柔嫩艾美耳球虫棒状体颈部蛋白EtRON2基因的克隆及序列分析

预测并克隆柔嫩艾美耳球虫棒状体颈部蛋白2(EtRON2)基因,分析其结构特点及与顶复门其他虫属间的差异。本研究利用生物信息学和比较基因组学技术注释拼接得到柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)棒状体颈部蛋白2(EtRON2)的基因序列,用RT-PCR方法扩增出Etron2全长ORF;以E.tenella子孢子的基因组DNA为模板,用PCR方法成功扩增出Etron2ORF片段的gDNA序列片段。生物信息学分析结果显示,Etron2ORF片段的gDNA含有11个内含子,ORF全长为4 020bp,编码一段全长为1 339个氨基酸的多肽片段,与其他物种RON2的氨基酸序列相似性为15%～41%;Etron2基因在顶复门原虫中相对保守,与犬新孢子虫及弓形虫相似性最高,亲缘关系最近,Etron2的成功克隆填补了柔嫩艾美耳球虫在此方面研究的空白,为进一步研究其功能打下了基础。

小鼠金属硫蛋白基因在丝状体蓝藻中的表达及对重金属抗性的提高

应用蓝藻类金属硫蛋白启动子（ｓｍｔＯＰ）的金属诱导性，在丝状体蓝藻鱼腥藻（Ａｎａｂａｅｎａｓｐ．ＰＣＣ７１２０）中表达具有更高金属结合能力和对Ｃｄ２＋有选择特异性的小鼠金属硫蛋白基因（ｍＭＴⅠｃＤＮＡ）。构建穿梭表达载体ｐＫＴＭＲＥ并在大肠杆菌ＨＢ１０１中扩增，经三亲接合转移、链霉素筛选、ＤＮＡ和蛋白质印迹等方法鉴定得到稳定的转基因工程蓝藻。转基因蓝藻对金属离子吸附能力和较高重金属浓度下放氧活性测定表明，外源基因的表达提高了蓝藻对重金属离子的抗性，是野生蓝藻的１．５～２．０倍。

刚地弓形虫棒状体蛋白18及其作为基因工程疫苗候选分子研究进展

刚地弓形虫棒状体蛋白18(rhoptry protein18,ROP18)是由棒状体分泌的、属于棒状体蛋白2家族的一员,具有丝氨酸/苏氨酸激酶活性,在虫体入侵和毒力的发挥方面起着重要作用。论文就ROP18蛋白的结构、毒力和作用机制及其作为基因疫苗候选分子的研究现状进行综述。

诺氟沙星对海月水母螅状体Hsp70基因、GTP结合蛋白基因和氧化应激蛋白基因表达的影响

诺氟沙星(norfloxacin,NFLX)广泛应用于水产养殖中的鱼类细菌性疾病治疗。为探讨诺氟沙星对海洋生物的毒性作用,选择海月水母螅状体为受试生物,考察了不同浓度诺氟沙星和不同暴露时间对GTP结合蛋白(GTP binding protein)、氧化应激蛋白(oxidative stress protein)和热休克70 k Da蛋白(heat shock 70 k Da protein,Hsp70)表达量的影响。结果表明,NFLX对海月水母螅状体的48 h的半致死浓度(48 h-LC_(50))是415.1 mg·L^(-1),NFLX对海月水母螅状体的毒性属于低毒。随着NFLX浓度的升高和培养时间的延长,Hsp70基因在第7天浓度300 mg·L^(-1)时表达量受到显著性诱导(P<0.05),较对照组升高9.1倍;GTP结合蛋白基因和氧化应激蛋白基因的表达量都呈现先急剧升高后降低的趋势。2个基因均在第1天受到显著性诱导(P<0.05),分别在NFLX浓度100 mg·L^(-1)和300 mg·L^(-1)时表达量达到最大值,较对照组升高10.15倍和50.5倍。Hsp70基因、GTP结合蛋白基因和氧化应激蛋白基因在实验期间都对NFLX表现出较好的响应。

