田菁茎瘤固氮根瘤菌对小麦种子侵染的促生作用及其在根系内的定殖

选取8个常见小麦品种,通过室内限菌试验筛选出对于田菁茎瘤固氮根瘤菌Azorhizobium caulinodans ORS571(A.caulinodans)侵染响应敏感的品种,研究了浸种侵染、菌液浓度和添加葡萄糖对接菌小麦幼苗生长的影响,并结合荧光显微镜检测绿色荧光蛋白(GFP)标记A.caulinodans在小麦幼苗根系内的分布与定殖规律。结果表明:小偃22为响应敏感品种;在室内限菌条件下,浸种侵染小偃22幼苗平均根长和平均株高分别较对照增加了17.04%和8.37%;最适菌液浓度为1.0×108个/mL;在菌液中添加1 g/L葡萄糖有助于A.caulinodans浸种侵染和定殖。荧光显微镜检测结果显示,GFP标记A.caulinodans从小麦幼苗根毛和侧根裂隙处进入,定殖于根维管组织等部位。田间试验结果进一步表明A.caulinodans浸种侵染对不同小麦品种均具较明显的促生作用。

茎瘤固氮根瘤菌Azorhizobium caulinodans ORS571基因组分泌蛋白的生物信息学分析

为了获取茎瘤固氮根瘤菌(Azorhizobium caulinodans ORS571)的分泌蛋白,以便更深入地了解该菌的共生固氮作用,本研究采用SignalP、TMHMM、PSORTb、TargetP、LipoP、TatP和SecretomeP软件对该菌全部4717个蛋白序列进行分析预测。结果共识别了653个分泌蛋白,其中具有分泌型信号肽的蛋白54个,具有RR-motif型信号肽的蛋白1个,具有脂蛋白信号肽的蛋白2个和非经典分泌蛋白596个。该菌含信号肽分泌蛋白仅占全部蛋白的1.2%,低于其它固氮菌。在分泌蛋白中识别了核酸内切酶和核糖核酸酶等6个核酸酶。它们可能参与宿主植物遗传物质的降解,干扰宿主遗传代谢,进一步在宿主植物侵染过程中起到重要作用。此外还识别了超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽S-转移酶等4个抗氧化酶。它们可能参与活性氧的清除以保护固氮酶,是该菌固氮过程的重要参与者。

固氮根瘤菌的生理特性及对非豆科作物的拌种效果

固氮根瘤菌（ＡｚｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍｃａｕｌｉｎｏｄａｎｓＯＲＳ５７１）不但能在毛萼田菁（Ｓｅｓｂａｎｉａｒｏｓｔｒａｔａ）上结出根瘤和茎瘤进行共生固氮，而且具有屏氧功能可进行自生固氮，该菌生长过程分泌一定量的植物激素可刺激作物生长。将该菌制成菌种剂拌种小麦、水稻、玉米、马铃薯进行小区对比试验和大田示范。三年的结果表明，供试作物的经济性状得到不同程度的改善，比对照获得明显的增产增收效果。

盐豆木固氮根瘤内ATP酶的定位研究

对盐豆木根瘤进行了ＡＴＰ酶的电镜细胞化学研究．结果表明，ＡＴＰ水解酶的磷酸铅沉淀分布于宿主细胞质、胞间隙间及拟菌体周膜和液泡膜上．在宿主细胞中，正在发育液泡的膜上有高的ＡＴＰ水解酶活性．质体中ＡＴＰ酶的磷酸铅沉淀也较多．拟菌体内ＡＴＰ水解酶活性随拟菌体发育阶段的不同而异，幼壮龄拟菌体内ＡＴＰ水解酶磷酸铅沉淀较少，而在衰老拟菌体内则较多．这种动态变化，可能与拟菌体发育不同阶段的固氮活性有关．

