豆科作物轮作与有机肥+功能微生物肥减投配施对设施菜田硝态氮累积、固氮基因和净收益的影响

为降低河北省设施蔬菜种植区土壤硝态氮盈余累积量,降低地下水硝酸盐污染风险,2018—2022年连续5年,在华北典型褐土区设施菜田中,采用田间小区试验和实验室分析试验相结合的方法,以分析豆科作物轮作与有机肥+功能微生物肥减投配施对设施菜田产量和土壤硝态氮累积的影响,试验设置对照(CK)、常规施肥(T1)、减量施肥+功能微生物(T2)、减量施肥+功能微生物+豆科作物(T3)共4个处理。结果表明:相比T1处理,T2和T3处理可使番茄产量增加5.3%和25.8%;T2处理下油菜产量增加3.0%;农户年净收益提高4.4%和34.4%。5年间T2、T3处理的氮肥表观利用率较T1处理,番茄季增幅为13.5%~17.0%、11.3%~18.1%;T2处理油菜季增幅9.3%~36.6%。实时荧光定量(qPCR)结果显示,T2和T3处理土壤根际土固氮功能基因nifH拷贝数相比T1处理显著提高了16.1%和58.9%;nifH基因拷贝数与作物产量呈显著正相关关系,二者之间的回归方程为y=0.000 2x+30 355(R=0.741 2)。T2和T3处理0~100 cm土体硝态氮周年平均累积量,相比T1处理降低了51.6%和58.3%;5个轮作周期后,与T1处理相比,T2和T3处理有效降低了0~100 cm土体中55.3%和71.0%的硝态氮累积。综上,在减量施肥的背景下,选择引入豆科作物进行合理优化轮作,与有机肥+功能微生物肥配施,可从源头上减少设施蔬菜的氮肥投入,降低设施菜田土壤硝态氮淋失风险,提高作物产量和肥料利用率。

甘蔗内生固氮菌Klebsiella variicola DX120E nifH基因的克隆与序列分析(英文)

【目的】了解甘蔗内生固氮菌变栖克雷伯氏菌（Klebsiella variicola）DX120E nif H基因的生物信息学,为揭示甘蔗内生固氮菌DX120E的固氮分子机理提供理论依据。【方法】根据NCBI上其他固氮菌株的nif H序列设计引物,对内生固氮菌Klebsiella variicola DX120E菌进行PCR扩增;运用生物信息学方法对其核苷酸序列、编码的氨基酸序列进行分析,并对其蛋白结构进行预测。【结果】甘蔗内生固氮菌Klebsiella variicola DX120E nif H基因的ORF为882bp,Gen Bank登录号为KF732646.1,与Klebsiella pneumoniae 342、Klebsiella variicola At-22等6种固氮菌的nif H基因氨基酸序列同源性高达95.0%-99.0%。DX120E nifH蛋白与Klebsiella pneumoniae 342的亲缘关系最近,与非克雷伯氏菌固氮菌的亲缘关系较远。生物信息学分析显示,菌株DX120E的nif H基因编码293个氨基酸,起特别重要的氨基酸残基非常保守。该基因在N端有11个氨基酸残基即酪氨酸—甘氨酸—赖氨酸—甘氨酸—甘氨酸—异亮氨酸—甘氨酸—赖氨酸—丝氨酸—苏氨酸—苏氨酸,其属于典型结合ATP的基序结构。nif H蛋白分子量为32.07k D,pI为4.92,为酸性蛋白;其具有2个ASN糖基化位点,1个CAMP磷酸化位点,6个CK2磷酸化位点,6个PKC磷酸化位点。疏水性预测显示该蛋白为亲水性蛋白,无信号肽。【结论】变栖克雷伯氏菌（Klebsiella variicola）DX120E nif H基因的推导氨基酸序列与克雷伯氏菌固氮菌属具有较高的同源性,该基因在甘蔗生物固氮过程中可能起重要作用。