编码弓形虫ROP1蛋白基因的体外扩增、克隆及在E.coli中的表达

目的构建弓形虫棒状体蛋白（ＲＯＰ１）基因重组质粒并在Ｅ．ｃｏｌｉ中表达。方法用ＲＨ株接种小鼠，收集腹水，纯化速殖子，抽提基因组ＤＮＡ；据ＲＯＰ１基因序列设计合成一对引物，将上、下游引物分别引入ＥｃｏＲＩ，ＢａｍＨＩ酶切位点，用ＰＣＲ技术从ＲＨ株基因组ＤＮＡ中扩增编码ＲＯＰ１的基因片段，插入ｐＢＶ２２０质粒，转化大肠杆菌ＤＨ５α感受态细胞，于氨苄阳性ＬＢ培养平板上筛选阳性克隆，酶切鉴定；经温度诱导在Ｅ．ｃｏｌｉ中表达，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及免疫印迹分析。结果ＲＯＰ１基因体外扩增产物大小与预期值相符，约７５６ｂｐ；构建成功ｐＢＶ２２０－ＲＯＰ１重组质粒；ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、免疫印迹显示特异蛋白条带的分子量约４３ｋＤ，表达产量约占菌体蛋白１３．２３％。结论从弓形虫基因组ＤＮＡ中获取ＲＯＰ１基因，并成功构建ｐＢＶ２２０－ＲＯＰ１重组质粒，诱导表达ＲＯＰ１非融合蛋白，为进一步分离纯化、用于对弓形虫侵入机制及免疫特性的研究做好准备。

内含肽介导三段vWF基因真核细胞转移的翻译后连接及其功能性多聚体形成

vWF(von Willebrand factor)是一种超大分子质量的血浆多聚体糖蛋白,在血栓形成和生理凝血过程中发挥重要作用,其质和/或量的缺陷导致血管性血友病(VWD),由于VWD为单基因病,且vWF为分泌性蛋白,基于基因转移的基因治疗无需特异的靶器官,因此VWD特别适合于基因治疗,但vWF基因过大(8.4 kb),难以为多数病毒载体特别是优点较多的腺相关病毒(AAV)载体承载.运用内含肽(intein)的蛋白质反式剪接功能,研究了三重载体真核细胞共转断裂3段的vWF基因,以期通过转基因翻译后的蛋白质剪接作用形成完整的功能性vWF蛋白.将vWF的cDNA于满足剪接所需的保守性氨基酸Cys1099、Ser2004的密码子前断裂为3段,分别与2种不同的内含肽即Ssp DnaE内含肽和Ssp DnaB内含肽编码序列融合,构建到真核表达载体pcDNA3.1(+),得到3个分别融合内含肽的vWF片段基因真核表达载体,共转染培养的293细胞,通过瞬时表达,电泳观察培养上清中的vWF多聚体形态,分析vWF蛋白量和凝血Ⅷ因子(FⅧ)结合力;通过共转FⅧ基因,分析了培养上清中的FⅧ蛋白量及生物活性.结果显示,通过内含肽的蛋白质反式剪接作用,共转内含肽融合的三片段vWF基因细胞上清,表现与正常人血浆和转vWF基因阳性对照细胞相似的vWF多聚体模式和FⅧ结合力,而且可明显提高转FⅧ基因后表达的FⅧ蛋白的分泌量和活性,提示剪接vWF蛋白的FⅧ载体功能的恢复.结果表明,内含肽可作为一种有效的技术手段进行三重载体共转断裂的vWF基因,为进一步基于内含肽的三重AAV转断裂vWF基因应用于VWD基因治疗研究、克服AAV的容量限制提供了依据.

弓形虫自然弱毒株棒状蛋白2基因克隆及序列分析

应用PCR法从弓形虫QHO株速殖子基因组DNA中扩增ROP2的基因片断,连接到pMD18-T载体中,转化大肠杆菌JM109,经酶切及PCR鉴定后进行测序,并进行序列分析.结果表明,自然弱毒株的开放阅读框架(ORF)与ROP2基因已知序列(Z36906)的ORF具有97%的同源性,氨基酸序列具有95%的同源性.

弓形虫棒状体蛋白18的原核表达及免疫分析

目的克隆刚地弓形虫ROP18基因,进行原核表达及重组蛋白的免疫分析。方法提取弓形虫RH株基因组DNA,经PCR获得ROP18基因片段,经双酶切分别连入原核表达载体pET-28a(+)和pET-32a(+),构建重组表达载体pET28a-ROP18和pET32a-ROP18,并转化大肠杆菌BL21(DE3)。IPTG诱导表达后,收集菌体进行SDS-PAGE电泳及Western-blot检测。结果 PCR得到约1 665bp目的基因片段,单、双酶切及PCR鉴定结果显示成功构建重组表达载体pET28a-ROP18和pET32a-ROP18;经IPTG诱导后,ROP18基因在大肠杆菌中高效表达;SDS-PAGE电泳及Western-blot分析显示,pET28a-ROP18在相对分子质量约60kD的位置出现目的蛋白条带,pET32a-ROP18在相对分子质量约83kD的位置出现目的蛋白条带,均与理论值相符;Western-blot结果显示重组蛋白与弓形虫慢性感染小鼠血清具有特异免疫反应性。结论成功克隆和表达了ROP18基因,所表达的重组蛋白具有免疫效应,为其功能研究奠定基础。