田菁茎瘤固氮根瘤菌在小麦体内的定殖及营养元素相关miRNA的表达

【目的】随着化肥过度使用引起的环境问题的出现,无公害农业的推广,以及新型肥料研究领域不断拓宽,微生物肥料,尤其是植物根际促生菌的研究成为近年来的热点。然而微生物肥料的增产机理还基本停留在作物农学性状的表观调查上,没有从分子水平进行研究。因此,本文用田菁茎瘤固氮根瘤菌(Azorhizobium caulinodans ORS571)侵染小麦,探索GFP-A.caulinodans在小麦幼苗组织中的分布与定殖规律以及营养元素相关miRNAs在小麦与A.caulinodans互作中的作用机制。【方法】使用A.caulinodans侵染小麦种子(品种为小偃22),将接菌6 d后的小麦幼苗的根和接菌12 d后的叶制作玻片,利用激光共聚焦显微镜对样品进行逐层扫描,检测GFP-A.caulinodans在幼苗不同组织中的分布与定殖情况。同时,采集接菌后0 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、96 h的小麦幼根取样,用Trizol法提取总RNA。利用试剂盒进行加尾和反转录反应,将样品总RNA中的miRNA合成为cDNA,使用β-tubulin作为内参基因,进行实时定量PCR反应,使用2-ΔΔCT方法计算相对表达量。利用psRNATarget在线软件,采用默认参数,对miRNA的靶基因进行预测。【结果】1)激光共聚焦结果显示,GFP-A.caulinodans可定殖于根的表皮细胞、细胞间隙、根尖破损处和根毛,在根维管组织和叶片气孔部位,也发现有GFP-A.caulinodans存在。2)实时定量PCR分析结果表明,6条与营养元素代谢有关的miRNA表达发生变化,其中miR164、miR167和miR827相对表达量呈现出先上调后下调的趋势,miR169和miR398相对表达量也基本呈现出这一趋势。miR164、miR167、miR169和miR398的相对表达量在接菌12 h时上调至最高点,分别为对照的4.13、2.84、2.46和3.99倍;miR827相对表达量在接菌24 h时达到最高点,为对照的2.17倍。miR399相对表达量呈现出先下调后上调的趋势,在接菌24 h时降至最低点,为对照的0.21倍。3)通过靶基因预测,6条miRNA的靶基因分别编码了NAC1转录因子、生长素响应因子、HAP转录因子、Cu/Zn超氧化物歧化酶、蛋白缀合酶PHO2和SPX-MFS亚家族蛋白。【结论】GFP-A.caulinodans能够从根毛和根尖破损处等部位进入小麦幼苗根部定殖,并可通过向上迁移到达叶片,在气孔处定殖。接种A.caulinodans可不同程度增加小麦根中响应氮素、磷素、微量元素的miRNAs相对表达量,增强小麦幼苗对营养元素的吸收和利用,促进小麦根的形态建成。

花生固氮根瘤菌应用研究

应用花生固氮根瘤菌 ,通过拌种方法在花生种子中接种 ,种植在未种过花生的花岗岩发育的壤土中 ,进行固氮效果测定。结果表明 ,施用的花生固氮根瘤菌明显增加了花生的结瘤量 ,植株生长健壮 ,群体生长旺盛 ,增加植株生物量 ,结荚率提高 1 1 % ,植株含氮量提高 5 2 .9% ,籽仁含氮量提高 5 2 .8% ,产量提高 40 % 。

氮磷钾对红花草固氮根瘤菌生长及种植后土壤肥力的影响

为了发展有机水稻,以红花草-有机水稻轮作培肥水田土壤肥力,研究氮、磷、钾对红花草固氮根瘤菌生长及种植后土壤肥力的影响,为红花草的合理种植、培肥地力提供依据。2012—2013 2年稻后茬种植红花草,过冬前分别单独施用不同用量的氮肥、磷肥、钾肥,以不施肥为对照,探讨不同肥料不同用量对红花草产草量、固氮根瘤菌数量、固氮根瘤菌重量的影响及种植后的土壤肥力变化状况。研究结果表明:红花草前期补施氮、磷、钾,氮素对红花草的影响较大,在施氮75 kg/hm^2(N 46%)时,产草量最高,固氮根瘤菌数量最多,固氮根瘤菌重量大;种植后土壤全氮变化表现为不同施氮量增幅随肥料用量增加而增加,施磷、施钾各处理增幅随肥料用量增加而先降后升;土壤速效磷变化为施氮、施磷各处理增幅随肥料用量增加而增加,施钾各处理增幅趋势表现不明显;土壤速效钾变化表现为施氮、施磷各处理增幅变化趋势是随肥料用量增加先升后降,在施氮150 kg/hm^2(N 46%)、施磷300 kg/hm^2(P_2O_512%)时,土壤速效钾增幅达最大;土壤有机质变化表现为增幅随肥料用量增加而增加。所以,种植红花草,前期适当补施氮、磷、钾,可以提高红花草产草量,有效提高土壤肥力。