氮肥对甘蔗叶片内生固氮菌nifH基因表达的影响

为了探究氮肥对甘蔗叶片内生固氮菌nifH基因表达的影响,从RNA和蛋白质水平,采用RT-PCR和Western blot等技术分析施氮和不施氮处理下3个甘蔗品种叶片中nifH基因表达的差异性及对固氮酶相对表达量的影响。结果表明,在大田生长的甘蔗,在施氮肥和对照处理的叶片内,都可检测到固氮菌nifH基因在基因水平和蛋白质水平的表达。施氮处理会抑制或降低叶片内固氮菌的nifH基因的表达,但有利于nifH在蛋白质水平的表达,3个甘蔗品种内生固氮菌nifH基因的相对表达量都是施氮处理下较高,尤其是甘蔗品种ROC22,处理与对照间达到了显著差异。

祁连山高寒草原碱性土壤固氮微生物数量及固氮基因(nifH)群落结构研究

对祁连山高寒草原碱性土壤可培养固氮菌数量、固氮基因(nifH)群落结构及其理化性质进行了研究.结果表明:固氮菌数量在土层0～40cm处于3.6×105～0.21×105 CFUs.g-1之间,除了海拔3 001m的土样AQ4外,其他3个土样固氮菌数量随着土壤深度的加深而减小.固氮菌数量与地下生物量呈显著正相关性,与有机碳、可溶有机氮、速效磷和速效钾呈正相关性,而与pH值和全盐呈负相关性.通过基因测序得到的37个固氮基因nifH克隆中,蓝藻门占41%,变形菌门占8%,厚壁菌门占14%,未知菌株占37%;蓝藻门在除了AQ4外的土样中普遍存在,并且是AQ1的优势固氮菌群.此外,还发现了4个新的nifH基因,分别是AQ1-12(KC412109)、AQ4-3(KC412133)、AQ4-4(KC412133)、AQ4-5(KC412133),其中后三者是土样AQ4的优势种群.

三江源高寒草甸土固氮基因(nifH)的多样性和系统发育研究

首次利用PCR_RFLP和测序分析对位于青藏高原腹地的青海三江源保护区高寒草甸土壤微生物固氮基因(nifH)的多样性和系统发育进行了探讨。在 2个样地中 ,共得到 14 3个阳性克隆 ,用限制性内切酶MspⅠ和RsaⅠ进行RFLP分析后得到 35个不同的RFLP谱带型 ,多样性为 2 4 . 5 % ,其中ZD样品中获得 82个阳性克隆和 2 1个不同的RFLP谱带型 ,多样性为 2 5 6 % ,而YS样品中获得 6 1个阳性克隆和 19个不同的RFLP谱带型 ,多样性为 31 1% ,2个样地中有 5个相同的RFLP谱带型。在各样地都发现一个明显的优势种群 ,ZD样地的明显优势种群占克隆数的2 9 3% ,YS的优势种群占克隆数的 32 .8%。对 2 1个克隆进行了部分序列的测定 ,序列的相似性在 71%～ 98%之间 ,在GenBank数据库中没有发现完全匹配的序列 ,因此这些序列可能代表着新的固氮生物株系。最后利用ClustalW与Mega软件和已有序列构建了系统发育树 ,结果发现 ,2 1个序列分为 4个不同的簇 ,大部分的克隆与Proteobac teria的 3个系统发育亚簇 (α、β和γ)具有较高的相似性 ,其中主要的序列都落在第一和第二簇内。YS样地中的优势种群与α_Proteobacteria中的Rhodobactersphaeroides具有较高的相似性 ,而ZD样地中的优势种群则与 β_Proteobac

耐除草剂转基因大豆对根际土壤固氮微生物nifH基因多样性的影响

通过大田试验,以两种耐除草剂转基因大豆(PAT、ALS)及相应非转基因亲本大豆(PAT1、ALS1)和当地主栽大豆中黄13(CK)为材料,采用聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)技术及扩增产物序列分析方法,探讨耐除草剂转基因大豆种植对根际土壤固氮微生物nifH基因多样性的影响。结果表明,PAT、ALS与相应亲本大豆PAT1、ALS1相比,根际土壤固氮微生物群落组成相似度均在60%左右。PAT、ALS根际土壤固氮微生物nifH基因多样性指数(H)和均匀度指数(EH)与相应亲本大豆相比差异均不显著(p>0.05)。测序结果表明,PAT、ALS与相应亲本大豆根际土壤中固氮微生物主要隶属于蓝藻门(Cyanobacteria)、变形菌门(Proteobacteria)和厚壁菌门(Firmicutes)。不同处理下nifH基因与理化因子的典范对应分析结果表明,速效磷(AP)、硝态氮(NO3--N)对固氮微生物区系的影响达到显著水平(p<0.05)。以上结论表明,与PAT1、ALS1相比,两种耐除草剂转基因大豆对根际土壤固氮微生物nifH基因多样性的影响不显著。

