三角酵母D-氨基酸氧化酶的固定化研究

通过共价结合的方法把三角酵母 D-氨基酸氧化酶 (DAO)分别固定在三种大孔高聚物和二种多糖的载体上 ,结果表明多糖类载体壳聚糖和 Sepharose4B比高聚物更能有效地固定化 DAO。经过固定化后 ,壳聚糖和环氧载体Epecust固定化酶对温度和 p H的稳定性提高 ,表观米氏常数增大。在分批式头孢菌素 C氧化脱氨的反应中 ,固定化酶表现出良好的操作稳定性 ,戊二酸单酰基 - 7-氨基头孢霉烷酸的得率为 93%。

固定化D-氨基酸氧化酶转化头孢菌素C为戊二酰基-7-氨基头孢霉烷酸

部分纯化的变异三角酵母D-氨基酸氧化酶(DAO)在碱性条件下变性过氧化氢酶,再与大孔聚甲基丙烯酸缩水甘油酯高聚物共价交联。与游离酶相比,固定化酶的最适反应温度升高,最适pH范围变宽,对温度和pH的稳定性都有明显的提高。固定化DAO在搅拌反应器中催化头孢霉素C(CPC)转化为戊二酰基-7-氨基头孢霉烷酸(Gl-7-ACA)。以0.03g/mL的CPC为底物,在温度25℃、pH7.2条件下,产物的得率>93%,副产物得率<5%。经过110批反应后,固定化酶保持64%的初始活力。

D-氨基酸氧化酶的分离纯化及固定化研究

利用自制的亲和载体EPI-30-ARG-IDA-Co2+对带有6个组氨酸的重组D-氨基酸氧化酶(DAAO)进行分离纯化,其纯化倍数为10倍,酶活回收率达38.35%,SDS-PAGE显示为单一条带。经过Eupergit C载体固定化后,固定化酶对温度和pH的稳定性提高,表观米氏常数增大,固定化酶活力回收高达42.44%。

应用固定化D-氨基酸氧化酶转化头孢菌素C为7-ACA

D-氨基酸氧化酶(DAAO)是两步酶法催化头孢菌素C(CPC)生成7-氨基头孢霉烷酸(7-ACA)的重要酶之一。利用固定化DAAO催化CPC的转化液中,酮酸中间体随批次的增加逐渐减少,反应至第13批时,转化基本完全。当转化液pH由7.2升至7.6时,终止反应,转化率和收率分别达99.6%和93%。分次补加固定化DAAO,可连续转化132批。

D-氨基酸氧化酶的分离纯化及固定化研究

在工业生产的原料当中,D-氨基酸氧化酶属于一种具有重要的工业价值的原料,可以良好构建出大肠杆菌中经过乳糖诱导发酵的表达式,从而对其中的菌体进行提取粗酶液,在进行固化提纯的过程当中,需要保证其中的活性物质的活性没有明显的损失,提升其底物部分的转化率,因此就需要对氨基酸氧化酶的分离提纯技术进行研究。首先对D-氨基酸氧化酶进行了概述,其次对其提纯固化的方式进行了研究。

D-氨基酸氧化酶基因重组逆转录病毒载体的构建及表达

目的 :构建含D 氨基酸氧化酶 (DAAO)基因的重组逆转录病毒载体 ,初步观察DAAO基因的功能。方法 :利用重组DNA技术将DAAOcDNA亚克隆至逆转录病毒载体 (pLDAAOSN)中 ,以磷酸钙沉淀法介导转染包装细胞ΦXNA ,用NIH3T3细胞测定病毒滴度 ,将重组逆转录病毒感染K5 6 2白血病细胞 ,G418筛选出抗性克隆 ,命名为KDAAO。PCR、原位杂交分析外源基因整合和表达 ,观察 5 0mm/LD 丙氨酸对KDAAO杀伤作用。结果 :经酶切鉴定和DNA测序证明重组逆转录病毒载体中含有完整的DAAO基因。包装细胞产生了高滴度病毒 (5 .2× 10 6CFU/ml)。PCR、原位杂交分析证明DAAO基因已整合至KDAAO基因组中 ,并在mRNA水平表达。初步观察到D 丙氨酸能明显杀伤KDAAO。结论

过氧化氢对D-氨基酸氧化酶转化头孢菌素C为戊二酰-7-氨基头孢烯酸反应的影响

在D-氨基酸氧化酶D1AAO转化头孢菌素C(CPC)为戊二酰基-7-氨基头孢烯酸(Gl-7-ACA)的反应中,所生成的过氧化氢同时与CPC和Gl-7-ACA发生的氧化副反应是造成目标产物收率损失的关键因素之一。通过联用溶氧电极和过氧化氢电极,测定了DAAO转化CPC为Gl-7-ACA的反应体系内溶氧浓度与相应的过氧化氢浓度的变化曲线,测知反应体系中过氧化氢浓度积累最高可达5mmol·L-1。模拟该反应条件下过氧化氢的氧化反应可知,在过氧化氢浓度较低时,溶液的酸性可加速该氧化反应。在中性条件下,过氧化氢浓度为5mmol·L-1时,反应1h后,CPC的氧化损失为2%,Gl-7-ACA的氧化损失为3%。通过改进氧气分布器、搅拌转速和并调控氧气流量以控制溶液中溶解氧的浓度,来适度地降低物系中过氧化氢积累浓度,使反应收率提高了2.2%。