田菁茎瘤固氮根瘤菌对小麦叶组织的促生作用研究

利用GFP标记的田菁茎瘤固氮根瘤菌（Azorhizobium caulinodans ORS 571）侵染露白24h的小麦种子,分别在侵染后0、6、12、24、48、72和96h采样,利用实时荧光定量PCR方法检测小麦体内6条与促生作用相关miRNAs（miR156、miR159、miR160、miR167、miR168和miR403）的表达模式,检测其中3条miRNAs（miR159、miR167和miR168）的靶基因表达模式;以接菌8d的小麦样品做切片,利用激光共聚焦显微镜检测小麦叶部田菁茎瘤固氮根瘤菌的分布,并测定小麦的生理指标。结果显示：（1）田菁茎瘤固氮根瘤菌侵染小麦后能够在叶片边缘部位定殖。（2）小麦叶片中与促生作用相关的6条miRNAs出现了不同程度变化,在12~24h到达其峰值,随后逐渐下降,其中miR159在峰值时的表达量为初始表达量的2.88倍。（3）3条miRNAs的靶基因表达模式与相应miRNA表达模式相对应,但并不严格。（4）生理指标测定结果显示,接种田菁茎瘤固氮根瘤菌对小麦叶片产生明显的促生作用,其中叶鲜重在96h的变化与对照差异极显著。研究表明,接种的田菁茎瘤固氮根瘤菌能够到达小麦叶组织,对小麦叶片的生长产生明显的促生作用,其中miRNAs在促生过程中发挥重要作用。

田菁茎瘤固氮根瘤菌对穿心莲植株生长和有效成分含量的影响

目的:研究田菁茎瘤固氮根瘤菌对不施肥条件下穿心莲植株生长及其有效成分含量的影响。方法:用对数期的田菁茎瘤固氮根瘤菌菌液浇灌萌发结束的穿心莲幼苗,对照组用无菌水代替;第100天,对开花株数进行计数;测量其株高、叶片数、分枝数;采收穿心莲植株,测量其根长、地上部分和地下部分的鲜重和干重,每个处理组分为根、茎、叶和地上部分,测定其有效成分(穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯)含量。结果:田菁茎瘤固氮根瘤菌处理后,10~7个/mL浓度处理组对穿心莲植株生长和有效成分积累的促进效果最明显;该处理组开花株数是对照组的3.5倍;株高、分枝数、叶片数分别较对照组提高13.40%、16.75%、57.73%;地上部分鲜重、地上部分干重分别较对照组提高60.80%、67.08%;地下部分鲜重、地下部分干重分别较对照组提高24.40%、14.75%;地上部分穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯的总量较对照组提高16.16%。结论:田菁茎瘤固氮根瘤菌处理可促进穿心莲植株的生长并提高穿心莲有效成分含量。

固氮根瘤菌ORS571泌铵型突变株的筛选和接种盆栽小麦试验

以固氮根瘤菌ORS571为出发菌株,经过亚硝基胍(NTG)诱变,以对乙二胺的抗性为初筛指标,得到一株编号Ac-92的抗乙二胺的泌铵效果较高的突变株。由于向胞外分泌铵,该突变株在培养基上菌落非常小,而且不如原始菌株光滑。其固氮酶活性是原始菌株的1/5,在无氮半固体培养基上培养5和7d时其在培养基中的泌铵量分别为3.131和3.917mmol/L。经过15N同位素稀释法盆栽植物试验,与对照相比,该突变株由于存在其他缺陷,不能给植物提供更多的氮素营养。

