圆二色和等温滴定微量热技术研究人血清白蛋白与锌离子的结合机制

目的:体外利用圆二色和等温滴定微量热技术获得人血清白蛋白(HSA)与锌离子(Zn2+)相互作用的二级结构信息与热力学参数,认识Zn2+与HSA之间的相互作用机制,为探索并发挥微量元素在人体内的作用潜力提供科学依据。方法:采用圆二色技术和等温滴定微量热技术;HSA浓度设置为由低到高的梯度,分别为0.025 mmol·L-1、0.05 mmol·L-1、0.1 mmol·L-1、0.2 mmol·L-1,Zn2+浓度5 mmol·L-1。结果:圆二色检测到不同浓度的HSA与Zn2+相互作用后二级结构发生变化,由低到高浓度的HSA与Zn2+结合后α-螺旋含量随之降低,当HSA浓度为0.2 mmol·L-1时α-螺旋含量表现特殊;进而所进行的等温滴定微量热实验获得一整套有关分子相互作用的热力学信息,包括结合常数(Kb)、反应的化学计量数(N)、熵(ΔS)和焓(ΔH),发现当Zn SO4(mmol·L-1)?HSA(mmol·L-1)=5?0.2时,有两类结合位点。不同浓度的HSA分别与Zn2+结合,表现出不同构象变化,特别当HSA浓度达到0.2 mmol·L-1时,α-螺旋含量急剧降低,蛋白质疏水性减弱,肽链伸展。在进一步的等温滴定微量热实验中,发现Zn SO4(mmol·L-1)?HSA(mmol·L-1)=5?0.2的条件下,Zn SO4-HSA有两类结合位点,即吸热位点和放热位点。结论:揭示HSA上的吸热结合位点对Zn2+有高特异性,但非结合优先性。这一结果为Zn2+在未来成为打开HSA上吸热位点的"钥匙"提供可行性依据。

高压脉冲电场技术改变抗氧化活性肽MMCTN的二级结构的实验研究

本研究以DPPH自由基清除能力为抗氧化活性衡量指标,利用双因素实验设计研究方法,探究了高压脉冲电场(PEF)的电场强度(5、10、15、20 k V/cm)和脉冲频率(1800、2400 Hz)两个因素对抗氧化肽MMCTN的抗氧化活性的影响,并且考察了PEF处理后保留时间(0、2 h)对其抗氧化活性的作用;借助傅立叶红外光谱技术(MIR)、圆二色谱技术(CD)分析了PEF处理对MMCTN的二级结构影响情况。研究发现,当电场强度为10 k V/cm,脉冲频率为2400 Hz,且PEF处理后保留2 h时,MMCTN的DPPH自由基清除能力最高,达到94.14%±0.13%;MIR光谱分析得知高压脉冲电场处理的样品功能团发生了改变;CD色谱分析得知PEF处理后的样品中α螺旋、β折叠、β转角和无规则卷曲之间发生了相互的转化。

圆二色和等温滴定微量热技术研究盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱与人血清白蛋白的作用机制

在模拟储存温度(25℃)和生理温度(37℃)条件下,利用圆二色和等温滴定微量热技术获得了人血清白蛋白与盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱相互作用的热力学参数,探索了蛋白质二级结构的变化及其作用机制。圆二色光谱实验检测到人血清白蛋白与盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱相互作用后的二级结构发生变化,这种构象变化在25℃~37℃区间内的温度依赖性不明显。ITC检测获得一系列有关分子相互作用的热力学信息,包括结合常数(Kb)、反应的化学计量数(N)、熵(ΔS)和焓(ΔH)。发现人血清白蛋白在与盐酸伪麻黄碱结合时,表现出比盐酸麻黄碱更好的活跃度。圆二色和等温滴定微量热技术的联用为建立一套快速药物分析方法提供了可行性基础。

圆二色与等温滴定微量热技术检测3种微量元素与人血清白蛋白的结合

在体外,利用圆二色和等温滴定微量热技术获得人血清白蛋白与钙、镁、锌三种人体微量元素相互作用的二级结构信息与热力学参数。圆二色检测到不同浓度Ca2+、Mg2+、Zn2+与HSA相互作用后二级结构存在差异,Ca2+、Mg2+的浓度比例变化对HSA二级结构变化作用不大,但受到Zn2+离子浓度变化的影响;进而所进行的ITC实验获得了结合常数(Kb)、反应的化学计量数(N)、熵(ΔS)和焓(ΔH)等一系列分子相互作用的热力学信息,发现Zn2+-HSA表现出了更好的亲和力和结合稳定性。因此,对于重度或急症缺锌患者血液注射将比口服治疗获得更迅速疗效。验证了HSA是人体内是重要的Zn2+转运载体,而Ca2+、Mg2+在体内的转运并不以HSA为主,Ca2+、Mg2+与蛋白的结合方式相似。两种技术的联用为探索一套快速、高效的人体微量元素血液研究的系统方法提供理论基础。

圆二色光谱技术在生物制品结构表征分析中的应用

高级结构(Higher order structure,HOS)是控制生物制品的功能和疗效的关键质量属性(Critical quality attributes, CQAs),在放行检测中具有重要作用。圆二色光谱技术(Circular dichroism,CD)常与傅立叶红外光谱(Fourier transform infrared spectroscopy,FT-IR)、差示扫描量热法(Differential scanning calorimetry,DSC)技术联合使用,共同表征生物制品高级结构,已成为欧美药典的标准方法之一。CD技术可以对生物制品的二级结构进行定量分析,同时也能预测评估其三级结构;此外,对样品所处微环境高度敏感,目前广泛应用在生物制品领域。本文从CD技术原理出发,综述CD技术在不同种类生物制品在药物仿制、热稳定性、分子间相互作用的应用进展,确保其构象稳定性,并满足其质量、安全性和有效性等三个方面的要求。