固定化D-氨基酸氧化酶催化DL-氨基酸去消旋化制备非天然L-氨基酸

在过氧化氢酶和氧气存在下,固定化D-氨基酸氧化酶(D-AAO)对映选择性催化DL-氨基酸中的D-对映体氧化脱氨为相应酮酸,L-对映体保留.研究了D-AAO的底物特异性并对反应条件进行了优化.结果表明:D-AAO具有较宽的底物谱,能够催化疏水性α-氨基酸的D-对映体氧化脱氨.在最优反应条件下,D-AAO催化DL-2-氨基丁酸、DL-2-氨基戊酸去消旋化,L-2-氨基丁酸、L-2-氨基戊酸的收率分别为48%和47%,ee分别为99.5%和99.8%.进一步地利用Pd-C/HCOONH4催化氧化脱氨过程中产生的亚氨基酸原位还原,有效提高了L-2-氨基丁酸、L-2-氨基戊酸的收率并保持高的光学纯度.

丁胱亚磺酰亚胺增强DAAO/D-Ala系统杀伤K562e细胞作用的研究

目的:研究了丁胱亚磺酰亚胺(BSO)增强D-氨基酸氧化酶(DAAO)/D-丙氨酸(D-Ala)自杀基因系统在白血病基因治疗中的作用。方法:应用逆转录病毒转染技术获得稳定表达DAAO的高致瘤性K562e单克隆细胞K_(DIGC),用PCR、原位杂交对DAAO基因修饰的K_(DfGC)进行鉴定。应用MTT法检测D-Ala对BSO预处理过的K_(DfGC)细胞的杀伤作用。结果:PCR和原位杂交分析证明DAAO基因已整合至细胞基因组中,并在mRNA水平上表达。D-Ala作用24h,K_(DfGC)细胞的半数抑制浓度(C_(50))为10.21mmol/L,K_(DfGC)+BSO的IC_(50)为7.92mmol/L,两者的95％可信区间不重叠。结论:BSO可增强DAAO/D-Ala系统杀伤K652e细胞作用。

两步酶法制备去乙酰基7-氨基头孢烯酸

以生产头孢菌素C(CPC)过程中的副产物去乙酰头孢菌素C(DCPC)为原料,用固定化D-氨基酸氧化酶(DAAO)和固定化戊二酰基酰化酶(GA),连续两步进行酶裂解,制备了去乙酰基7-氨基头孢烯酸(D-7-ACA),总收率72%。滴加浓度为1 mol/L的过氧化氢可使去乙酰基戊二酰基7-ACA(D-G l-7-ACA)的收率提高6%。提高氧气流速和改善搅拌形式可以加快DAAO酶反应速度,使中间产物残留减少3%。高纯度的去乙酰头孢菌素C钠盐(DCPCNa)可以提高该两步酶法反应的收率和产品质量,延长酶的使用寿命。

7-ACA两步酶法中应用空气和DAAO转化CPC的研究

两步酶法制备7-ACA中,采用通空气的方式考察固定化D-氨基酸氧化酶(DAAO)的氧化速率及制备的7-ACA的质量情况。研究发现在罐压为0.20Mpa、气体流量200l/h时DAAO的空气氧化速率与氧气氧化速率相等,制备的7-ACA质量不低于氧气氧化的7-ACA质量。

提高三角酵母细胞DAO表观活力的透性化研究

三角酵母 (Trigonopsisvariabilis)的D 氨基酸氧化酶 (D aminoacidoxidase ,DAO ,EC1 .4.3.3)是一种胞内酶 ,完整细胞并不呈现酶促活性。为了获得三角酵母细胞的较高表观活力 ,需对细胞进行处理以改变壁和膜对反应底物和产物的通透性。研究中比较了冻融、丙酮、丁醇和十六烷基三甲基溴化铵 (Cetyltrimethylammoniumbro mide ,CTAB)等理化因子的透性化效率 ,并对丙酮的透性化条件进行了优化。证明丙酮的透性化作用与溶剂浓度、保温时间和温度有关。 30 %～ 35 %丙酮浓度 ,4～ 2 8℃保温 ,可得到最大酶活力。透性化所需时间极短 ,在 5min内即可完成。同时 ,透性化细胞中的DAO比无细胞抽提液中的酶对热更为稳定。用丙酮透性化细胞作为生物催化剂可有效地转化头孢菌素C(CephalosporinC ,CPC)为戊二酰 7ACA(Glutaryl 7 ACA ,GL 7ACA)。