沙冬青根瘤菌固氮酶基因nifH PCR-RFLP分析

利用固氮基因nifH PCR扩增，nifH PCR-RFLP及扩增产物序列分析方法对分离自宁夏和内蒙古部分地区的沙冬青根瘤菌代表菌株的nifH进行了遗传多样性和系统发育分析。结果表明，在80％相似水平上42株根瘤菌nifH PCR-RFLP基因图谱中有5个基因型聚类群。对不同基因型代表菌株的nifH PCR产物进行序列测定和系统发育关系分析，测试菌株在系统发育地位上与中慢生根瘤菌和中华根瘤菌相近，测试菌株与温带中慢生根瘤菌（Mesorhizobium temperatum isolate HAMBI 2583）序列相似性范围为95．6％-96．9％，与草木樨中华根瘤菌（Sinorhizobium meliloti strain CCBAU10062）基因序列相似性范围为99．8％-100％，基因序列同源性较高。本研究中nifH基因所揭示的沙冬青根瘤菌遗传多样性和系统发育关系说明沙冬青根瘤菌受染色体基因背景、地理环境以及菌株个体的进化而存在一定的差异。

氮对巨菌草内生固氮菌Klebsiella variicola GN02 nifH基因表达的影响

采用DNA电泳、qRT-PCR及Western blot技术分析了在无氮和含氮培养条件下,巨菌草内生固氮菌Klebsiella variicola GN02菌株nifH基因序列长度、基因与蛋白表达量的差异.结果表明,GN02菌株在无氮及含氮条件下均有nifH基因表达,其克隆得到的nifH基因与同属禾本科的甘蔗的nifH基因亲缘关系较近;无氮培养条件下nifH基因和蛋白表达量明显高于含氮条件下的表达量.表明无氮条件能诱导GN02菌株nifH基因表达量的增加,而氮源抑制nifH基因的表达.

巨菌草内生固氮菌Klebsiella variicola GN02 nifH基因的克隆及生物信息学分析

研究巨菌草(Pennisetum giganteum)内生固氮菌Klebsiella variicola GN02 nifH基因的生物学信息,对GN02菌株nifH基因进行克隆及完整性验证,并采用多种生物学在线软件对其进行生物信息学预测和分析。结果表明,GN02菌株nifH基因具有完整的ORF,长度882 bp,编码293个氨基酸,NCBI GenBank登录号为MK131264。生物信息学分析表明,GN02菌株nifH基因具有高度保守性,与其他物种来源的nifH基因核苷酸序列及氨基酸序列同源性均达到95%以上。nifH蛋白总相对分子量为31 970.73、理论等电点pI为4.72;跨膜模型倾向N-末端向外的由内到外的跨膜、整个多肽链表现为亲水性;有2个糖基化位点但无分泌信号肽,有可能存在螺旋卷曲结构;二级结构预测表明α-螺旋和无规则卷曲是其多肽链中的主要结构元件,延伸链散布于整个蛋白质中;在数据库中能对该蛋白进行三维同源建模。

固氮基因nifHDK启动子的功能在大肠杆菌中的验证

近年来,在对肺炎克氏杆菌(Klebsiella pneumoniae)nifA产物研究的基础上已建立了固氮基因调控的模型。固氮基因(nif)的表达受氮调节系统ntr和nifAL操纵子的两个系统的调控。本实验将固氮基因nifHDK启动子、aphA-6基因和rbcL3'构建aphA-6基因表达盒,克隆到pSK.KmR载体,将其转入到大肠杆菌中验证nifHDK启动子的表达活性。结果表明,只有在转入外源nifA基因时,nifHDK启动子才具有转录活性,aphA-6基因才能表达。验证了NifA蛋白和σ54因子是固氮基因的正向调节蛋白,为下一步固氮生物工程研究提供了理论基础。

