ERK/Smad信号通路影响固本增骨方对去势大鼠骨代谢的研究

目的由ERK/Smad信号通路探讨固本增骨方对骨质疏松模型大鼠的作用机制,揭示其防治骨质疏松症的药理学效应。方法将SPF级Wistar大鼠,分为固本增骨方低、中、高剂量组,雌二醇组、假手术组及模型组,每组10只,固本增骨方低、中、高剂量组分别以固本增骨方6.1 g/(kg·d)、12.2 g/(kg·d)、24.4 g/(kg·d)的剂量进行灌胃,雌二醇组给予0.09 mg/(kg·d)的戊酸雌二醇灌胃,假手术组和模型组给予等体积生理盐水灌胃。末次灌胃后心脏采血并取材,通过ELISA检测血清BALP、TRACP-5b水平,DXA检测大鼠右侧股骨近端骨密度,并进行HE染色。运用RT-PCR检测ERK-1、ERK-2、Smad4 mRNA表达,Western Blot检测ERK、p-ERK及Smad4蛋白表达。结果经固本增骨方干预后,与模型组比较,中、高剂量可提高骨密度,骨小梁形态明显改善,血清BALPBGP水平,ERK-1、ERK-2、Smad4 mRNA显著增加,ERK、p-ERK及Smad4蛋白表达显著上升(P<0.05),血清TRACP水平显著降低(P<0.05)。结论固本增骨方可改善绝经后骨质疏松模型大鼠的骨代谢,提高骨密度,可能与激活ERK/Smad信号通路促进成骨分化有关。

固本增骨方调控NLRP3/caspase-1/GSDMD成骨细胞焦亡通路防治原发性骨质疏松的研究进展

骨质疏松症(osteoporosis,OP)是重大公共卫生问题,尤其是原发性OP严重影响老年人生活质量,因此防治OP是当今研究的热点和难点。传统医学认为,OP发生的病机以“脾肾亏虚”为主,先天肾与后天脾共司骨骼与肌肉作为人体运动的基础,“骨肉不相亲”、“骨枯髓空”的病理状态下降造成成骨细胞代谢异常,导致OP的发生。现代医学研究发现,OP是人体衰老过程中由增龄性氧化应激、雌激素减少引起免疫系统低度活化、产生大量炎性介质引起,这些因素可以激活NLRP3/caspase-1/GSDMD成骨细胞焦亡通路,通过干预该途径影响骨代谢防治OP。研究证实,固本增骨方能改善雌激素低下状态;降低大鼠骨髓中IL-1β的表达;调节OP大鼠肠道菌群结构及功能,通过培补脾肾、益气活血,多系统、多靶点防治OP。基于以上研究,固本增骨方能调控NLRP3/caspase-1/GSDMD成骨细胞焦亡通路,抑制成骨细胞焦亡减少炎性细胞因子的表达,达到防治OP的作用。

通过MAPK/ERK1/2信号通路探讨固本增骨方对MC3T3-E1成骨分化的影响

目的探讨固本增骨方含药血清对MC3T3-E1细胞增殖分化的影响及与MAPK/ERK1/2信号通路的关系。方法制备固本增骨方含药血清干预MC3T3-E1细胞,CCK-8法观察各组细胞增殖情况。ALP试剂盒、茜素红染色检测各组细胞成骨矿化能力。根据CCK-8检测、ALP活性检测与茜素红染色结果筛选最佳含药血清浓度及干预时间;将MC3T3-E1细胞分A、B、C、D 4组,分别加入空白血清、20%含药血清、空白血清+PD0325901、20%含药血清+PD0325901,采用RT-PCR检测各组细胞中ERK1/2、Runx2、BMP-2 mRNA表达水平,免疫印迹法Western blot检测各组细胞中ERK1/2、P-ERK1/2、Runx2、BMP-2蛋白表达水平。结果与空白对照组相比,10%、15%、20%、25%含药血清组均能促进MC3T3-E1细胞增殖能力,提高ALP活性,其中20%含药血清干预48 h效果最为显著(P<0.05);茜素红染色后镜下观察在浓度为20%时染色区域钙结节数量最为密集;与A组相比,B组ERK1/2、Runx2、BMP-2 mRNA及ERK1/2、P-ERK1/2、Runx2、BMP-2蛋白的表达水平明显增高(P<0.05);加入阻断剂PD0325901后,C组与D组上述指标的表达明显降低(P<0.05);与D组相比,C组ERK1/2、Runx2、BMP-2 mRNA及ERK1/2、P-ERK1/2、Runx2、BMP-2蛋白的表达水平更低(P<0.05)。结论固本增骨方含药血清能促进MC3T3-E1细胞的增殖及矿化,并上调成骨相关因子Runx2、BMP-2的表达,其作用机制可能与激活MAPK/ERK1/2通路有关。

