固定化酶反应器及其在蛋白质组研究中的应用

综述了近年来国内外酶固定化载体的研究进展,侧重于无机材料和有机聚合物材料上的固定化酶方法;此外,也介绍了固定化胰蛋白酶反应器与分离系统联用在蛋白质样品分析中的应用,并展望了固定化酶反应器的研究方向及其在蛋白质组中的应用前景。

采用磁性载体制备的固定化酶反应器的载体粒径对蛋白质酶解性能的影响

研究了以不同粒径的磁性颗粒为载体的固定化酶反应器在蛋白质酶解过程中,其粒径大小对团聚、酶解效率和漏切位点等的影响。实验结果表明,纳米级颗粒的酶负载量为亚微米级的3.5倍左右。但当酶固定量相同时,酶解效率基本相当。而在一定程度上加大磁性颗粒的粒径后,团聚现象得到明显改善。选择磁性载体粒径为20nm的固定化酶反应器,对其性能进一步考察。结果显示胰蛋白酶与牛血清白蛋白(BSA)的质量比为1∶1时,即能于1 min内实现快速酶解;当酶解10 min时,其零漏切位点肽段数和蛋白质序列覆盖率基本达到稳定,并明显优于溶液酶解水平。通过对漏切位点的统计分析比较,发现固定化酶解与溶液酶解时的漏切位点规律基本类似。因此,采用不同粒径磁性载体制备的固定化酶反应器均可在蛋白质组学研究中提供快速、高效的酶解。

蛋白质组学中的固定化酶反应器制备的研究进展

固定化酶反应器作为蛋白质组学研究中"bottom-up"策略重要的组件,具有酶解快速、酶解效率高、酶稳定性和活性高、简单易操作、能够与多种检测方式联用等优点,对于发展高效快速的蛋白质组学分析方法具有重要意义。本文就固定化酶反应器的制备方法及其在蛋白质组学中的应用做简单的概述,着重介绍酶的固定方法、固定化酶的载体、用于固定的酶的种类。近几年固定化酶反应器的研究集中于提高固酶量、保持酶活性、增加酶解效率、减小非特异性吸附等方面。研究结果表明,采用纳米材料、整体材料等新型载体,提高载体亲水性,采用多酶同时酶解等方法能够有效改善固定化酶反应器的性能,提高蛋白质的鉴定效率。

建立脑双位点微透析结合高效液相色谱-柱后固定化酶反应器-电化学方法同步监测大鼠腹内侧前额叶皮质和海马中乙酰胆碱和胆碱含量

目的建立同步动态监测清醒自由活动状态下大鼠腹内侧前额叶皮质（mPFC）和海马细胞外液中乙酰胆碱（ACh）和胆碱（Ch）方法,用于药物干预下不同脑区胆碱类神经递质变化研究。方法建立mPFC和海马双位点双通道同步微透析采样技术和高效液相色谱-柱后固定化酶反应器-电化学（HPLCIMER-ECD）方法。通过对清醒自由活动大鼠mPFC和海马同步灌流透析取样,HPLC-IMER-ECD分析药物作用下大鼠mPFC和海马细胞外液中ACh和Ch的动态变化,验证该技术方法的可行性和适用性。结果大鼠mPFC和海马双套管植入术及透析采样后状态表现良好,表明脑双位点双通道同步微透析采样技术可行。HPLC-IMER-ECD法测定ACh和Ch,两者浓度在0.02-2.00μmo·lL-1范围内线性关系良好,ACh最低检测限为10 nmo·lL-1,Ch最低检测限为5 nmol·L-1（信噪比为3∶1）。ACh 0.1,0.4和2.0μmol·L-1日内精密度相对标准偏差为0.87%-1.83%,日间精密度为5.38%-6.80%;Ch日内精密度相对标准偏差为1.60%-2.91%,日间精密度相对标准偏差为5.56%-7.38%;ACh相对回收率为96.0%-113.0%,Ch为102.3%-109.2%。叠氮钠能明显降低mPFC和海马细胞外液中ACh（P〈0.05）,但能显著升高两脑区内Ch含量（P〈0.05）。人参皂苷Rg1可逆转叠氮钠导致的海马区ACh降低（P〈0.05）及mPFC和海马区Ch含量的升高（P〈0.05）。mPFC细胞外液中ACh和Ch较高,受到叠氮钠影响较海马区更敏感。结论脑双位点微透析结合HPLC-IMER-ECD方法能同步监测大鼠mPFC和海马中ACh和Ch含量变化。人参皂苷Rg1可通过调节脑内ACh和Ch动态平衡,增强中枢胆碱能系统的功能。

