兔圆小囊免疫功能及其与肠道粘膜局部免疫关系的研究 Ⅳ.实验性感染肠球虫兔的圆小囊上皮间淋巴细胞及杯状细胞定量观察

本研究对半月龄、５周龄和２月龄兔口服感染４种兔肠球虫后，圆小囊绒毛粘膜上皮间淋巴细胞和杯状细胞以及圆顶两侧粘膜上皮间淋巴细胞和杯状细胞的数量变化情况进行了观察分析。结果表明：感染后，５周龄组第４天、第５天圆顶两侧粘膜上皮间淋巴细胞、２月龄组绒毛粘膜上皮间淋巴细胞显著增加，其余组上皮间淋巴细胞同对照组相比，差异不显著。杯状细胞数量的变化呈现相对的不规律性：半月龄组和５周龄组圆顶两侧粘膜上皮间杯状细胞数量呈增加趋势，而在２月龄组和５周龄组绒毛粘膜上皮间杯状细胞数量则呈减少趋势。这些结果表明，圆小囊的局部细胞免疫机制可能在机体抗球虫免疫中起着非常重要的作用。

家兔肠相关淋巴组织圆小囊超微结构观察

目的 :揭示不同年龄家兔肠相关淋巴组织圆小囊的超微结构特点及其与肠道黏膜免疫的关系。方法 :采用扫描电镜及透射电镜对 2月龄、1年龄、2年龄兔圆小囊黏膜和黏膜下淋巴组织的结构进行观察。结果 :与一般肠道淋巴组织比较 ,圆小囊的淋巴组织内细胞排列紧密 ,无间隙或间隙很小 ;细胞成份复杂多样 ,尤其在其淋巴组织中含有大量的神经内分泌细胞 ,还有多量上皮性网状细胞和树突状细胞。覆盖于淋巴组织表面的圆顶上皮中含有丰富的膜上皮细胞 (microfoldcell.M细胞 ) ,并常见肠道细菌附着于M细胞表面或被裹入其细胞内。结论 :兔圆小囊与其他肠相关淋巴组织 (PP)的结构有明显不同。

兔圆小囊产溶菌酶细胞的免疫电镜组织化学观察

采用免疫组织化学和免疫电镜细胞化学的方法 ,对兔圆小囊组织中产溶菌酶细胞进行了观察。免疫组织化学观察发现 ,产溶菌酶阳性细胞在兔圆小囊的粘膜上皮、圆顶上皮以及淋巴组织的滤泡生发中心、圆顶区和帽区均有分布 ,且受到多杀性巴氏杆菌感染后 ,阳性细胞增多 ,阳性反应增强。免疫电镜结果显示 ,在兔圆小囊的淋巴组织DNES细胞的颗粒中发现溶菌酶免疫组织化学阳性反应物。这一重要发现为神经 内分泌 免疫网络学说提供了新的证据。

兔圆小囊及肠道组织中抗菌肽的免疫组织化学和免疫电镜细胞化学定位

采用免疫组织化学和免疫电镜细胞化学技术观察了兔圆小囊及其他肠道组织中产抗菌肽细胞的分布定位。免疫组织化学观察发现,产抗菌肽细胞在兔圆小囊的黏膜上皮、圆顶上皮以及淋巴组织的滤泡生发中心、圆顶区和帽区均有分布;在兔感染多杀性巴氏杆菌后,圆小囊及其他肠道组织中的抗菌肽免疫组织化学阳性细胞数量明显增多,阳性反应增强。免疫电镜细胞化学观察结果显示,除肠道黏膜上皮细胞、异嗜性白细胞、巨噬细胞中存在抗菌肽免疫组织化学阳性反应信号外,在淋巴细胞内也发现阳性反应信号,尤其是在圆小囊淋巴组织中的DNES细胞内发现抗菌肽免疫组织化学阳性反应信号。表明圆小囊的DNES细胞和淋巴细胞均可产生抗菌肽。

感染球虫兔圆小囊淋巴组织内嗜银细胞的观察

用硝酸银反应法对 15、3 5和 60日龄健康兔及同日龄感染艾美球虫兔圆小囊内的嗜银细胞的分布进行了初步观察。结果表明 ,随着健康兔日龄的增大 ,圆小囊内嗜银细胞从无到有、从少到多 ;而同日龄兔感染球虫后的嗜银细胞数量增多 ,并成群成片出现于淋巴组织各处。表明嗜银细胞的出现及数量变化除了与兔日龄有关外 ,还与兔受到抗原刺激密切相关 ,即圆小囊内嗜银细胞的数量变化与兔肠道黏膜局部免疫有一定关系。提示嗜银细胞可能与弥散神经内分泌系统(DNES)

