52h达到最大,为47.69U/ml。

洋葱假单胞菌产脂肪酶条件的优化

采用Rashid N p-nPP比色法,通过单因素试验和正交试验对洋葱假单胞菌(Pseudomonas cepacia)产脂肪酶的培养基主要成分和发酵条件进行优化,以提高聚丁二酸丁二醇酯(PBS)的生物降解速率。结果表明,该菌种产脂肪酶的最适培养基为菜子油5.0 g/L,酵母膏0.5 g/L,乳化剂Tween-60 2.5 g/L,培养基初始pH 8.0;最适培养条件为接种量9%,培养温度35℃,摇床转速130 r/min,培养时间3 d。在此优化培养基条件下,洋葱假单胞菌产脂肪酶活性可达32.935 U/mL。

固定化荧光假单胞菌脂肪酶用于催化低酸值餐饮废油的酯交换反应

动植物油脂的酯交换反应是制备脂肪酸烷基酯的一个重要反应。其中,脂肪酸甲酯、乙酯为普通石化柴油的优质替代燃料。脂肪酶易于固定在海于连续生产生物柴油,试验研究了一株商业荧光假单胞菌(P.fluorescens ATCC 13525)固定化脂肪酶催化低酸值餐饮废油和甲醇合成生物柴油的最优工艺条件。通过对反应温度、pH值、醇油物质的量比、酶的用量,反应时间等重要参数的研究,得到最优工艺条件:当反应温度为40℃,pH 7.0,醇油物质的量比4∶1,酶用量为3.0 g,反应时间48 h,反应体系含水量为8%时,生物柴油的得率最高。所制备的产品经分析测试,完全可以替代普通石化柴油,而且对现有内燃机无需做任何改动。

静置的固定化荧光假单胞菌脂肪酶(PFL)生物反应器中催化合成乙酸香茅酯

为提高脂肪酶催化合成乙酸香茅酯的效率,优化催化条件,通过物理吸附,将脂肪酶Pseudomonas fluorescens lipase(PFL)固定在脱脂棉上,与柱形瓶或滴定管形成简易的生物反应器,并用于催化香茅醇与乙酸乙烯酯反应,合成乙酸香茅酯。结果发现,即使在静置条件下,在脱脂棉固定化PFL瓶型生物反应器中,在37℃催化反应24 h,香茅醇转化成乙酸香茅酯的转化率达96%以上。同样在静置条件下,在脱脂棉固定化PFL管式生物反应器中,在室温下催化反应4 h,香茅醇转化成乙酸香茅酯的转化率达68.5%。显然,制备的固定化酶反应器具有高效的催化作用。

响应面法优化洋葱伯克霍尔德菌固定化脂肪酶催化合成生物柴油工艺

以自制的洋葱伯克霍尔德菌固定化脂肪酶为催化剂,在微水相、无溶剂体系中研究了大豆油和甲醇合成生物柴油的工艺。在系统考察了酶用量、醇油比、含水量、反应温度、反应时间、甲醇流加方式等因素对甲酯得率影响的基础上,利用响应面试验设计优化了各主效因子,建立甲酯得率的二次回归方程,获得了最优的工艺条件:加酶量2.4%、加水量7.1%、反应温度40.4℃、反应时间10.7 h、醇油比4.5。在此条件下,实验测得甲酯得率为97.2%,与响应面模型预测值96.9%非常吻合,说明该优化方法有效、可靠。