固本增骨方含药血清对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

目的观察固本增骨方含药血清对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的作用并探讨其可能的作用机制。方法制备固本增骨方含药血清,将大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)分为空白血清组、5%、10%、20%、30%浓度含药血清组及传统诱导组,分别对各组大鼠BMSCs进行成骨诱导。4周后进行茜素红染色镜下观察各组红色钙结节数量,Western blotting法分析各组BGP、Runx2的蛋白相对表达量,Real-Time PCR检测各组中BGP、Runx2 mRNA的相对表达量。结果各组BMSCs成骨诱导分化后的形态变化各有特点,茜素红染色后镜下观察,红色钙结节数量随含药血清浓度增加而增加,并且浓度为20%时钙结节数量明显多于其他各组(P<0.01);BGP、Runx2的蛋白及mRNA相对表达量在20%浓度含药血清组达最高,且与其他各组比较差异均有统计学意义(P<0.01)。结论固本增骨方含药血清能通过BGP、Runx2的转录与表达促进大鼠BMSCs成骨分化,且在20%浓度为最佳。

基于BMP-Smad/RUNX2信号通路探讨固本增骨方含药血清对大鼠BMSCs增殖和成骨分化的影响

目的基于BMPs-Smad/RUNX2信号通路探讨固本增骨方含药血清对大鼠骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化的作用机制。方法制备固本增骨方含药血清;台盼蓝染色观察细胞生长情况;取P3代大鼠BMSCs分为空白血清组、5%、10%、20%、30%浓度含药血清组及传统诱导组,分别对各组大鼠BMSCs进行培养及成骨诱导,向6组加入相应培养液24 h后开始测量细胞计数,连续测量4天;成骨诱导2周后,进行碱性磷酸酶染色试剂盒说明书进行染色,光镜下观察各组细胞蓝紫色区域的密集程度;ELISA法检测COL-I、ALP、BGP、OPN蛋白的含量;Real-time PCR检测BMPs信号通路相关基因BMP2、BMP4、Smad1、RUNX2表达。结果各组固本增骨方含药血清组在培养24h后比空白组及传统成骨诱导组OD值比较差异均具有统计学意义(P<0.05),并且20%含药血清组较5%、10%及30%含药血清组OD值比较差异具有统计学意义(P<0.05);碱性磷酸酶染色后镜下观察在浓度为20%时染色区域最密集;5%、10%、20%含药血清组与其他各组BGP、OPN、ALP、COL-I含量比较差异具有统计学意义(P<0.05),且20%含药血清组与5%、10%含药血清组比较差异具有统计学意义(P<0.05);20%含药血清组与其他各组BMP2、BMP4、Smad1、RUNX2mRNA表达比较差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论固本增骨方能促进BMSCs的增殖,并且能促进成骨标志蛋白BGP、OPN、ALP、COL-I蛋白含量的增加,且在20%浓度为最佳,这个机制可能是激活了BMPSmad/RUNX2信号通路实现的。