兔圆小囊组织中抗菌肽类物质的分离纯化及抗菌活性研究

成年健康家兔,经腹腔注射猪大肠杆菌刺激后,取圆小囊组织以捣碎机捣碎,沸水浴处理后,以5％乙酸提取,调整pH值后,经Sephadex G100凝胶柱过滤层析,收集各组分并用琼脂糖弥散法检测各组分的抗菌活性,获得纯化的抗菌肽类物质。纯化物经Tricine SDS-PAGE,银染后分析为一条蛋白带,分子量约为7 000 Da左右,经超滤分析,纯化物的分子量大于3 000Da。抗菌肽粗提物和纯化物经体外抗菌实验,对大肠杆菌(078)、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌均表现出较强的抗菌活性。

不同日月龄兔感染RHDV后圆小囊的比较病理学观察

为探讨圆小囊在兔体全身抗感染免疫中的功能作用 ,采用组织病理学及免疫组织化学方法 ,对比观察了 2日龄、1月龄及 2月龄实验兔感染RHDV后圆小囊的病理变化 ,同时采用ELISA方法对实验兔的血清及肝、肾、脾中的RHDV含量进行了测定 ,重点对实验兔圆小囊黏膜上皮内淋巴细胞 (IEL)进行了统计比较。结果显示 :2月龄以内兔人工感染RHDV后 ,临症表现、剖检及组织病理学观察均未见异常。血清及RHDV的靶器官肝、脾、肾中均未检测出RHDV抗原。 2月龄以上兔感染RHDV后 ,无论从临床症状 ,还是大体剖检 ,组织病理学观察 ,均出现了明显的病理学改变 ,而且感染后血清RHDV抗原检测呈阳性反应。圆小囊、肝、脾、肾等组织器官都呈现RHDV免疫组化强阳性反应。 2月龄以内的乳兔及仔兔感染RHDV后 ,圆小囊虽未出现明显的形态结构改变 ,免疫组化染色也未见RHDV抗原阳性反应物 ,但IEL明显增多 ,2日龄兔IEL由 1 2 %增加到 4 2 % ;1月龄兔的IEL由10 1%增加到 2 6 1%。

P物质及其mRNA在家兔圆小囊组织内表达的研究

P物质(substanee P,SP)是第一个被发现的脑肠肽类物质。大量研究表明SP在激发非特异性免疫调节和诱发炎症等方面发挥着重要的功能。家兔的圆小囊是兔特有的肠道粘膜免疫器官,在家兔的抗感染免疫中发挥着非常重要的作用。采用免疫组化和原位杂交的方法,显示了家兔圆小囊中的SP和其mRNA的分布和表达情况。免疫组织化学结果表明:在家兔的圆小囊粘膜层和黏膜下淋巴组织中存在有大量SP免疫组化阳性反应信号;原位杂交实验结果观察到的圆小囊淋巴组织的各个部位均有SP mRNA阳性反应信号出现,表明兔圆小囊淋巴组织中确实存在着产SP的细胞。

兔圆小囊淋巴组织中11种脑肠肽类物质免疫组织化学定位观察

采用免疫组化方法,观察P物质、胰高血糖素、胃泌素、胰多肽、生长抑素、促甲状腺素、促肾上腺素皮质激素、降钙素、胰岛素、突触素、血管活性肠肽等11种脑肠肽类物质在兔圆小囊淋巴组织中的分布及定位。研究发现上述物质在兔圆小囊淋巴组织及粘膜内均有分布,但在淋巴组织中上述物质阳性细胞的数量及分布部位各不相同。其中降钙素、胰岛素2种物质,在粘膜下淋巴组织中分布很少,只可偶见阳性细胞;突触素阳性细胞稍多于上述2种物质;P物质、胃泌素、生长抑素、血管活性肠肽阳性细胞较多,尤其是在圆顶上部淋巴组织和淋巴滤泡中均大量散在分布;促肾上腺素、生长激素、促甲状腺素阳性细胞也比较多,主要分布在淋巴滤泡部位,圆顶上部淋巴组织虽然也存在阳性细胞,但数量明显少于淋巴滤泡部位;胰多肽主要分布在圆顶上部的淋巴组织中,淋巴滤泡处较少。