固定化酶酸化反应器/UASB处理黄浆废水的研究

针对现有两相厌氧反应器微生物易流失以及单方面延长酸化相的停留时间导致的过酸化影响后续甲烷化过程的现象，开发了一套新型两相厌氧处理系统，其酸化相是采用大孔树脂固定化酶作生物载体的水解酸化反应器，产甲烷相则是接种了经长期驯化培养的高温厌氧污泥的UASB。采用该装置处理玉米加工过程中产生的富含蛋白质废水（黄浆废水），考察了进水COD浓度和负荷、C／N值等因素对系统处理效能的影响。结果表明：该装置运行稳定，在低C／N值和低负荷条件下，酸化相的酸化率（VFA／COD）即可达30％以上，其出水pH值稳定在6．7～7．0；产甲烷相对COD的去除率为91．3％，进水C／N值对产甲烷相去除COD有明显影响。

固定化脂肪酶催化合成棕榈酸异辛酯的反应器制备研究

开发了填充床式固定化酶反应器合成高档化妆品原料棕榈酸异辛酯的生产工艺,以棕榈酸,异辛醇为原料,使用实验室自制的固定化假丝酵母脂肪酶99-125为催化剂。并对反应器的固定化酶用量,底物浓度,循环流速,填充柱径高比等操作参数以及稳定性进行了研究,反应12 h最终的酯化率可达97%,固定化酶使用31批以后,12 h酯化率仍然可以达到93%。

动态膜分离式固定化酶反应器操作性能研究

在开发研制的动态膜分离式固定化酶反应器（ＤＭＩＲ）上进行了不同操作形式的连续酶解反应实验， 证明了ＤＭＩＲ具有多功能性，并得到了实验范围内的ＤＭＩＲ的最适操作条件。

固定化酶反应器制备新型烟草保润剂的研究

通过对苹果及其皮渣进行预处理、水解、脱酯转化、脱色、浓缩、干燥等系列处理工艺，获得高纯度果胶．采用先进的固定化酶反应技术，利用α－ 淀粉酶的催化作用，对所得果胶进行低酯化处理；对水解产品与底物进行超滤分离，最终获得高纯度、低酯化度的Ｄ－ 吡喃半乳糖醛酸．

原子转移自由基聚合修饰银丝固定化酶反应器的制备及在蛋白质组鉴定中的应用

针对传统溶液酶解存在的酶解时间较长、酶自切物干扰以及蛋白酶不能重复使用等缺陷,通过电子转移生成催化剂的原子转移自由基聚合法修饰银丝,并以其为载体制备了一种新型的固定化酶反应器。用质谱考察了银丝固定化酶反应器(SW-Trypsin)的酶解效率、重复性和回收率。结果表明:绒毛状聚合物修饰的SW-Trypsin的酶解效率较高,酶解标准蛋白牛血清白蛋白(BSA)20 min后,肽段的氨基酸序列覆盖率可达93%,高于传统溶液酶解方法酶解16 h所得79%的覆盖率。使用该固定化酶反应器于一个月内8次酶解BSA所得的氨基酸序列覆盖率在89%到97%之间,平均覆盖率为94%,显示出良好的稳定性。另外,该固定化酶反应器酶解马心肌红蛋白(MYO)的回收率为87.67%。最后,用SW-Trypsin酶解腾冲嗜热菌全蛋白20 min,所鉴定到的氨基酸序列覆盖率和蛋白数量与同样条件下溶液酶解16 h的结果接近,且零漏切位点肽段的比例更高。加之容易分离的优点,SW-Trypsin在蛋白质组学的应用中具有良好的前景。

基于中心辐射树枝状介孔二氧化硅构筑CPO固定化酶反应器及应用

首先制备粒径均匀的具有开放的三维中心辐射树枝状结构的介孔二氧化硅(DSP)粒子,再通过静电相互作用在孔道内负载氯过氧化物酶(CPO)构筑了CPO@DSP固定化酶反应器.通过改变硅源正硅酸乙酯(TEOS)和模板剂十六烷基三甲基氯化铵(CTAC)的浓度调控孔径大小,研究了孔径对固定化酶反应器催化活性的影响;同时基于酶促反应动力学分析探讨了孔道内酶催化反应的限域效应,并进一步在CPO@DSP表面包覆海藻酸钠(SA)水凝胶薄膜以抑制酶反应器在使用过程中酶分子的泄露,所得SA-CPO@DSP固定化酶反应器的重复使用性显著提高,循环使用10次后,仍能保持90%以上的催化活性.将SA-CPO@DSP酶反应器用于环境水体中残留抗生素左氧氟沙星的降解,对100μg/mL的底物在25 min内降解率可达88%以上;将该反应器用于苯酚的视觉比色检测,裸眼可检测到5μmol/L的苯酚,表明SA-CPO@DSP酶反应器在环境保护方面具有良好的应用前景.

