国产沙门氏菌免疫磁珠的制备及其应用

目的优化免疫磁珠制备条件,获得捕获性能高、成本低的国产沙门氏菌免疫磁珠,为国产沙门氏菌免疫磁珠的产业化制备奠定基础。方法采用亚微米级羧基磁珠及沙门氏菌多克隆抗体,利用碳二亚胺缩合法制备2 mg级免疫磁珠。以目标菌捕获率、磁珠表面抗体偶联率为评价指标,对4种粒径(100、300、500、1000 nm)的磁珠原材料进行筛选;以目标菌捕获率、磁珠表面抗体偶联率、免疫磁珠表面FITC荧光强度为评价指标,对磁珠与抗体不同的投料比(100:1、100:1.5、100:2、100:2.5、100:3)进行优化;同时,对国产沙门氏菌免疫磁珠与进口免疫磁珠(Dynalbeads~?沙门氏菌免疫磁珠、Bac Trace~?沙门氏菌免疫磁珠)的性能进行比较分析,考察了捕获率、免疫磁珠与目标菌的结合情况、特异性捕获能力等,并在实际样品中进行了应用检测。结果以粒径为300 nm的磁珠为原材料制备的免疫磁珠对浓度为10~2 CFU/mL的目标菌的捕获率为99%、抗体偶联率为34.64%,明显高于其他粒径的免疫磁珠;当投料比为100:2(磁珠:抗体)时,制备的免疫磁珠对浓度为10~2 CFU/m L的目标菌的捕获率为100%,偶联率为52.34%,优于其他投料比;针对不同浓度的鼠伤寒沙门氏菌(10~0~10~6 CFU/mL),国产免疫磁珠的捕获率高于进口免疫磁珠(国产:83%~100%;Dynalbeads~?:57%~74%;Bac Trace~?:9%~40%);在25 mL牛奶中添加(11.9±3.7)CFU鼠伤寒沙门氏标准菌株,国产沙门氏菌免疫磁珠的检出率高于进口免疫磁珠(国产:100%;Dynalbeads~?:70%;Bac Trace~?:40%)。结论优化了制备条件后所制备的国产沙门氏菌免疫磁珠的捕获能力强、价格低、能够实现大体积实际样品中痕量目标菌的100%检出,具有广阔的应用前景,本研究为沙门氏菌免疫磁珠的国产化应用提供了科学数据。

免疫磁珠法检测脱水蒜制品中沙门氏菌

研究免疫磁珠法用于出口脱水蒜制品中沙门氏菌的检测,将免疫磁珠使用于400mL大体积溶液中,并使用高速离心代替磁棒进行分离。致病微生物捕获、分离实验结果表明免疫磁珠法具有特异性强、灵敏度高的特点,沙门氏菌污染量为1CFU/25g时,检出率为70%,污染量为10CFU/25g时,检出率达100%。

免疫磁珠捕获-PCR检测牛乳中沙门氏菌的研究

实验建立了沙门氏菌的磁捕获-PCR检测方法。筛选了最佳包被液和最适包被条件,用于制备包被有抗沙门氏菌抗体的磁珠。用制备的免疫磁珠捕获样品中的沙门氏菌,用于PCR检测。此方法操作简便,用时短,检出率高。用所建立的免疫磁珠捕获-PCR技术检测牛乳中的沙门氏菌,检测灵敏度为9cfu/mL,所用时间为7h(包括前增菌时间)。

全自动免疫磁珠分选系统检测沙门氏菌

目的研究全自动免疫磁珠分选系统对国标沙门氏菌检测方法的改进效果。方法从肉鸡专项监测中选取106份样品,采用全自动免疫磁珠分选系统和GB 4789.4-2010《食品微生物学检验沙门菌检验》进行沙门氏菌对比检测。与国标法相比,全自动免疫磁珠分选系统取消了SC和TTB增菌,经BPW增菌后直接使用系统富集目标菌并接种显色平板。结果免疫磁珠法阳性检出率为32%,国标法阳性检出率为31%,二者无显著性差异(P>0.05)。但磁珠法取消了二次增菌的步骤,检测时间比国标法节省24 h,且平板上的单个菌落生长率和菌株特异性也更好。采用磁珠法检测的106份样品中,有34份样品检出可疑显色菌株,都有单个可疑菌落生长,最后均鉴定为目标菌沙门氏菌;采用国标法有38份样品检出可疑显色菌株,其中3份无单个可疑菌落生长经再次转种,最后有5株经鉴定为嗜水气单胞菌等干扰性杂菌,仅33株为目标菌沙门氏菌。结论全自动免疫磁珠分选系统特异性好、单个菌落生长率高且检测时间短,可以用于食品中沙门氏菌检验。