茎瘤固氮根瘤菌（Azorhizobium caulinodans）ORS 571产生的植物激素

茎瘤固氮根瘤菌（Ａｚｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍｃａｕｌｉｎｏｄａｎｓ）ＯＲＳ５７１菌株在离体培养条件下，能利用色氨酸合成吲哚乙酸（ＩＡＡ）。随着菌龄的老化，合成的ＩＡＡ量也增加。除ＩＡＡ外，该菌株还产生类ＧＡ物质。本研究未检出细胞分裂素（Ｃｙｔｏｋｉｎｉｎ）类物质。

茎瘤固氮根瘤菌ORS571受体TlpA1对琥珀酸的感应机理

趋化作用在根瘤菌与宿主建立共生关系的起始阶段起着至关重要的作用。TlpA1是茎瘤固氮根瘤菌ORS571重要的跨膜趋化受体,但其感应机理尚未清楚。考察茎瘤固氮根瘤菌ORS571跨膜趋化受体TlpA1对趋化物的感应机理及生物学功能。通过平末端连接的方法构建N端表达菌株进行原核表达蛋白及纯化,利用等温滴定量热法(isothermal titration calorimetry)检测蛋白与趋化物的相互作用,测定野生型与突变株的生物膜及絮凝等表型。结果显示,跨膜趋化受体TlpA1通过胞外部分第29~183位氨基酸与琥珀酸结合。固氮条件下,突变株ΔTlpA1生物膜形成量相较于野生型下降约38%。絮凝量与野生型无显著性差异。跨膜趋化受体TlpA1通过感应琥珀酸调控茎瘤固氮根瘤菌ORS571生物膜的形成,对细胞絮凝无调控作用。

化肥有机替代对连作花生产量和根瘤固氮的影响

为了探究蚓粪和生物有机肥部分替代化肥对连作花生产量和氮素吸收固定的影响,通过花生两年连作定位试验,设置蚓粪替代化肥处理(VM)、生物有机肥替代化肥处理(BF)、单施化肥处理(CF)3个施肥处理,另设不施肥处理(CK)作为对照,研究化肥有机替代对花生产量和氮素吸收利用的影响。结果表明,VM处理可以提高花生收获指数和植株干物质积累,VM、BF处理的花生产量较CK分别提高63.18%、33.51%。CF处理显著降低了根瘤数和根瘤鲜质量,降幅分别为18.78%~50.82%和24.29%~34.74%,BF和VM处理较CF处理根瘤数、根瘤鲜质量分别提高53.20%和69.56%、63.90%和66.31%。BF和VM的根瘤固氮酶活性分别是CK的1.16倍和1.20倍,是CF的1.15倍和1.19倍。施肥处理的花生籽粒、叶、茎、根的氮素含量和氮素积累量均高于CK,其中,VM处理最高,BF处理次之。花生氮素分配比率表现为籽粒大于叶、茎、根。VM提高了根瘤固氮酶潜力和氮素向籽粒分配比率的同时降低了氮素向根的分配比率,而CF结果相反。VM的氮肥农学效率分别是BF和CF处理的1.85倍和5.08倍。VM(5.02 kg·kg^(-1))和BF(4.11 kg·kg^(-1))的氮肥偏生产力显著高于CF(3.43 kg·kg^(-1))和CK(3.08 kg·kg^(-1)),与CF和BF相比,VM表现出了更强的氮素吸收利用能力。综合来看,蚓粪替代化肥后增强了花生光合同化产物转化为经济产品的能力,表现出较强的产量优势。单施化肥表现出明显的“氮阻遏”效应,而有机肥(特别是蚓粪)替代化肥后具有缓解“氮阻遏”的作用,主要归因于蚓粪替代化肥可通过提高花生根瘤固氮酶活性来保持根瘤的固氮潜力,并改变花生植株氮素分配,最终使花生植株氮素吸收利用能力增强。