固本增骨方联合认知干预与坐式八段锦治疗老年骨质疏松临床观察

目的研究分析老年骨质疏松治疗过程中应用固本增骨方、认知干预与坐式八段锦的效果。方法研究对象为南昌市洪都中医院2019年6月—2020年12月收治的60例老年骨质疏松患者,分2组对比临床治疗效果、骨密度水平、疼痛评分、自我效能、恐动症状。结果研究组患者临床治疗总有效率与对照组患者相比明显更高(P<0.05);治疗后3个月、6个月研究组骨密度水平明显高于对照组(P<0.05);治疗后研究组患者视觉模拟评分(VAS)、恐动症评分量表(TSK)评分明显低于对照组(P<0.05),且骨质疏松症自我效能表(OSES)评分明显高于对照组(P<0.05)。结论固本增骨方、认知干预与坐式八段锦能够有效提高治疗总有效率,提高患者骨密度水平,改善其疼痛症状与恐动症,提高患者自我效能。

固本增骨方治疗老年原发性骨质疏松的随机对照临床试验研究

目的观察固本增骨方治疗老年原发性骨质疏松的临床疗效。方法将确诊为老年原发性骨质疏松症的106例患者随机分为固本增骨方组(53例)和骨健康补充剂组(53例),骨健康补充剂组给予碳酸钙D3咀嚼片1片/次,1次/d;骨化三醇胶丸1粒/次,1次/d,1个月为1疗程,共治疗6个疗程,固本增骨方组在骨健康补充剂组治疗基础上,给予固本增骨方,每日1剂,水煎服,早晚各1次分服,1个月为1疗程,观察6个疗程后判定疗效,采用VAS评分、中医症候评分以及检测骨密度值进行疗效评价,并观察不良反应发生情况。结果治疗后固本增骨方组有效率为94.34%,明显高于阳性药物对照组的84.90%(P<0.05);治疗后,两组患者的VAS评分均较治疗前降低(P<0.05),固本增骨方组明显低于骨健康补充剂组(P<0.05);固本增骨方组和骨健康补充剂组治疗后骨密度值均较治疗前升高(P<0.05),治疗组高于骨健康补充剂组(P<0.05);治疗后两组患者的主要症状评分均较治疗前下降(P<0.05),固本增骨方组低于骨健康补充剂组(P<0.05);治疗后,固本增骨方组1例患者出现胃烧灼感;骨健康补充剂组出现2例恶心、纳差,1例患者出现皮肤过敏,停药后不良反应均自行消失,两组患者不良反应的差别无统计学意义(P>0.05)。结论固本增骨方治疗骨质疏松症患者安全有效,能够增加骨密度、缓解疼痛症状以及主要症状,是一种安全、有效、经济的治疗方法。

固本增骨方对去卵巢大鼠血清BGP、TRACP-5b及骨质量的影响

目的观察固本增骨方对去卵巢大鼠血清BGP、TRACP-5b及骨质量的影响,探讨固本增骨方防治绝经后骨质疏松症的作用机制。方法卵巢切除法建立大鼠骨质疏松模型,随机分为模型对照组、戊酸雌二醇组、固本增骨方高、中、低浓度组,选取同龄大鼠作为空白对照组。用药干预12周后,腹腔麻醉,采用双能X线骨密度测量仪计算大鼠全身骨密度;ELISA法检测大鼠血清骨生成代谢指标BGP及骨吸收代谢指标TRACP-5b;解剖分离左侧股骨标本,置于AG-X系列台式电子万能试验机,计算骨生物力学性能指标;激光共聚焦显微镜扫描各组股骨组织游离[Ca^[2+]]i浓度。结果与空白对照组相比,模型组大鼠全身骨密度值显著下降,股骨最大载荷和弹性模量明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。与空白对照组比较,模型组大鼠BGP、TRAP-5b含量明显升高(P<0.05);给予药物干预后,与模型组相比,戊酸雌二醇组和固本增骨方各组BGP、TRAP-5b含量均明显下降(P<0.05);且固本增骨方高浓度组优于低浓度组(P<0.05);与模型组对比,戊酸雌二醇组和固本增骨方不同浓度组可显著增加全身骨密度值,明显提高股骨最大载荷和弹性模量、[Ca^[2+]]i浓度,差异有统计学意义(P<0.05)。固本增骨方高浓度组与低浓度组比较有统计学差异(P<0.05),呈量效依赖关系。固本增骨方各组与戊酸雌二醇组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论固本增骨方可降低去卵巢大鼠模型血清BGP、TRAP-5b含量,改善全身骨密度,提升骨生物力学性能,增加骨组织中游离[Ca^[2+]]i浓度,从而发挥对绝经后骨质疏松症的防治作用。