海藻酸-SiO_2杂化凝胶固定化洋葱伯克霍尔德菌脂肪酶的研究

利用四乙氧基硅烷(TEOS)原位水解法将S iO2掺杂于海藻酸(ALG)凝胶中,通过双交联制备出新型ALG-S iO2杂化凝胶以固定化洋葱伯克霍尔德菌脂肪酶。结果表明,固定化酶的最优条件:质量分数为2.0%的ALG、0.2 mol/L CaC l2、V(ALG)/V(TEOS)为5、加酶量为1 g ALG加100 mg酶粉、固定化60 m in、采用直径为0.8 mm的针头滴定、真空冷冻干燥。在此条件下,酶蛋白的包埋率可达100%,酶活回收率可达91%。固定化酶的最适pH为8.0,最适作用温度为50℃,重复使用8次后,酶活性仍能保持80%以上。ALG-S iO2杂化凝胶的场扫描电镜(FESEM)观察发现凝胶的整体构造仍然是海藻酸凝胶骨架;与ALG凝胶平滑的内部相比较,杂化凝胶仍具有完整的网络结构,但内部更为粗糙,结构更为致密。

磷酸缓冲盐和硫酸钠对洋葱假单胞菌脂肪酶的非水相激活(英文)

研究了kosmotropic型磷酸缓冲盐和硫酸钠对洋葱假单胞菌脂肪酶(Pseudomonas cepacia lipase,PCL)非水相催化性能的影响.以往磷酸缓冲盐被用来调控体系的pH值,其掺杂量对酶的催化活性无明显影响,而适量硫酸钠的掺杂则可有效提高酶在非水相的催化活性.本文研究发现,通过精确调控冻干过程,磷酸缓冲盐掺杂能够将PCL在有机相中的转酯化活性提高近10倍,达到其水相本征活性的50%,这一激活效果甚至高于硫酸钠掺杂.利用热重方法分析了盐掺杂PCL的含水量和蛋白结构,并将失重结果同其在有机相中的催化活性相关联,发现PCL在磷酸缓冲盐和硫酸钠掺杂下的催化构型与蛋白含水量及其周围盐环境具有不同的依赖关系.利用2-(4’-氨基-2’-羟基苯基)苯并恶唑作为荧光探针,研究了磷酸缓冲盐和硫酸钠掺杂的PCL悬浮于有机相时对荧光探针发射光谱的影响,发现盐掺杂酶制剂的存在能够大大增加荧光探针稳定于极性溶剂的构型含量,这可能与蛋白周围掺杂盐键和的水分子有关.如果用探针分子稳定于极性溶剂和非极性溶剂的构型比值间接表示悬浮酶制剂的极性结构,在正己烷体系中硫酸钠掺杂的PCL具有比磷酸缓冲盐掺杂的PCL大得多的极性,且酶制剂的极性大小与其非水相转酯化活性之间具有相似的变化趋势.上述研究结果表明,掺杂盐对粗PCL酶制剂的激活可能部分归因于掺杂盐键和的水分子在蛋白周围构筑的极性环境.

基于分子对接的洋葱假单胞菌脂肪酶催化制备R-N-(2-甲基-6-乙基苯基)丙氨酸的分子机制

采用分子对接方法,研究了洋葱假单胞菌脂肪酶(BCL)不对称酯水解制备光学纯的N-(2-甲基-6-乙基苯基)丙氨酸(NEMPA)的分子机制。通过将立体电子效应的构象约束条件引入计算机分子对接中,在Autodock 4.2软件中筛选到不同烷基链长的(R,S)-NEMPA与BCL活性口袋合适的反应型构象,对实验数据进行了合理解释;基于能量最优、空间互补原则,预测了Val266和Leu287为调控BCL对映体选择性的关键氨基酸位点,为定点突变提高BCL的对映体选择性提供了理论指导。

