固脾消积饮对肝星状细胞共培养条件下HepG2细胞氨基酸代谢和能量代谢的影响

目的 观察固脾消积饮对人肝星状细胞LX-2共培养条件下肝癌细胞HepG2氨基酸代谢和能量代谢的影响。方法 建立HepG2细胞和LX-2细胞共培养体系,与单独培养的HepG2细胞同时设置对照组、空白血清组、中药血清组(固脾消积饮含药血清)和阳性药组(顺铂)。干预24 h后,CCK8法检测细胞增殖活力,DAPI染色观察细胞状态,ELISA检测细胞上清液三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)、丙酮酸和葡萄糖含量,试剂盒检测细胞丙二醛(MDA)含量和糖酵解速率,高效液相色谱法检测细胞上清液氨基酸含量,Western blot检测腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)α表达。结果 与同一培养体系对照组比较,10%、20%中药血清组及阳性药组单独培养和共培养HepG2细胞增殖活力降低,上清液TG、TC、葡萄糖含量减少,丙酮酸含量增加,细胞糖酵解速率降低,MDA含量增加,17种氨基酸含量减少(P<0.05,P<0.01)。Western blot结果显示,10%中药血清能升高单独培养和共培养HepG2细胞p-AMPKα/AMPKα比值。结论 固脾消积饮能调节肝星状细胞共培养条件下HepG2细胞氨基酸代谢和能量代谢,其机制与激活p-AMPKα通路有关。

固脾消积饮对人肝癌细胞HepG2线粒体结构功能的调节作用

目的 观察固脾消积饮(Gupi Xiaoji Decoction, GPXJY)对人肝癌细胞HepG2细胞线粒体结构功能的影响,并探讨其可能机制。方法 CCK-8检测细胞增殖,Mito-Tracker Green荧光染色观察线粒体结构,流式细胞术检测膜电位,ELISA检测ATP含量,透视电镜观察微观结构变化,高内涵检测相关蛋白。结果 荧光染色发现GPXJY对HepG2细胞线粒体造成损伤并且ATP含量降低;流式结果显示GPXJY能使HepG2细胞线粒体膜电位减少;电镜结果发现GPXJY使癌细胞线粒体肿胀等;高内涵检测发现,固脾消积饮对Hep G2细胞内Bcl-2平均荧光强度值明显降低,凋亡促进蛋白Bax、cytochrome-c、caspase-3、cleaved-caspase-3平均荧光强度值明显增加,差异有统计学意义。结论 GPXJY对Hep G2细胞线粒体结构功能有调节作用。

固脾消积饮诱导人肝癌HepG2细胞凋亡的分子机制

目的:探讨固脾消积饮对人肝癌细胞HepG2凋亡的分子机制。方法:将HepG2细胞分为4组:对照组(Control)、空白血清组(Blank)、固脾消积饮血清组(GPXJY)和顺铂组(Positive),每组设置8个复孔。固脾消积饮含药血清和顺铂干预24 h后,检测细胞活性、活细胞数量、细胞凋亡状态、细胞周期以及线粒体膜电位状况,检测细胞的脂质过氧化(MDA)水平、糖酵解速率和凋亡Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白的表达,检测细胞上清液三酰甘油(TG)、胆固醇(TC)、丙酮酸和葡萄糖的含量。结果:与Control组比较,GPXJY组(细胞的)抑制率增加、细胞数量减少、凋亡阳性细胞数增多(P<0.01),G1期细胞数目显著增加(P<0.05),细胞线粒体膜电位降低(P<0.01),糖酵解功能显著抑制,细胞中MDA水平升高,细胞Bax、Caspase-3的表达升高、Bcl-2的表达下降(P<0.05,P<0.01),细胞上清液中TC、TG、葡萄糖含量显著减少、丙酮酸含量显著增加(P<0.05,P<0.01)。结论:固脾消积饮可诱导HepG2细胞发生凋亡,可能对能量代谢发挥作用。

基于网络药理学与分子对接技术探讨固脾消积饮对肝癌HepG2.2.15细胞焦亡的影响

目的:以半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-1(Caspase-1)介导的细胞焦亡为基础,采用网络药理学及分子对接技术筛选中药复方固脾消积饮中抗肿瘤的活性成分,通过体外实验探讨该方干预肝癌HepG2.2.15细胞焦亡的分子机制。方法:利用中药系统药理学分析平台(TCMSP)筛选中药复方固脾消积饮的化合物及靶点,并获取对应的基因Symbol;从GeneCards数据库、在线人类孟德尔遗传(OMIM)数据库、PharmGKB数据库、TTD数据库搜集Caspase-1的靶点,运用Cytoscape构建化合物-基因靶点调控网络;采用STRING数据库进行蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络分析,采用基因本体(GO)功能富集和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析预测该方有效成分对Caspase-1的作用机制,应用AutoDock Vina进行分子对接验证。制备固脾消积饮含药血浆,体外培养肝癌HepG2.2.15细胞;将HepG2.2.15细胞分为空白血浆组、VX-765组、VX-765+含药血浆组、含药血浆组,使用15%含药血浆干预48 h后,免疫荧光染色法检测细胞膜表面GSDMD-N的表达及分布情况,检测HepG2.2.15细胞上清乳酸脱氢酶(LDH)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-18(IL-18)的释放情况,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测细胞中特征蛋白Caspase-1、消皮素D-N端(GSDMD-N)的表达水平。结果:网络药理学筛选得到丝裂原活化蛋白激酶14(MAPK14)、丝裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)、蛋白激酶B1(Akt1)、丝裂原活化蛋白激酶8(MAPK8)、V-Jun肉瘤病毒癌基因同源物(JUN)、TP53为主要作用靶点,化合物7-hydroxy-5,8-dimethoxy-2-phenyl-chromone、黄芩素、鼠李素、荠苎黄酮、异鼠李黄素、7-O-methylisomucronulatol、芒柄花黄素、毛蕊异黄酮、木犀草素、槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、黄芩苷为主要活性成分,GO富集分析涉及氧化应激反应、对金属离子的反应、与泛素-类蛋白连接酶结合、磷酸酶结合等多个生物过程,KEGG通路富集分析涉及MAPK、核转录因子(NF)-κB、p53、低氧诱导因子-1(HIF-1)等信号通路,分子对接表明靶点与成分具有较好结合性。体外实验表明,与空白血浆组相比,VX-765组的GSDMD-N荧光信号减少减弱,LDH、IL-1β、IL-18的释放量均减少,Caspase-1、GSDMD-N的表达显著下调(P<0.01);固脾消积饮含药血浆组的GSDMD-N荧光信号增加增强,LDH、IL-1β、IL-18的释放量显著增加,Caspase-1、GSDMD-N的表达显著增高(P<0.01)。结论:固脾消积饮通过多靶点多通路调控Caspase-1以诱导肝癌HepG2.2.15细胞发生焦亡。