根瘤菌共生固氮对大豆百粒重影响的定量分析

本研究的目的在于定量分析根瘤菌共生固氮处理对大豆百粒重变化的影响。我们结合了田间实验和盆栽实验的方式,对过去两年的实验数据进行了深入的分析。研究发现:根瘤菌共生固氮显著促进大豆百粒重的增加,包括根瘤菌种的选择,固氮效率的提高以及土壤肥力的改善均显着影响大豆的产量与质量。这对优化大豆生产,推动农业的可持续发展有很大的价值。研究中也讨论了样本量少的限制,今后的研究可以从更广阔的领域加以证实。

根瘤菌对茎瘤芥的促生作用研究

[目的]研究田菁茎瘤固氮根瘤菌侵染茎瘤芥的情况以及对植株促生作用的影响。[方法]分析根瘤菌对不同品种茎瘤芥的促生作用差异、不同浓度根瘤菌对茎瘤芥栽培品种“涪杂2号”的影响、不同诱导剂对结瘤的影响。[结果]田菁茎瘤固氮根瘤菌侵染的6个茎瘤芥品种中,“涪杂2号”根长和株高增加显著,促生作用明显。以不同浓度田菁茎瘤固氮根瘤菌侵染“涪杂2号”幼苗结果表明,在1.0×10^(8)个/mL浓度下,茎瘤芥的根长和株高增加最为显著,同时利用荧光显微镜观察到根瘤菌在“涪杂2号”健康幼苗根部组织的定殖情况,在处理茎瘤芥3 d后,根瘤菌可侵入茎瘤芥根部并定殖,在接菌15 d后,在茎瘤芥根系局部组织发展成很高的群体密度。横向比较3种诱导剂诱导茎瘤芥结瘤效率差异表明,使用2,4-D、氯磺隆、豆科威后,3种诱导剂均可在30 d后于茎瘤芥根部形成类根瘤,60 d后类根瘤数量明显增多,其中,2,4-D结瘤效率最好,高达93%,显著高于其他2种诱导剂结瘤效率。[结论]该研究为更好地利用根瘤菌促进茎瘤芥生长的共生体系打下基础。

茎瘤固氮根瘤菌趋化系统基因的比较基因组学分析及相关蛋白序列分析（英文）

【目的】茎瘤固氮根瘤菌既可以与毛萼田菁共生固氮,又可以自生或作为内生菌在其他植物体内固氮。由于其具有3种生活状态及固氮能力,其感受外界信号的趋化系统应当更为复杂多样。目前对茎瘤固氮根瘤菌的趋化通路研究很少,因此我们将茎瘤固氮根瘤菌的趋化系统与其他已有研究的菌株相比较。【方法】基于NCBI蛋白数据库,利用BLAST程序对菌株ORS571及已公布全基因组序列的α变形菌门的其他菌种进行趋化基因簇的比较分析;基于Pfam蛋白数据库,利用HMMER3程序对甲基化受体蛋白序列进行比较分析。【结果】分析结果表明茎瘤固氮根瘤菌中有1条主要的趋化基因簇,其中所编码的甲基化酶Che R为非五肽依赖型;此外,该菌还具有43个甲基化受体蛋白基因,所编码的受体蛋白保守区段均由38个七肽单位组成。【结论】通过比较基因组学的分析可知茎瘤固氮根瘤菌与其他菌属相比趋化系统具有高度同源性,但同时存在自身的独特性,这一结论能够使我们更好的了解茎瘤固氮根瘤菌利用趋化系统适应环境的过程。

茎瘤固氮根瘤菌ORS571鞭毛马达基因fliN与fliM的功能分析

【目的】考察茎瘤固氮根瘤菌ORS571中鞭毛马达蛋白FliN、FliM的编码基因分别缺失的突变体表型,初步探究其功能机理。【方法】本研究采用同源重组和三亲本接合转移的方法构建突变体,测定野生型及突变株的生长曲线、趋化性、胞外多糖的分泌、生物膜的形成及细胞絮凝等表型。【结果】三种菌株的生长速率基本无差,与野生型菌株相比突变株鞭毛结构丧失,趋化能力、分泌的胞外多糖和生物膜形成能力均下降,但相同时间内细胞絮凝程度比野生型明显。【结论】实验表明,鞭毛基因fliN、fliM对茎瘤固氮根瘤菌ORS571鞭毛的形成、趋化运动、胞外多糖的分泌、生物膜的形成及细胞絮凝能力等均有调控作用。