一种兔圆小囊抗菌肽对新城疫病毒抑制作用

目的观察兔圆小囊抗菌肽对鸡新城疫病毒强毒株有无抑制作用。方法将NDV用圆小囊抗菌肽处理后再接种9日龄鸡胚,测定鸡胚尿囊液中的NDV血凝效价,并观察鸡胚病变。结果与对照组比较,兔圆小囊抗菌肽使鸡胚尿囊液中新城疫病毒的血凝效价降低,同时还能抑制因以上新城疫病毒所引起的鸡胚病变。结论兔圆小囊抗菌肽在体外对鸡新城疫病毒强毒株具有抑制作用。

注入辣根过氧化物酶及巴氏杆菌后兔圆小囊的细胞化学研究

30只2月龄健康免,随机分为3组,活体结扎圆小囊,分别注入辣根过氧化物酶(Horseradishperoxidase,HRP)、兔巴氏杆菌等抗原及生理盐水(对照组)后,于不同时间剖杀取材,观察圆小囊的细胞化学变化,并对其上皮内淋巴细胞及杯状细胞数量变化进行了统计分析。结果表明:注入HRP及兔巴氏杆菌后,均可见到圆顶表面贴附一层PAS阳性反应物,并且在圆顶上皮被包裹的细胞中可见少数阳性细胞,小囊内淋巴组织中阳性反应物增多。研究采用Gomorl技术,对圆小囊的碱性磷酸酶的分布进行了观察,发现对照组及HRP组圆小囊黏膜上皮碱性磷酸酶活性均较弱,圆顶上皮呈阴性。硝酸银反应进一步证实了在动物的肠道淋巴组织中存在嗜银细胞,注入示踪物后可见圆小囊内嗜银细胞显著增加,弥散于淋巴组织内,在滤泡处呈片状分布。同时,圆小囊圆顶两侧黏膜上皮内淋巴细胞及杯状细胞的数量在总体上呈增加趋势,但HRP组较巴氏杆菌组更为明显。注入HRP及兔巴氏杆菌后所引起的圆小囊的组织细胞化学的不同结果提示,圆小囊的主要功能不是吸收营养物质,它对上述两种不同抗原的刺激有不同的反应机制并且圆小囊内嗜银细胞的数量变化与兔肠道黏膜局部免疫有一定关系。

兔圆小囊抗菌肽对红腹锦鸡禽流感疫苗免疫抗体水平的影响

本实验旨在研究兔圆小囊抗菌肽对红腹锦鸡免疫禽流感疫苗后抗体水平的影响。在相同饲养条件下,实验组红腹锦鸡肌内注射抗菌肽0.5 mg/（只·次）,连续5次,对照组不注射,定期采集红腹锦鸡血液样品,进行抗体水平测定。结果显示,实验组血清AIV抗体水平显著高于对照组（P〈0.01）。表明兔圆小囊抗菌肽可以显著提高红腹锦鸡禽流感疫苗免疫的抗体水平。

大肠埃希菌感染对家兔圆小囊组织结构及VIP表达的影响

应用组织病理学、免疫组织化学等方法,探讨大肠埃希菌感染对实验兔圆小囊的组织病理学损伤及血管活性肠肽(VIP)在兔圆小囊组织内的分布。结果显示,与对照组相比,感染组圆小囊黏膜层出现了明显的病理性损伤,黏膜下层淋巴滤泡的长度极显著变短(P<0.01)。免疫组织化学染色结果显示,感染组兔圆小囊组织中的VIP的表达显著高于对照组(P<0.05)。上述结果表明,大肠埃希菌感染可引起兔圆小囊组织结构明显的病理损伤,并导致圆小囊组织中VIP的表达明显增多。

不同细菌刺激下离体圆小囊中胃泌素的动态表达

圆小囊离体培养,使用大肠杆菌O78、金黄色葡萄球菌、沙门氏杆菌和巴氏杆菌作为刺激物,观察不同时间间隔下,圆小囊不同部位胃泌素含量的变化情况。结果表明,圆小囊中胃泌素的表达量在巴氏杆菌和大肠杆菌刺激下,均有剧烈变化;而对于沙门氏杆菌和金黄色葡萄球菌的刺激变化不明显,趋势较为缓和。