发菜固氮酶nifH基因克隆及其干旱胁迫下的差异表达

通过对发菜固氮酶H亚基基因(nifH)全长进行克隆、原核表达和生物信息学分析,采用qRT-PCR技术,分析不同干旱胁迫下发菜固氮酶基因nifH在转录水平的表达变化。结果表明,根据特异性引物克隆获得长度为894bp的nifH,GenBank登陆号为BankIt1901364(KU886163)。将nifH在大肠杆菌中表达,获得约36ku的外源蛋白。生物信息学分析表明,发菜nifH与已报道的多种蓝藻的nifH及推导的氨基酸序列具有较高的相似性,nifH二级结构和三级结构主要由α螺旋、β-折叠、随机卷曲和β-转角构成。随藻体含水量的逐渐降低,发菜nifH在转录水平上的表达量逐渐增加,固氮酶活性呈现先增加后下降的趋势。研究结果为进一步研究发菜固氮酶基因的分子结构和发菜响应干旱胁迫的固氮机制及氮代谢过程奠定基础。

2株青贮玉米根际固氮菌的筛选鉴定及促生作用研究

为了获得优良的固氮菌,并评价其对青贮玉米的促生效果,本研究采用稀释涂布平板法,利用阿须贝氏固体培养基从青贮玉米根际土壤中分离筛选到10株固氮菌,对其固氮能力进行分析,结果表明,菌株ZL-2和ZL^(-1)3的固氮能力较强,菌株ZL-2的固氮量为1.07μg·mL^(-1),ZL^(-1)3的固氮量为0.95μg·mL^(-1)。通过细菌形态学、16S rDNA序列分析和生理生化特征,确定菌株ZL-2为生癌肠杆菌和ZL^(-1)3为成团泛菌。对2株固氮菌的促生特性进行分析,结果表明,2个菌株具有泌铵能力、溶磷能力、产嗜铁素能力和合成吲哚-3-乙酸(IAA)的能力。盆栽试验结果表明,接种固氮菌ZL-2和ZL^(-1)3能够显著提高青贮玉米的株高、根长、地上和地下干、鲜重(P<0.05)。田间试验结果表明,2株固氮菌单接种和双接种均能提高青贮玉米的株高、茎粗、产量、粗蛋白含量和全磷含量(P<0.05)。接种2株固氮菌的青贮玉米,其氮代谢和氨同化相关基因(ZmAMT-4、ZmAMTB、ZmGOGAT2和ZmGS1-3)的表达量显著提高(P<0.05)。因此,2株固氮菌具有较好的促生特性,在提高青贮玉米的产量和品质方面发挥了重要作用,是开发微生物菌剂的优质菌种资源。

硫酸黏菌素残留对土壤固氮微生物nifH基因多样性的影响

为了探讨硫酸黏菌素残留对土壤固氮微生物nifH基因多样性的影响,在土壤中添加0、0.5、5.0、50.0mg/kg质量浓度的硫酸黏菌素,分别于7、21、35、49d时采集土壤样品,提取土壤总DNA,采用末端限制性片段长度多样性分析技术对土壤固氮微生物nifH基因进行多样性分析。结果表明,添加硫酸黏菌素处理的nifH基因分类操作单元数均比不添加硫酸黏菌素处理的少。硫酸黏菌素影响土壤固氮微生物nifH基因的多样性,使土壤固氮微生物的丰富度和均匀度降低。主成分分析发现,21d时,硫酸黏菌素对土壤微生物群落结构改变的影响最大,随着时间的延长,硫酸黏菌素对土壤固氮微生物群落结构多样性的影响有所减弱。