固本增骨方对去卵巢大鼠血清骨钙素和NEI网络组织中游离[Ca^(2+)]i的影响

目的:观察固本增骨方对去卵巢大鼠下丘脑、垂体、脾脏、肾上腺和股骨组织中游离[Ca^(2+)]i的影响,探讨固本增骨方通过神经-内分泌-免疫网络防治骨质疏松的机制。方法:去卵巢法建立大鼠骨质疏松模型,随机分为模型对照组、戊酸雌二醇90μg/kg组、固本增骨方2.3、4.6、9.2g/kg组,选取同龄大鼠作为空白对照组,在第4、8、12、16周时各组随机抽取10只大鼠,心脏取血,酶联免疫吸附法检测血清骨钙素浓度;取下丘脑、垂体、脾脏、肾上腺和股骨组织,采用Calcium Crimson(TM)、AM荧光探针标记,激光共聚焦显微镜扫描各组织游离[Ca^(2+)]i浓度。结果:固本增骨方2.3、4.6、9.2g/kg为有效剂量,可显著提高血清骨钙素并调节神经-内分泌-免疫网络组织中游离[Ca^(2+)]i,呈现剂量依赖;与模型对照组相比,戊酸雌二醇90μg/kg组和固本增骨方2.3、4.6、9.2g/kg组血清骨钙素明显增高,垂体、脾脏、股骨组织[Ca^(2+)]i在各个时相点均增高,下丘脑组织从用药8w后开始增高,肾上腺组织[Ca^(2+)]i明显降低。结论:固本增骨方可提高血清骨钙素浓度,并改变下丘脑-垂体-肾上腺轴及骨骼组织中游离[Ca^(2+)]i,从而通过调控NEI网络起到防治骨质疏松的作用。

固本增骨方对去卵巢骨质疏松模型大鼠血清BALP及NEI网络组织中CaM、CaMKⅡ mRNA表达的影响

目的观察固本增骨方对去卵巢骨质疏松模型大鼠下丘脑、垂体、脾脏、肾上腺和股骨组织中钙调蛋白(CaM)mRNA、CaM依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMK)mRNA表达以及血清骨碱性磷酸酶(BALP)的影响,探讨固本增骨方通过神经-内分泌-免疫(NEI)网络调节防治骨质疏松的机制。方法采用双侧去卵巢法建立大鼠骨质疏松模型,随机分为模型对照组、戊酸雌二醇组、固本增骨方高、中、低浓度组,分别予以生理盐水、戊酸雌二醇、不同剂量(9.2、4.6、2.3g/kg)生药灌胃;选取同龄雌性大鼠作为空白对照组(仅灌胃生理盐水,不造模)。干预后,分别在第4、8、12、16周时各组随机抽取10只大鼠,心脏取血,ELISA法检测血清BALP含量,分别于动物模型成功后,灌胃干预4、8、12、16周后采用实时荧光定量-聚合酶链式反应(RT-PCR)检测下丘脑、垂体、肾上腺、脾脏、股骨组织中CaM、CaMKⅡmRNA表达。结果在干预的不同时相点,模型组大鼠血清BALP及NEI网络下丘脑、垂体、肾上腺、脾脏、股骨组织CaM、CaMKⅡmRNA表达与空白对照组差异有统计学意义(P<0.05)。与模型对照组相比,戊酸雌二醇组和固本增骨方组血清BALP质量浓度及下丘脑、垂体组织CaM mRNA表达升高(P<0.05),而肾上腺、脾脏、股骨组织CaM mRNA表达及下丘脑、垂体、肾上腺、脾脏、股骨组织CaMKⅡmRNA表达降低,差异有统计学意义(P<0.05);与戊酸雌二醇组相比较除固本增骨方低剂量组股骨和肾上腺组织中对CaM、CaMKⅡmRNA表达的调节作用稍差(P<0.05)外,戊酸雌二醇与固本增骨方各组在其余各组织对CaM、CaMKⅡ具有相同程度的调节作用。结论固本增骨方可提高去卵巢骨质疏松模型大鼠的血清BALP质量浓度,调节去卵巢骨质疏松模型大鼠NEI网络中CaM、CaMKⅡmRNA的表达,从而防治骨质疏松。