兔圆小囊中SYP分布的免疫组化和免疫电镜观察

采用免疫组化和免疫电镜细胞化学的方法,对家兔圆小囊组织中的SYP阳性细胞和胞间阳性反应物的光镜和电镜超微结构特点进行了研究。结果显示圆小囊组织中大量分布着SYP阳性表达细胞和胞间阳性突触小泡样结构,这一结果为证明圆小囊作为外周神经免疫内分泌器官提供了形态学证据。

一种兔圆小囊抗菌肽对绿脓杆菌的抗菌作用及透射电镜观察

目的 探讨由兔圆小囊提取的一种抗菌肽对绿脓杆菌有无抗菌作用及其对细菌的损伤情况进行电镜观察.方法 培养绿脓杆菌并用提取的兔圆小囊抗菌肽进行处理,计算抗菌率,并制备电镜样品进行电镜观察.结果 在圆小囊抗菌肽浓度为100μg/ml、细菌浓度为1.0×10〈＇5〉CFU/ml条件下,圆小囊抗菌肽对绿脓杆菌ATCC27853株的杀菌率为74.2%,经兔圆小囊抗菌肽处理过的细菌菌体皱缩,膜通透性发生改变以及对鞭毛损伤,细菌表面形成囊泡样结构.结论 表明兔圆小囊抗菌肽对绿脓杆菌具有损伤作用.

不同细菌刺激下离体圆小囊中ecNOS信号的动态变化

揭示了在细菌刺激下在肠道黏膜免疫中的作用。用圆小囊离体培养大肠杆菌O78金黄色葡萄球菌、沙门氏杆菌和巴氏杆菌作为刺激物,观察在细菌刺激后不同时间间隔下,圆小囊的黏膜部、黏膜下淋巴组织的圆顶部和滤泡部ecNOS含量的变化情况。结果:在四种细菌刺激下,圆小囊中ecNOS的表达量均有变化,但是在统计学上的差异并不明显(P>0.05)。可以提示,在对抗感染过程中,ecNOS的表达量和造成感染的细菌抗原物质本身的性质没有直接关系。但是,各个实验组之间非统计学上的细微差别还是存在的,这可能与圆小囊器官在处理不同抗原物质上还存在一些差异有关。即使同种细菌在整个实验区间内,圆小囊不同部位的ecNOS表达量也有一些差别。提示由于不同细菌表面的抗原表位的不同,可能对圆小囊产生了不同的分子水平的刺激形式,从而产生了多种多样的变化形式和趋势。

兔圆小囊淋巴组织中神经内分泌细胞

为了确定兔圆小囊淋巴组织中神经内分泌细胞的存在,采用NSE、S-100蛋白、P物质、突触素及5-羟色胺单克隆抗体对其进行了免疫组织化学观察及超微结构观察。结果显示:圆小囊淋巴组织中各区均含有NSE、S-100蛋白、P物质、突触素及5-羟色胺免疫组织化学反应阳性细胞。这些细胞散在或成团分布,其形态、大小及分布部位与嗜银细胞一致。电镜观察发现,在所观察的各例圆小囊样品中,淋巴组织中均见到含有分泌颗粒的细胞。这些细胞单个散在或成团分布于淋巴细胞、网状细胞、巨噬细胞等之间;分泌颗粒成簇分布于胞浆内,它们形态不一,大小不等,直径约100-600nm,有的细胞内颗粒含有明显的核芯和晕轮。根据上述特点。认为这些细胞应归属于弥散神经内分泌系统(DNES)。

球虫感染后兔圆小囊病理组织学变化

为研究圆小囊在家兔球虫感染后的病理变化,试验收集自然感染病例的圆小囊,按HE染色石蜡切片方法制作病理组织切片,观察自然感染球虫后家兔圆小囊的组织病理学变化,并与正常圆小囊组织进行比较。结果表明,球虫感染病例的圆小囊集合淋巴小结生发中心反应活跃,粘膜杯状细胞和固有层散在淋巴细胞明显增多,淋巴小结周边及中心多见吞噬细胞成团聚集,或形成大的多核巨细胞,而集合淋巴小结结构基本完整。该研究结果说明圆小囊的局部免疫机制可能在机体抗球虫免疫中起着重要作用。