芦竹属菌草内生固氮菌nifH基因的表达研究

【目的】检测5种芦竹属菌草绿洲成熟期根样本内生固氮菌的丰度及nifH基因的表达,为nifH基因的快速定量检测及实时监测提供技术手段。【方法】采用实时荧光定量PCR技术(Real-time quantitative reverse transcription PCR,qRT-PCR)分析根样本内生固氮菌nifH基因的拷贝数及相对表达量。【结果】5种芦竹属菌草成熟期根样本内生固氮菌nifH基因表达量及拷贝数均有较大的差异。其中,绿洲2号nifH基因相对表达量最高,呈过表达水平,且绿洲2号样本差异达显著水平(P<0.05),其余各样本差异不显著;固氮基因nifH的拷贝数呈逐步递减,其中绿洲1号样本nifH基因的拷贝数最高,达8.84×10^(11)/g;绿洲5号最低,达1.54×10^(11)/g,各样本的差异均达到显著水平。【结论】基于实时荧光定量PCR对固氮基因nifH的定量及定性分析,可为nifH基因的定量检测及表达情况提供理论依据。

种植转Bt水稻对固氮细菌多样性和固氮酶铁蛋白基因nifH的水平转移的影响(英文)

通过对具有不同种植年限和不同种植强度的转Bt基因水稻与非转Bt基因水稻土壤中的细菌以及固氮细菌群落结构进行研究,发现转Bt水稻的种植可能会影响土壤中微生物群落的多样性,但是这种影响的可能只是暂时的,通过对测量种植水稻的芽长实验也得出相似的结论.另外,根据16S rDNA基因构建的系统发育进化树揭示了本实验分离的固氮细菌的遗传多样性,发现实验土壤中的固氮细菌主要分为放线菌门(Actinobacteria)(92%)和α-变形菌门(α-Pro-teobacteria)两大类.分离出的8株典型的固氮菌株,其16S rDNA基因和固氮基因nifH的序列两者的分布不一致,nifH的分布更为紧凑,为固氮基因可能发生了原位水平基因转移提供了证据.

新型氮肥对玉米根际土壤固氮微生物群落的影响

为探究长期施用新型氮肥对玉米连作体系根际土壤固氮微生物(nifH基因)群落的影响,采集长期定位试验(2014年始)玉米吐丝期根际土壤样品,以不施氮肥(N0)为对照,分析同常规尿素(CU)相比,3种新型氮肥[控释尿素(SU)、稳定性肥料(SF)、硫包衣尿素(SCU)]的施用对土壤固氮微生物群落的影响差异。结果表明:不施氮肥处理的固氮微生物nifH基因丰度高于施氮肥处理,不同氮肥处理中,稳定性肥料处理的固氮微生物nifH基因丰度(3.4×10^(6)copies·g^(-1))显著低于其他处理,pH(相对影响值为44.51%)和有机质(相对影响值为35.01%)是影响固氮微生物nifH基因丰度的主要因素。与不施氮肥相比,氮肥施用降低了固氮微生物nifH基因的丰富度及多样性,与常规尿素处理相比,新型氮肥提高了nifH基因的丰富度指数但降低了多样性指数。固氮微生物nifH基因属水平主导物种为Desulfovibrio(相对丰度为14.11%~33.39%)、Stenotrophomonas(相对丰度为2.66%~17.72%)和Bradyrhizobium(相对丰度为2.68%~6.32%)。是否施氮对土壤固氮微生物群落结构的变化有显著影响(P=0.001),但施用不同新型氮肥处理与常规尿素相比对群落结构变化无显著影响(P=0.1)。研究表明,施用新型氮肥提高了固氮微生物nifH基因丰富度,改变了固氮微生物的群落结构。

巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)Yu62的质粒及nifHDK基因的定位

对从北京郊区玉米根际分离到的巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)Yu62的质粒进行了分离和检测,发现检测方法不同,得到的质粒数目也不同,用 Kado 法只发现一个大质粒,以 pABm 1表示,其分子量约为120 Md;而用改良的 Eckhardt 方法,则发现有5个大质粒,分别以 pABm 1、pABm 2、pABm 3、pABm 4和 pABm 5表示,它们的分子量分别约为120 Md、330 Md、360 Md、480 Md 和900 Md,都是巨型质粒,用多种方法检测均未发现小质粒。应用生物素标记的核酸杂交技术制备了 Biotin-nifHDK 探针,并对 Yu62菌株的质粒及染色体片段进行了 Southern 印迹杂交和斑点杂交,杂交结果表明 nifHDK 基因定位于染色体上。