褐煤协同球红假单胞菌固定SRB颗粒处理AMD中Fe^(2+)、Mn^(2+)试验研究

针对硫酸盐还原菌(Sulfate-Reducing Bacteria,SRB)易受高浓度重金属、低pH抑制,以及需要投加碳源材料等问题,采用微生物固定化技术,以SRB、球红假单胞菌和褐煤作为主要固定基质,制备褐煤协同球红假单胞菌固定SRB颗粒(L-P-SRB),探究L-P-SRB对酸性矿山废水(Acid Mine Drainage,AMD)中含Fe^(2+)、Mn^(2+)和SO_(4)^(2-)的去除效果。基于还原动力学及吸附动力学结合扫描电镜(SEM)和傅里叶红外光谱仪(FT-IR)等手段,揭示L-P-SRB处理AMD的机理。同时,探究了低温处理L-P-SRB对AMD的修复效果,为低温条件下矿区处理AMD提供一定的依据。结果表明:L-PSRB对Fe^(2+)和Mn^(2+)的去除率分别为91%和79%,吸附Fe^(2+)和Mn^(2+)的过程均符合拟一级动力学;对SO_(4)^(2-)的去除率分别达到了91.28%和81.94%,还原SO_(4)^(2-)的过程符合一级动力学。与Fe^(2+)相比,Mn^(2+)对L-P-SRB活性有一定的抑制作用。L-P-SRB能将废水中的Fe^(2+)、Mn^(2+)和SO_(4)^(2-)一次性去除,很好的解决了褐煤只能单纯吸附重金属离子和SRB需要投加碳源的问题。低温冷藏处理不会抑制L-P-SRB的活性,为一次制备多次使用提供了依据。由SEM和FT-IR检测可得,L-P-SRB在处理废水的过程中,球红假单胞菌优先发挥作用,破坏褐煤的结构,部分官能团被破坏,褐煤中的C—C、C=O以及环烃、烷烃、烯烃的侧链断裂,产生大量小分子有机物,增大了颗粒的比表面积,提高了颗粒的吸附能力。同时褐煤为SRB还原SO_(4)^(2-)提供了载体和大量的碳源,促进了SRB的生长,提高了对AMD的处理效果。

类产碱假单胞菌耐热碱性脂肪酶的研究

从福建省福州市温泉澡堂污水浸润土壤中分离筛选到一株耐热碱性脂肪酶产生菌——类产碱假单胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes)F331。产酶最适条件为:碳源小麦粉,氮源豆饼粉,起始培养pH9.4～9.5,培养温度24～26℃,培养周期32～34h。经硫酸铵盐析、Sepharose 4B和Sephadex G-200柱层析得到纯化的酶组分。该酶最适作用温度50℃,最适作用pH 10.0,60℃保温80min酶活基本不损失,在pH 7.0～10.0范围内酶蛋白稳定:Ca^(2+)和Mg^(2+)对酶有激活作用,Pb^(2+).Zn^(2+)、Fe^(2+)和Co^(2+)对酶活有抑制作用。该酶分子量45700。

竹炭固定化假单胞菌处理含酚废水的研究

以竹炭为载体,将假单胞菌固定在竹炭上,用竹炭固定化假单胞菌降解苯酚,研究竹炭固定化假单胞菌对苯酚的降解。考察了固定化微生物添加量、pH、重金属离子等对苯酚降解的影响以及进水浓度随反应时间的变化关系;研究了竹炭固定化假单胞菌降解苯酚的反应动力学。通过对比试验,分析了竹炭固定化微生物法相对于活性污泥法的优势。结果表明：竹炭固定化假单胞菌能有效地降解水样中苯酚。在pH5~8范围内、200mL水样中固定化假单胞菌添加量为20g时,竹炭固定化假单胞菌对苯酚的降解效率最高。各种重金属离子对竹炭固定化假单胞菌的生物活性均有抑制作用,抑制程度由高至低依次为：Ag^＋、Cu^2＋、Cd^2＋、Co^2＋、Cr^6＋、Mn^2＋、Zn^2＋。竹炭固定化假单胞菌降解低浓度苯酚达到浓度变化相对稳定态所需时间比降解高浓度苯酚短,对低浓度苯酚的降解效率、降解速率明显高于高浓度苯酚。苯酚的降解过程可分为两阶段,两阶段均符合一级反应动力学模式。竹炭固定化假单胞菌对苯酚的降解相对于活性污泥法,不需污泥回流,固液易于分离,污泥量少,对高浓度苯酚的降解率更高、处理量更大。