茎瘤固氮根瘤菌甲基化受体蛋白Tlp1的功能

【目的】考察茎瘤固氮根瘤菌中趋化基因簇上游的受体蛋白Tlp1编码基因的突变表型,初步探究其功能机理。【方法】利用同源重组和三亲本接合转移的方法构建突变株,在TY培养基中测定生长情况,半固体平板法观察趋化圈,刚果红固体培养基观察胞外多糖和次生代谢产物的分泌,乙炔还原法测定菌株的固氮酶活性。【结果】与野生型菌株相比,tlp1突变株的生长速率没有影响。在以甘油为碳源的L3半固体平板上突变株的趋化圈变小,其回补菌株能部分回补趋化能力。突变株的胞外多糖分泌与野生型没有区别,但其次生代谢产物黑色素出现的时间比野生型稍早。在固氮酶活性测定中,发现突变株酶活性明显比野生型降低,回补菌株能够部分回补。【结论】茎瘤固氮根瘤菌Tlp1蛋白对甘油表现出一定的趋化能力,并且影响细菌的次生代谢产物和固氮能力。

硝态氮和氨态氮对大豆根瘤固氮的影响

在大豆开花前期追施不同配比的ＮＯ－３－Ｎ与ＮＨ＋４－Ｎ，分析其根瘤固氮酶活性，叶片ＮＲ活性，幼茎段酰脲含量、酰脲相对丰度及全氮含量。结果表明：７种配比的ＮＯ－３－Ｎ与ＮＨ＋４－Ｎ均不同程度地抑制根瘤固氮酶活性，降低幼茎段酰脲含量及酰脲相对丰度。其中，ＮＯ－３－Ｎ∶ＮＨ＋４－Ｎ＝１∶５时，根瘤固氮酶活性相对最高，幼茎段酰脲含量及酰脲相对丰度也最高；ＮＯ－３－Ｎ∶ＮＨ＋４－Ｎ＝１∶０时，根瘤固氮酶活性最低，幼茎段酰脲含量及酰脲相对丰度也最低。所有配比均可提高叶片ＮＲ活性及幼茎段全氮含量，但叶片ＮＲ活性随着ＮＯ－３－Ｎ比例的增加而增高，幼茎段全氮以ＮＨ＋４－Ｎ∶ＮＯ－３－Ｎ＝１∶３的含量最高。

减量施氮对玉米-大豆套作体系中大豆根瘤固氮及氮素吸收利用的影响

通过田间试验,研究了种植模式(大豆单作、玉米-大豆套作)和施氮水平(0,180,240 kg·hm-2)对大豆根瘤固氮特性和氮素吸收利用的影响。结果表明:随生育时期的推移,大豆的单株根瘤数、根瘤干重在单作模式下呈先增加再降低的趋势,而套作模式下则呈持续增加的趋势,在R5期最高;单株根瘤固氮潜力在两种种植模式下均呈先增加再降低的趋势,在R2期最高。与单作比较,套作大豆的单株根瘤数、根瘤干重、根瘤固氮潜力和总吸氮量在V5、R2期降低,在R5期则提高,氮素收获指数、氮肥农学利用率和吸收利用率显著提高。适量施氮有利于提高大豆的根瘤固氮能力,增加植株对氮素的吸收利用。套作模式下,减量施氮处理R5期的单株根瘤数、根瘤干重、根瘤固氮潜力及R8期的总吸氮量比不施氮处理高26.9%、15.5%、14.3%和58.2%,比习惯施氮处理高19.7%、12.0%、23.1%和11.3%,氮肥农学利用率和吸收利用率比习惯施氮处理高73.5%和20.1%。玉米-大豆套作减量一体化施肥促进了大豆根瘤固氮,提高了套作大豆和整个玉米-大豆套作系统的氮肥吸收利用效率。