人类线粒体肌酸激酶的固定化及酶学性质研究

目的人源肌酸激酶uMtCK具有良好的催化肌酸生成磷酸肌酸的活性,开发固定化uMtCK酶法生成磷酸肌酸,实现其工业化应用价值。方法将异源表达的uMtCK固定在纳米磁性材料Fe3O4@Histidine-Ni上,制备固定化酶Fe3O4@Histidine-Ni/uMtCK,并进行催化反应。与游离酶uMtCK比对酶学性质和动力学参数,测定固定化酶Fe3O4@Histidine-Ni/uMtCK的重复使用次数。结果与游离酶uMtCK相比,固定化酶Fe3O4@Histidine-Ni/uMtCK的最适反应温度提高5℃,最适pH降低0.5个单位,在50℃、pH7.5下孵育2h,残余酶活为51%,而游离酶仅为27%;uMtCK的KmCr为10.7mmol/L,为Fe3O4@Histidine-Ni/uMtCK的1.1倍;Fe3O4@Histidine-Ni/uMtCK的kcat/KmCr值是5.3L/(mmols),是uMtCK的1.3倍;Fe3O4@Histidine-Ni/uMtCK在经历9次循环使用后,活力还能保持50%以上,显示了良好的稳定性和重复使用性。结论与uMtCK相比,Fe3O4@Histidine-Ni/uMtCK具有良好的热稳定性和重复使用性,具有一定的工业化价值。

固定无花果蛋白酶制备可溶性肽的研究

将 Sephadex G-200与β-硫酸酯乙砜基苯胺(SESA)首先醚化制备对氨基苯砜乙基交联葡聚糖(ABSE-Sephadex G-200),然后经重氮化固定无花果蛋白酶。固定化酶的活力回收达69%。苯甲酰-DL-精氨酰-β-蓁胺(BANA)对该酶固定化过程中的活性变化有保护作用。天然酶与固定化酶都具有良好的耐热性,在59～60℃,80min,活性均无明显下降;在69～70℃,80min 固定化酶较天然酶更稳定。用 BANA 为底物,在半胱氨酸存在下,测定了两种形式酶的动力学性质。在 pH7.7的磷酸盐缓冲系统中,37℃天然无花果蛋白酶的 Km=0.32m-mol/L;在间歇振摇下固定化酶的表观 Km′=1.02mmol/L。最适 pH 无明显改变,均为7.7。