基于16S rDNA序列分析骨质疏松大鼠肠道菌群结构变化及固本增骨方的调控机制

目的:通过16S rDNA序列分析探讨骨质疏松模型大鼠肠道菌群结构的多样性特征及固本增骨方作用的靶点菌种。方法:将48只Wistar雌性大鼠,随机分为造模组(40只)和空白对照组(8只),造模组采用去卵巢法复制骨质疏松模型,造模成功后随即分为模型对照组、戊酸雌二醇组、固本增骨方(高、中、低剂量)组,每组8只。固本增骨方高、中、低剂量组给予固本增骨方(9.2、4.6、2.3g/kg)灌胃,空白对照组和模型对照组以等剂量0.9%氯化钠溶液灌胃,戊酸雌二醇组按90μg/kg给予戊酸雌二醇灌胃,16周后收集大鼠粪便,提取并检测粪菌总DNA,16sRNA扩增子测序,对标本中的细菌16S rRNA V3-V4进行定性分析、OUT分析、16S功能基因预测分析。结果:与空白对照组比较,模型对照组大鼠肠道菌群的多样性增加;与模型对照组比较,戊酸雌二醇组和固本增骨方高、中、低浓度组可调节厚壁菌门、螺旋菌门及Candiadatus Soleaferrea的相对丰度;固本增骨方高剂量组在翻译、细胞壁的生物合成、细胞运动、复制和修复、能源生产与转化等功能方面显著性增高。结论:卵巢切除大鼠诱导骨质疏松模型中,肠道微生态失衡可能为绝经后骨质疏松症的发病机制之一;固本增骨方对肠道菌群具有调节作用,通过"健脾补肾"之效应机制发挥对PMOP的防治作用。

固本增骨方联合高压氧疗对骨质疏松症模型大鼠骨代谢平衡的影响

目的探讨固本增骨方联合高压氧疗对骨质疏松症骨代谢平衡的影响及可能机制。方法50只雌性Wistar大鼠随机分为空白组、模型组、高压氧组、固本增骨方组、联合组,每组10只。除空白组外,其余各组大鼠采用去卵巢法建立骨质疏松症大鼠模型。造模成功后空白组、模型组、高压氧组大鼠给予30ml/kg生理盐水灌胃,固本增骨方组及联合组给予固本增骨方混悬液4.6g/(kg·d)灌胃,高压氧组、联合组大鼠每天灌胃后进行高压氧治疗。干预12周后检测大鼠血清骨代谢标志物[包括骨特异性碱性磷酸酶(BALP)、核结合因子α1(CBF-α1)、Ⅰ型胶原羧基末端肽(CTX-Ⅰ)、Ⅰ型前胶原氨基端前肽(PⅠNP)、骨钙素(OC)]含量变化;显微CT影像观察大鼠股骨骨密度水平及骨小梁微结构;检测大鼠下丘脑和股骨组织中骨保护素(OPG)、核因子κB受体活化因子配体(RANKL)蛋白和mRNA表达。结果与空白组比较,模型组大鼠骨密度及BALP、CBF-α1、CTX-Ⅰ、PⅠNP、OC含量、相对骨体积分数、骨小梁数量、骨小梁厚度、连接密度降低,骨小梁分离度、结构模型指数升高,下丘脑及股骨组织中OPG蛋白和mRNA表达下降、RANKL蛋白和mRNA表达升高(P<0.05)。与模型组比较,高压氧组、固本增骨方组和联合组大鼠各指标均显著改善(P<0.05);且固本增骨方组和联合组各指标改善优于高压氧组,联合组各指标改善优于固本增骨方组(P<0.01)。结论固本增骨方联合高压氧疗能够调节骨质疏松症模型大鼠骨代谢平衡,增加骨量,改善骨小梁微结构,其机制可能与调控OPG/RANKL信号通路有关。