固定化β-葡萄糖醛酸酶反应器的制备及其在4-甲基亚硝胺基-1-(3-吡啶)-1-丁醇的O-糖苷化合物分析中的应用

采用溶胶-凝胶法,以丙烯酰胺作为单体,制备了基于有机-硅胶杂化整体柱的β-葡萄糖醛酸酶反应器。优化了硅酸甲酯和γ-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅的物质的量的比、丙烯酰胺和聚乙二醇的用量,以及水浴温度等制备条件,获得了孔隙均匀、通透性良好、机械强度高的有机-硅胶杂化整体柱。采用光学显微镜和扫描电镜表征杂化整体柱。进一步将β-葡萄糖醛酸酶共价键合在整体柱上,以4-甲基亚硝胺基-1-(3-吡啶)-1-丁醇(NNAL)的O-糖苷化合物(NNAL-O-Gluc)为底物研究酶反应器的水解效果,实验结果证明酶反应器在室温条件下的水解效率大大提高,实现了NNAL-O-Gluc高效水解与分析,解决了目前NNAL-O-Gluc分析中前处理水解效率低的问题。

基于多级孔金属有机骨架构筑HRP固定化酶反应器及其染料降解应用

以不稳定的Cu-金属有机骨架(Cu-MOF)为模板剂,利用自组装模板法制备多级孔Zr-MOF,再通过物理吸附法在多级孔Zr-MOF的介孔孔道中负载辣根过氧化物酶(HRP)构筑了HRP@Zr-MOF固定化酶反应器.通过改变孔径调节剂苯甲酸(HBC)的浓度调控孔径大小,研究了孔径对固定化酶反应器催化活性的影响;考察了固定化体系缓冲溶液pH值、固定化时间及温度对固定效果的影响.以HRP催化降解结晶紫染料为模型反应,探讨了HRP@Zr-MOF的操作稳定性和重复使用性.结果表明,pH=3.0、固定化时间为60 min、固定化温度为30℃是固定化HRP的最佳条件,固载量最高可达61.6 mg/g.与游离酶相比,HRP@Zr-MOF固定化酶反应器表现出更好的热稳定性、酸碱稳定性、H2O2稳定性和储存稳定性;重复使用10次后,HRP@Zr-MOF的催化活性仍能保持62.3%.将HRP@Zr-MOF应用于实际水样中结晶紫染料的催化降解,在5 min内降解率高达90%以上,表现出非常高效的催化效率.

基于DNA定向固定化技术构建毛细管固定化酶微反应器的研究进展

生物酶影响着物质代谢和质能转换等生命活动,生物体内某些酶的活性变化会导致疾病的发生。发展新型的酶分析方法对深刻理解生物代谢过程、疾病诊断和药物研发等具有重要意义。毛细管电泳(CE)具有分离效率高、分析速度快、操作简单和样品消耗少以及可与多种检测手段联用等优点,在酶分析研究中越来越受到关注。CE酶分析主要包括离线和在线两种模式,其中,固定化酶微反应器与毛细管电泳联用(CE-IMER)的在线酶分析已经成为主要的酶分析方法之一。CE-IMER充分结合了固定化酶和CE的优势,将游离酶固定在毛细管内,不仅可以显著提高酶的稳定性和重复使用性,而且可以实现纳升规模溶液的自动化酶分析,进而显著降低酶分析成本。目前已有大量方法制备IMER用于CE酶分析,然而如何构建性能良好、可再生使用、酶固载量大、自动化程度高的CE-IMER一直是该领域重点研究的问题。DNA定向固定化技术(DDI)可以充分利用DNA分子的碱基互补配对(A-T,C-G),在温和的生理条件下特异性固定生物大分子。由于短链双螺旋DNA分子具有较强的机械刚性和物理化学稳定性,通过DDI将酶固定在载体表面,有利于降低传质阻力,提高酶与底物的接触能力,进而促进酶促分析过程。该文主要综述了利用DDI构建新型IMER在CE酶分析中的应用现状,并对其未来发展进行了展望。

动态膜分离式固定化酶反应过程分析

测定了实验系统下固定化酶的本征动力学常数 ,从动力学角度分析研究了所开发研制的动态膜分离式固定化酶反应器 (DMIR)的反应过程 ,给出了无外扩散限制条件下的 DMIR反应器的数学模型 。