免疫磁珠法和VIDAS法在检测畜禽养殖场环境沙门氏菌中的应用

本试验将免疫磁珠法和VIDAS法相结合应用于畜禽养殖场沙门氏菌的检测,经试验结果表明:来自于猪场、鸡场和鸽场的粪便样品.猪场和鸡场的污水样品和鸽场的饮水样品中均检测到沙门氏菌;通过应用特异性的PCR对各分离菌株进行鉴定,均为沙门氏菌阳性。将免疫磁珠法和VIDAS法相结合,较大提高了检测效率和准确性,同时缩短了检测时间。

免疫磁珠-环介导等温扩增快速检测牛肉中的鼠伤寒沙门氏菌与金黄色葡萄球菌

建立免疫磁珠分离(immunomagnetic separation,IMS)联合环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术检测牛肉中鼠伤寒沙门氏菌与金黄色葡萄球菌的方法。用生物素标记的鼠伤寒沙门氏菌抗体和生物素标记的金黄色葡萄球菌菌体蛋白抗体对链霉亲和素磁珠进行功能化,从牛肉中捕获和分离目标致病菌。结果表明:经优化后,每毫克磁珠与10 μL鼠伤寒沙门氏菌抗体偶联,400 μL鼠伤寒沙门氏菌免疫磁珠在45 min内对10~4 CFU/mL鼠伤寒沙门氏菌的捕获率为52.16%;每毫克磁珠与6 μL金黄色葡萄球菌抗体偶联,300 μL金黄色葡萄球菌免疫磁珠在30 min内对10~4 CFU/mL金黄色葡萄球菌的捕获率为56.80%;建立的IMS-LAMP方法特异性高,对牛肉中鼠伤寒沙门氏菌的检测灵敏度为1.2×10~3 CFU/mL,对金黄色葡萄球菌的检测灵敏度为4.4×10~4 CFU/mL;富集5 h后,鼠伤寒沙门氏菌的检测限可至1.2 CFU/mL,富集7 h后,金黄色葡萄球菌的检测限可降至4.4 CFU/mL。建立的IMS-LAMP方法用时短,灵敏度高,操作简单,可以有效检测牛肉中的鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌。

免疫磁捕获-荧光定量PCR快速检测食品中沙门氏菌

建立了免疫磁珠分离(Immunomagnetic separation,IMS)联合荧光定量PCR(Real-time PCR)技术准确、快速检测食品中沙门氏菌(Salmonella spp)的方法。采用亲和纯化的羊抗沙门氏菌抗体与Dynabeads M-280磁珠制备沙门氏菌免疫磁珠,优化反应条件,建立免疫磁珠分离方法。同时根据沙门氏菌特异性ttr基因,建立Real-time PCR体系,并检测其特异性及敏感性。结果显示,沙门氏菌可产生荧光信号,而其他细菌均未见明显荧光信号。利用所建立的免疫磁捕获-荧光定量PCR(IMS-real-time PCR)方法可以检测初始含菌量最低为6.5CFU/25g的食品样品,全过程需时约8h。150份实际食品样品中,IMS-real-time PCR方法检出27份阳性样品,免疫磁珠联合XLT4平板培养法检出18份阳性样品,传统国标法检出14份阳性样品。

国产免疫磁珠分离细胞的方法学研究及初步应用

目的 :探讨以国产免疫磁珠进行细胞分离的方法 ,并评价直接包被法的特异性和敏感性及其在脐血和骨髓 CD+ 34 细胞分离中的应用。方法 :直接包被法、SPA法、生物素 -亲和素法。结果 :直接包被法、SPA法和生物素-亲合素法均可有效分离细胞 ,但以直接包被法最具优势 ,并证明其有较高特异性和敏感性。应用直接包被法分离脐血及骨髓中的 CD+ 34 细胞率为 5 1%～ 82 % ,台盼蓝拒染率为 82 %～ 88%。结论 :国产免疫磁珠有较好的分离效果 。

免疫富集联合基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法测定牛奶、鸡蛋中的沙门氏菌

目的建立免疫富集联合基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)检测牛奶、鸡蛋中沙门氏菌的方法。方法沙门氏菌经免疫磁珠特异性富集后采用MALDI-TOF MS鉴定,并优化富集过程中的抗体、免疫磁珠添加量以及捕获时间,研究其特异性,并用于实际样品中沙门氏菌的检测。结果富集过程最佳反应条件为:每1 mg磁珠中抗体添加量为250μg,1 mL菌样中免疫磁珠添加量为600μL,捕获时间为30 min,免疫磁珠捕获沙门氏菌具有特异性;用于检测牛奶和鸡蛋中的沙门氏菌时,将浓度为3 CFU/mL的沙门氏菌特异性富集后选择性增菌9h即可被MALDI-TOF MS准确鉴定。结论该方法具有选择性好,特异性高,耗时短,结果准确的优点,为食品中沙门氏菌的检测提供相关参考。