固本增骨方对卵巢切除模型大鼠骨代谢和骨微结构的影响

目的观察固本增骨方对卵巢切除大鼠骨代谢和骨微结构的影响,探讨固本增骨方防治绝经后骨质疏松症的作用机制。方法采用卵巢切除法建立大鼠骨质疏松模型,随机分为模型对照组,戊酸雌二醇组,固本增骨方高、中、低剂量组,选取同龄大鼠作为空白对照组。用药干预12周后,腹腔麻醉,心脏采血,应用酶联免疫吸附法检测大鼠血清雌二醇(E2)、骨钙素(BGP)、Ⅰ型前胶原羧基端交联端肽(PICP)、Ⅰ型胶原吡啶交联终肽(ICTP)、抗酒石酸酸性磷酸酶-5b(TRAP-5b)水平;采用微型CT影像系统,对各组大鼠右侧股骨标本进行骨组织计量学分析。结果与空白对照组比较,模型对照组大鼠E2、骨特异性碱性磷酸酶(BALP)含量及相对骨体积分数(BV/TV)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁数量(Tb.N)、连接密度(Conn.D)均降低(P<0.05),BGP、ICTP、PICP、TRAP-5b及骨小梁分离度(Tb.Sp)、结构模型指数(SMI)明显升高(P<0.05);给予药物干预后,与模型对照组相比,戊酸雌二醇组和固本增骨方各组E2、BALP及BV/TV、Tb.Th、Tb.N、Conn.D均增高(P<0.05),BGP、ICTP、PICP、TRAP-5b水平及Tb.Sp、SMI均下降(P<0.05);且固本增骨方高剂量组优于固本增骨方低剂量组(P<0.05),呈量效依赖关系。结论固本增骨方可改善卵巢切除大鼠模型骨代谢及骨微结构,从而发挥绝经后骨质疏松症的防治作用。

固本增骨方联合钙剂辅助治疗脾肾亏虚型骨质疏松症椎体压缩性骨折46例临床观察

目的观察固本增骨方联合钙剂辅助治疗脾肾亏虚型骨质疏松症椎体压缩性骨折的临床疗效。方法将92例脾肾亏虚型骨质疏松症椎体压缩性骨折患者采用随机数字表法分为对照组和治疗组,各46例。2组均给予经皮椎体后凸成形术(PKP)治疗,对照组在PKP治疗的基础上给予骨化三醇软胶囊、碳酸钙D3片口服,治疗组在对照组治疗方法的基础上给予固本增骨方治疗。连续治疗6个月后比较2组的临床疗效、不良反应发生情况,以及治疗前后的视觉模拟评分法(VAS)评分,股骨颈、股骨粗隆骨密度(BMD)。结果对照组总有效率为76.09%,治疗组为91.31%,2组比较差异有统计学意义(P<0.05);治疗后2组VAS评分均明显降低,与同组治疗前比较差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01),且治疗组降低更明显,与对照组治疗后比较差异有统计学意义(P<0.05);治疗后2组股骨颈、股骨粗隆BMD均明显升高,与同组治疗前比较差异有统计学意义(P<0.05),且治疗组升高更明显,与对照组治疗后比较差异有统计学意义(P<0.05);对照组不良反应发生率为10.9%,治疗组为8.7%,2组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论固本增骨方联合钙剂辅助治疗脾肾亏虚型骨质疏松症椎体压缩性骨折临床疗效显著,可明显减轻患者疼痛、增加BMD、改善骨质量,且不良反应可控,值得临床推广应用。