盐度对水稻土壤固氮微生物nifH基因多样性的影响

[目的]研究盐浓度对水稻土壤固氮微生物nifH基因多样性的影响。[方法]在不同盐浓度的土壤区域采集样品,提取土壤总DNA,采用末端限制性片段长度多样性分析技术(T-RFLP)对土壤固氮微生物nifH基因进行多样性分析。[结果]随着水稻土壤盐度上升,土壤有机质、全氮和碱解氮含量也呈现一定程度的上升趋势;水稻土壤nifH基因的分类操作单元(OTU)总数在土壤盐度最高时达最大值,各组优势细菌数量在2.5种左右,样本丰度主要集中在4个片段内,各组相对丰度差异不显著(P>0.05);水稻组土壤与富贵竹土壤相比,多样性和均匀度均差异显著(P<0.05),水稻各组间微生物多样性呈现盐度依赖效应,但差异不显著(P>0.05)。[结论]土壤盐度影响土壤性质及固氮微生物,微生物多样性呈现一定盐度依赖效应。

PGPR菌剂对攀西高原植烟土壤nifH基因群落的影响

为研究植物根际促生菌(PGPR)菌剂处理下攀西高原植烟土壤氮素循环的微生物调控机制,本研究以凉山州会理市不同PGPR菌剂(Lysinibacillus sp.、Streptomyces Phaeochromogenes和Aspergillus niger)处理下的植烟田为研究对象,采集烤烟成熟期根际土壤,通过化学分析和高通量测序技术对土壤理化性质、固氮酶活性及nifH基因群落组成及多样性进行分析。结果表明,与常规施肥相比,施用PGPR菌剂会显著降低植烟土壤的pH值,同时显著提高有效磷含量和固氮酶活性(P<0.05)。总体而言,施用PGPR菌剂提高了植烟土壤nifH基因群落的多样性。植烟土壤优势菌群为变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)和蓝菌门(Cyanobacteria)。慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)、地杆菌属(Geobacter)和固氮螺菌属(Azospirillum)等是植烟土壤优势属。冗余分析结果表明,植烟土壤pH值、碱解氮和速效钾含量与nifH基因群落结构相关性最强。综上,PGPR菌剂能改善植烟土壤养分状况,提高土壤固氮酶活性,影响植烟根际土壤nifH基因群落组成及多样性,其中以细菌PGPR菌剂Lysinibacillus sp.效果最佳。本研究结果为植烟土壤科学施肥、培肥地力提供了理论依据。

荒漠植物柠条根际土壤nifH基因荧光定量及固氮菌多样性分析

探索荒漠固沙植物根际土壤nif H基因丰度信息和固氮菌群落结构组成和多样性,可为丰富荒漠区微生物资源库提供基础资料。通过实时荧光定量PCR和高通量测序方法,分析了宁夏荒漠区5个柠条林地根际土壤nif H基因丰度和固氮菌群落结构组成,并结合分离培养方法对柠条根际固氮菌进行筛选和多样性研究。结果表明,5个柠条群落根际土壤nif H基因的拷贝数存在较大的差异,罗山林地(LS)nif H基因拷贝数最高,沙坡头林地(SPT)最低。柠条根际土壤共检测到固氮菌7门12纲26科30属。在科属水平上,沙坡头林地固氮菌群落组成差异较大,未分类的变形杆菌和叶杆菌科分别占25.54%和22.77%,红螺菌科占17.43%,中慢生根瘤菌属是其优势属,相对丰度为22.77%;其余4个林地均以红螺菌科、斯科曼氏球菌属为优势类群,相对丰度分别为23.71%-73.45%和23.19%-71.14%,在罗山林地中占比最高。分离出的固氮菌隶属于15个属,除常见的假单胞菌属、根瘤菌属和肠杆菌属等固氮类群外,还包括勒克氏菌属、金黄杆菌属和寡养单胞菌属等,多样性十分丰富。