3种食源性细菌免疫磁珠联合ATP发光检测技术研究

沙门氏菌、单核细胞增生李斯特菌和金黄色葡萄球菌是食品中常见的致病菌,在国内外常引起食源性疾病。为解决食源性疾病中的微生物检测问题,本研究将免疫磁珠技术和ATP发光技术联合用于食品微生物检测,选择沙门氏菌、单核细胞增生李斯特菌病和金黄色葡萄球菌为检测对象,建立快速检测这3种常见食源性病原菌的富集及检测新方法。该方法在显著缩短预增菌时间的条件下,通过免疫磁珠的富集作用获得与常规增菌时间同样的效果,样品中的微生物浓度增加了10倍,大大提高了样本检出率,缩短了检测周期。结果表明,本研究建立的免疫磁珠富集后联合ATP发光技术具有快速、敏感、特异和低廉的优点,可用于检测食品中沙门氏菌、单核细胞增生李斯特菌以及金黄色葡萄球菌,具有较好的推广应用前景。

基于NMR纳米探针的生物传感器用于快速检测沙门氏菌

通过将沙门氏菌单抗与羧基磁珠偶联制备免疫磁珠,并以此为NMR分子探针,以免疫磁珠为生物传感器,特异性地捕获并检测出样品中的致病菌,从而建立一种更快的检测沙门氏菌的方法。实验将得到的不同样品溶液放入核磁共振仪中检测自旋-自旋弛豫时间（T2）值,考察不同条件对T2值的影响。通过实验发现,免疫磁珠的使用量,缓冲溶液的选择,捕获时间的长短都会对样品T2值产生影响。通过优化实验,分别绘制出不同条件下T2值的曲线变化,并得出最佳捕获条件。在捕获缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液PBS（0.01 mol/L,p H7.4）,免疫磁珠使用量为50μg,混匀捕获时间为1.5 h的条件下,核磁共振仪测得的样品T2值曲线最佳。其检测线性范围为10^4-10^7CFU/m L。本研究为沙门氏菌的检测提供了新的方法和途径,缩短了检测时间和工序,并且为低场核磁共振技术研究应用开辟了广阔的空间。

M-FAST^(TM(磁在快))沙门氏菌测试盒在沙门氏菌检验中的应用研究

据美国农业部农业经济研究部门最新数据统计显示,沙门氏菌每年在美国导致的医疗花费达到37亿美元,这个数据将沙门氏菌排在了美国食源性疾病花费最高的15大致病菌之首。另外,一系列沙门氏菌引起的食物中毒事件也表明,沙门氏菌早已成为全球最常见的食源性致病菌之一。传统沙门氏菌检测技术存在耗时、繁琐、低效等缺点,故快速、灵敏、可靠的新型快速检测技术成为研究热点。将免疫学和生物化学技术有机结合,利用微生物特异性免疫磁珠和微生物测试片实现待检致病菌的双重筛选,大大提高了沙门氏菌检测的特异性,灵敏度明显高于同类产品,并大幅度缩短检测时间。

免疫磁珠捕获-通用引物PCR快速检测食品中致病菌

食品加工、生产和运输等环境是产生食品致病微生物污染的主要途径,对人们的健康造成了很大威胁。材料选择菌株。本文借助各种病菌中抗血清及磁性微珠制作免疫磁珠,对食品中的致病菌进行检测,希望可以提高食品中致病菌的检出率。上海汉尼公司生产,菌种号为ATCC13706,肠炎沙门氏菌;上海汉尼公司生产,菌种号为ATCC7644,单增李斯特氏菌;上海汉尼公司生产。

免疫磁珠分离-实时荧光PCR快速检测虾中沙门氏菌

建立了免疫磁珠分离(Immunomagnetic separation,IMS)联合实时荧光PCR(real time PCR)快速、灵敏地检测虾中沙门氏菌的方法。用纳米磁珠与抗沙门氏菌多克隆抗体制备免疫磁珠,优化反应条件,建立IMS方法。同时针对沙门氏菌ttr基因合成探针和引物,构建real time PCR体系,选4株代表性的沙门氏菌检测其特异性和灵敏度。结果显示,免疫磁珠的最适添加量为100μL,免疫磁珠与样品菌液的最佳反应时间为30 min。建立的免疫磁珠分离-实时荧光PCR(IMS-real time PCR)方法特异性高,对于虾中沙门氏菌的检测限为鼠伤寒沙门氏菌5×10~1 CFU/25 g,猪霍乱沙门氏菌5×10~2 CFU/25 g,肠炎沙门氏菌和甲型副伤寒沙门氏菌1×10~2CFU/25 g,检测全程可在6 h内完成。对40份实际样品,IMS-real time PCR方法与国标法检测结果完全一致。建立的IMS-Real time PCR方法用时短、灵敏度高,为水产品中沙门氏菌的快速检测提供了技术支撑,对沙门氏菌引起的食源性疾病的预防和控制具有现实意义。