荧光蛋白报告载体观察刚地弓形虫SAGl、MIC3、ROP2鸡尾酒DNA疫苗的表达及其免疫原性的研究

目的构建能同时表达多个基因的刚地弓形虫DNA鸡尾酒疫苗并初步观察其免疫原性。方法从基因组DNA扩增刚地弓形虫表面抗原(surface antigen,SAG)、微线体蛋白(microneme,MIC)和棒状体蛋白(rhoptry protein,ROP)基因片段,克隆到真核荧光表达载体pShuttle-CMV-MCS-EF1α-Am Cyan,pLVX-IRES-Zsgreen及pLVX-IRES-rfp中,构建pShuttle-SAG1,pLVX-Zsgreen-MIC3和pLVX-rfp-ROP2表达质粒。通过聚乙烯亚胺法用混合质粒转染293F细胞48 h,荧光显微镜下观察3个基因的表达情况。将30只C57BL/6雄性小鼠随机分为A、B、C组,分别肌内注射生理盐水(50μl)、pShuttle+pLVX-Zsgreen+pLVX-rfp混合空质粒(2μg/μl,各17μl)、pShuttle-SAG1+pLVX-Zsgreen-MIC3+pLVX-rfp-ROP2混合重组质粒(2μg/μl,各17μl)。免疫28 d后,ELISA检测血清抗刚地弓形虫IgG抗体水平,初步评价该疫苗的免疫原性。结果从刚地弓形虫基因组成功扩增出1、1.1及1.7 kb的SAG1、MIC3和ROP2序列。成功构建了pShuttle-SAG1、pLVX-Zsgreen-MIC3和pLVX-rfp-ROP2真核荧光表达质粒,转染293F细胞后观察到相应的蓝、绿、红报告荧光。免疫小鼠后28 d,ELISA测得A、B、C组IgG抗体的吸光度(A450值)分别为(0.620±0.029)、(0.741±0.040)、(1.561±0.131),C组显著高于A、B组(P<0.01)。结论刚地弓形虫SAG1、MIC3和ROP2基因混合重组质粒组成的DNA鸡尾酒疫苗能诱导小鼠产生良好的免疫原性,且多个荧光蛋白真核表达载体能够较好地指示目的基因的表达。

与胡萝卜胚胎发生相关的胚性细胞蛋白63 cDNA分离及其基因表达研究

以胡萝卜鱼雷形胚状体为材料，以λｇｔ２１０噬菌体为载体，构建了一个含有６．０×１０＾８个重组子的ｃＤＮＡ文库。用ＰＣＲ法扩增的长度为１．１ｋｂ的胚性细胞蛋白６３ＤＮＡ片段作探针，从ｃＤＮＡ文库中筛选出一个完整的ＥＣＰ６３ｃＤＮＡ克隆。

植物胚状体发生过程中主要代谢产物变化动态研究进展

从植物胚状体形成过程中生理生化变化角度 ,综述了国内外尤其是近 2 0年来该方面的最新研究进展。重点论述了该过程中的碳水化合物含量、氨基酸、蛋白质、核酸、植物激素、酶活性等与胚状体的发生发育关系密切的主要代谢物质的动态变化及其对胚状体发生的影响。对胚状体形成过程中生理生化变化研究前景做了展望 。

弓形虫复合抗原基因P30-ROP2体外扩增、克隆及真核表达重组质粒的构建

目的 构建弓形虫RH株 pcDNA3.1 P30 ROP2 真核表达重组质粒,为进一步表达及 DNA疫苗的研制作准备。 方法 用PCR技术从弓形虫RH分离株的基因组DNA中扩增编码 P30基因片段和棒状体蛋白(ROP2)的基因片段,重组入 pUC18克隆载体,然后将 pUC18 P30 ROP2中的 P30 ROP2 外源基因片段经酶切、连接等反应,亚克隆入pcDNA3.1真核表达载体,再经含氨苄青霉素的LB培养基筛选、酶切及PCR鉴定。 结果 从弓形虫RH株基因组中扩增出特异的 P30、ROP2 片段,克隆成功 pUC18 P30 ROP2 重组质粒;经亚克隆、筛选鉴定获得了 pcDNA3. 1 P30 ROP2重组表达质粒。 结论 成功构建了弓形虫 pUC18 P30 ROP2重组克隆质粒,亚克隆成功 pcDNA3.1 P30 ROP2真核表达重组质粒,为下一步DNA疫苗的研究奠定了基础。