基于环氧功能基团的杂化硅胶固定化酶反应器

在蛋白质组学研究中,为解决自由溶液酶解时间长、蛋白酶自降解等问题,各种类型的固定化酶反应器引起了人们的关注.采用溶胶凝胶法,在100μm内径毛细管内,以3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷为功能单体,以四乙氧基硅烷为交联剂,制备了一种新型的杂化硅胶整体材料.并通过在整体柱表面由环氧功能团水解得到的二醇与胰蛋白酶(trypsin)的氨基进行一步反应,实现了胰蛋白酶固定化.利用该IMER,在47s内实现了牛血清白蛋白的酶解;经反相色谱分离和质谱鉴定,序列覆盖率在35%以上,与自由溶液酶解12h的效果相当.结果表明,基于亲水性杂化硅胶整体材料的IMER有望在蛋白质组学研究中发挥重要作用.

固定化酶微反应器的制备及应用

固定化酶微反应器是将生物分子固定技术与生化微反应相结合制备的一种固定化催化装置。这种微型化的反应系统由于兼具固定化酶的特异性催化、可重复利用及微分析的低消耗、易分离等优点,在生命科学如蛋白质组学、酶抑制剂的筛选、生物催化等领域具有非常重要的作用。固定化酶微反应器的性能与其制作方法关系密切。本文着重从酶与固定化载体结合方式的角度,对近年来固定化酶微反应器的各种制备方法和应用进行了较为详细的评述。重点讨论了各种方法的优缺点和最新的发展情况,并对其发展前景进行了展望。

基于共价键合法的毛细管固定化酶微反应器的制备

制备了一款开管式乙酰胆碱酯酶(ACHE)毛细管酶微反应器。该制备方法中,首先在毛细管内壁修饰上末端带有双键的硅烷化试剂,再采用N-丙烯酰氧琥珀酰亚胺作为功能单体,通过自由基聚合将其修饰在毛细管内壁上,最后通过共价键合的固定化方式,十分简便地实现了毛细管内壁的ACHE固定化。测试连续制备的6个ACHE酶微反应器,其产率的相对标准偏差(RSD)在3%以下;制备的ACHE酶微反应器在1 min孵育时间里的产率高达45%左右,可以较快进行酶活测试,每次分离仅需2. 5 min,10 h内重复使用40次后仍然能够保持酶活性,表明制备的ACHE酶微反应器具有较好的重复利用性和较高的酶活性。

Al-MOF基多级孔Al_(2)O_(3)固定化酶反应器的构筑及构效关系研究

针对生物酶在固相载体负载后存在的催化活性与稳定性之间"此消彼长"的问题,本工作采用"自牺牲模板"策略以铝基金属有机骨架材料(Al-MOF)为前驱体设计制备多级孔Al_(2)O_(3)(MHAl_(2)O_(3))材料,再以"聚多巴胺(PDA)"仿生膜对材料表面进行功能化修饰后用以固载辣根过氧化物酶(HRP).通过调节前驱体的煅烧温度来实现载体孔径大小的调控,探讨了载体的孔道限域效应对固定化酶反应器催化活性的影响,所得固定化酶反应器的热稳定性和重复使用性显著提高.为了解析固定化酶反应器的构效关系,采用酶动力学和热动力学参数研究了固定化酶反应器催化过程中酶与底物的相互作用,结果表明固载后酶分子对底物的亲和性和专一性得到提升.将固定化酶反应器用于模拟废水中苯胺黑药的催化降解时,表现出非常高效的催化效率.

浅谈酶及与之相关的考题

酶是蛋白质,作为一种催化剂,其分子结构非常复杂.酶在催化反应中只是暂时的参与,反应后又会以原来的形式被释放出来,进行催化其它的同类反应.酶在起催化作用时,必须与底物结合.一、酶分子的几个部位1.结合部位酶分子中按特定的空间位置与底物相适应的部位,能使底物与酶结合起来,形成一种复合的中间产物.酶只有与底物形成复合的中间产物,才能促使底物的结构发生某些化学变化.

酶工程在食品加工中的作用探讨

酶工程概述近年来,酶工程技术发展较为迅速。由于其绿色、安全、高效的特点,使其在食品工业中的应用范围愈来愈大,为食品工业发展提供了重要的技术支持。酶工程(Enzyme engineering)又被称为蛋白质工程学,指通过利用酶的生物特性及催化功能,大幅度提升原料转化效率,从而促进整体生产效率提升的一种方法。目前,医药工业、食品工业及轻工业是酶工程技术的主要应用领域,特别是在食品工业当中,酶工程技术发挥了重要的作用。近年来,随着固定化细胞技术。