免疫磁珠富集鼠伤寒沙门氏菌条件的研究

目的:确定免疫磁珠富集鼠伤寒沙门氏菌的方法和条件。方法:通过对免疫磁珠添加量、免疫磁珠和菌液反应时间的研究,确定了最佳的免疫磁珠富集食源性鼠伤寒沙门氏菌条件和方法,并对免疫磁珠富集鼠伤寒沙门氏菌敏感性和特异性进行了验证实验。结果:免疫磁珠添加量为100μL、免疫磁珠与菌液反应30 min时,免疫磁珠对鼠伤寒沙门氏菌的富集分离效果最佳,免疫磁珠在该条件下,对鼠伤寒沙门氏菌敏感性和特异性较好。结论:建立了最佳的免疫磁珠富集鼠伤寒沙门氏菌的方法和条件。

磁性分离技术及在微生物检测上的应用

微生物检测技术就是从样品中分离和鉴定目的微生物、通常我们使用选择性培养基来获得单个的纯化目的微生物。如果对于受到损伤的和热应激的微生物还需经过增菌培养,增菌过程应包括前增菌、选择性增菌和后增菌。因此从样品中检测病原微生物需很长的时间。

基于KMnF_3纳米探针的NMR快速检测沙门氏菌捕获条件的优化

本研究尝试了一种新型的基于KMn F3纳米探针的NMR方法对沙门氏菌进行快速检测。通过将沙门氏菌单抗与羧基磁珠偶联制备免疫磁珠,并以此为NMR分子探针,以免疫磁珠为生物传感器,特异性地捕获并检测出样品中的致病菌,从而建立一种更快的检测沙门氏菌的方法。实验发现,活化剂的添加量,捕获沙门氏菌的缓冲液,细菌培养时间和探针添加量在不同程度上影响着检测样品的弛豫时间。通过实验对捕获条件进行优化,得出的最佳捕获条件是:一份的KMn F3,活化时加入是KMn F3质量五倍的EDC·HCl、NHS;用灭菌的蒸馏水作为捕获沙门氏菌的缓冲液;加入80μL的抗体-KMn F3捕获培养10 h的沙门氏菌。本研究为沙门氏菌的检测提供了新的方法和途径,缩短了检测时间,为低磁场核磁共振技术在食品安全领域开辟新的空间。

食源性致病菌低场磁共振快速筛选检验方法

研究了一种采用低场核磁共振技术(NMR)快速筛选检测沙门氏菌的方法。以Fe3O4为核心的纳米磁珠包裹上二氧化硅,使其具有很好的分散性和生物相容性。通过氨基硅烷修饰磁珠,使磁珠能固定抗体。在富集过程中,免疫磁珠特异性结合在沙门氏菌表面,由核磁共振仪测得其△T2值,并以此判别。采用同样方法对5株食源性致病菌大肠杆菌O157、单核细胞增生李斯特菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌进行分析,可很好地区分这5种食源性致病菌与沙门氏菌,表现出很好的特异性。同时,优化了试验参数,结果显示确定磁珠质量浓度为0.14mg/mL。检出限为103cfu/mL。

3种病原菌多重IMS-荧光RPA检测体系的建立及初步应用

建立一种同时检测沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7和布氏杆菌的快速、灵敏、高通量的检测方法。利用特异性免疫磁珠,在37℃条件下从200 mL样液体系中循环捕获目标致病菌。磁珠液提取DNA后,对3种病原菌进行多重IMS-荧光RPA检测。结果表明:针对沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7和布氏杆菌的检测限分别达到3.0、4.5和8.7 CFU/mL。使用新建多重IMS-荧光RPA方法对人工感染60份皮张、毛皮纺织品DNA样本进行扩增,结果显示与预期结果一致;对60份公共场所收集的皮张、毛皮、纺织品DNA样本进行扩增,结果显示有2个样本沙门氏菌阳性、1个样本大肠杆菌O157:H7阳性,3份阳性样品送测序,测序结果与GenBank检索沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7 DNA序列一致。得出结论:建立的多重IMS-荧光RPA检测体系灵敏度、特异性、准确度符合要求,能够在2 h内完成对3种病原菌检测,可以作为快速应对此三类病原菌安全突发事件的检测手段。