竹炭固定化紫外诱变假单胞菌处理间甲酚废水的研究

用紫外光对假单胞菌株进行诱变,以竹炭为载体,将紫外诱变假单胞菌固定在竹炭上,用竹炭固定化紫外诱变假单胞菌处理间甲酚水样。考察竹炭固定化紫外诱变假单胞菌投加量和水样pH值对间甲酚去除的影响以及进水浓度随反应时间的变化关系,研究竹炭固定化紫外诱变假单胞菌去除间甲酚的反应动力学。结果表明:相对于原菌株,菌株经紫外诱变后,生长周期缩短了6h。经紫外照射120s的假单胞菌可以在竹炭表面及内部孔隙形成明显菌胶团,诱变菌在竹炭上所成的生物量明显较未经诱变菌增加。竹炭固定化紫外诱变假单胞菌能有效地去除水样中间甲酚。竹炭固定化紫外诱变假单胞菌投加量和水样pH值影响到间甲酚的去除效果,pH值在4～6时,间甲酚的去除效果较好。20g竹炭固定化紫外诱变假单胞菌处理100mL初始浓度50,100,120,150,180mg·L-1间甲酚模拟水样42h,去除率依次为90.9%,76.4%,72.9%,64.6%和49.7%。竹炭固定化紫外诱变假单胞菌对间甲酚的去除能较好地符合零级反应方程。

固定化铜绿假单胞菌GF31对氯氰菊酯降解的强化作用

研究了沸石固定化铜绿假单胞菌GF31的氯氰菊酯降解特性及强化修复效果。综合考虑氯氰菊酯特性及其传质等因素,选择沸石为载体进行固定化,电镜扫描结果显示,菌株GF31能较好地生长于沸石载体孔隙中。固定化后菌株GF31的去除率和比降解速率提高,6d对100mg·L-1氯氰菊酯的去除率由37%提高至61.4%,游离细胞和固定化细胞对于300mg·L-1的氯氰菊酯的平均比降解速率分别为487和917mg·[L·d·(g细胞干重)]-1。固定化细胞对pH和高浓度氯氰菊酯的耐受性显著增强,在pH 10或者菊酯浓度为800mg·L-1时仍能保持一定的降解活力。投加固定化细胞对实际土壤进行生物强化修复,其降解过程可用一级动力学方程来描述。与自然降解相比,氯氰菊酯的半衰期t1/2由34.3d缩短至8.02d,显示出固定化细胞良好的强化修复效果。

一株红树林来源施氏假单胞菌的分离及其在水质净化中的应用

随着水产养殖业的快速发展,养殖水环境日趋恶化,养殖动物病害频发。益生菌因其对环境友好和安全而被广泛应用于养殖水环境的改善中。但细菌易受外界环境影响,稳定性不高,这严重制约了其在养殖水环境中的应用。固定化微生物技术可以大幅提高优势菌种在水环境中的稳定性,为细菌在水质净化应用提供了方向。该研究从三亚白鹭公园红树林根际土壤中筛选出一株高降解亚硝酸盐的菌株X1,该菌株在第4 d时亚硝酸盐降解率可达到97.18%。经16S rRNA基因的系统发育树分析表明,该菌株属于施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)。将该菌株与海藻酸钠-壳聚糖复合载体结合形成固定化小球,投入到养殖废水中,亚硝酸盐降解率在第2天就可以达到98.15%,第3天和第4天降解率保持平稳,并无亚硝酸盐积累,在第5天达到98.35%。该研究结果证实了施氏假单胞菌能够高效、快速且安全地降解水体中的亚硝酸盐,使用固定化技术能够更好地提高该菌株的降解速率及其稳定性,这为固定化施氏假单胞菌应用于水体净化提供了一定的参考。