HPV58 E6体外降解p53蛋白作用的研究

通过PCR方法从人乳头瘤病毒 5 8型 (HPV5 8)全基因克隆中扩增出HPV5 8E6基因片段 ,克隆至真核表达质粒pcDNA3的T7启动子下游 ,并在体外转录成mRNA后 ,在源自网织红细胞的翻译缓冲液中成功表达了含有生物素标记的HPV5 8E6蛋白 ,并在体外成功发现HPV5 8E6能够降解p5 3蛋白 ,从而推断结合并降解p5 3蛋白是其致癌作用的关键环节 。

基因外显子连接序列与相应内含子序列的相互作用

剪接后的内含子与相应mRNA序列的相互作用在基因表达调控过程中起着非常重要的作用。基于27个物种的核糖核蛋白基因序列,采用Smith-Waterman局域比对方法得到外显子连接序列与相应内含子序列的最佳匹配片段,分析了外显子连接序列上的匹配频率分布和匹配片段的序列特征。发现一些低等真核生物EJC结合区域的匹配频率明显低于其它区域,所有物种EJC结合区域的序列构成呈现出相对低的结构序。最佳匹配片段的平均长度和配对率分布与siRNA和miRNA的结合特征相同。推测EJC和内含子在与外显子序列结合的过程中存在相互竞争和相互协作的关系,内含子中部序列在基因表达调控过程中起着重要的作用。

甲状腺乳头状癌组织中TRAP1表达、BRAF V600E基因突变情况观察及其相关性分析

目的观察甲状腺乳头状癌(PTC)组织中肿瘤坏死因子受体相关蛋白1(TRAP1)表达、V-raf鼠类肉瘤滤过性病毒致癌基因同源体B1(BRAF)V_(600E)基因突变情况,并分析其相关性。方法 PTC组织100例份(A组)、甲状腺腺瘤组织38例份(B组)、结节性甲状腺肿组织38例份(C组),观察各组TRAP1蛋白表达及BRAFV_(600E)基因突变情况,分析TRAP1表达、BRAFV_(600E)基因突变两者间的相关性及其与PTC临床病理特征的关系。结果A、B、C组TRAP1阳性率分别为71.00%、13.16%、10.53%,BRAFV_(600E)基因突变率分别为52.00%、0、0,A组分别与B、C组比较,P均<0.05。BRAFV_(600E)基因突变与PTC患者年龄及肿瘤直径相关(P均<0.05)。A组中TRAP1表达与BRAFV_(600E)基因突变呈正相关(r=0.445,P<0.05)。结论 PTC组织中TRAP1阳性率及BRAFV_(600E)基因突变率升高,且TRAP1高表达与BRAFV_(600E)基因突变密切相关,两者可能共同参与了PTC的发生发展。

人睫状神经营养因子基因的克隆、表达、纯化和生物活性鉴定

目的表达和纯化人睫状神经营养因子(CNTF)并观察其生物学活性。方法用PCR方法构建人CNTF的结构基因,并克隆于pLy4原核表达载体中。将重组表达质粒pLy4-CNTF转化大肠埃希菌JF1125,30℃培养至A600(nm)达到0.6时,迅速升温至42℃诱导目的蛋白的表达。细菌经超声破胞,包涵体经变性、复性、透析和阴离子交换层析,获得纯化的CNTF重组蛋白。然后,用鸡胚背根神经节神经元细胞存活实验观察其生物活性。结果42℃诱导后可以获得Mr≈22.9×103的目的蛋白,Western印迹结果进一步表明,其具有人CNTF的抗原性。表达蛋白主要以不溶形式存在,占菌体蛋白的35%以上,表达产物经变性、复性,纯化后可获得纯度90%以上的目的蛋白。该重组蛋白能够促进鸡胚背根神经节神经元细胞的存活。结论在大肠埃希菌JF1125中成功表达了人CNTF分子,经变性、复性,纯化后得到具有生物活性的蛋白。

纳米载体逆转肺耐药蛋白介导肿瘤耐药研究进展

化疗是绝大多数肿瘤的主要治疗方法,但随着化疗失败案例的不断增加,人们发现肿瘤多药耐药multidrug resistance,MDR）可能是化疗失败的重要原因之一。近20年来,MDR的机制研究发展迅速,研究逐渐发现了MDR的相关基因与蛋白,其中肺耐药蛋白（lung resistance-related protein,LRP）及LRP编码基因的研究逐渐增多。

辣椒脉斑驳病毒的多基因联合检测与鉴定

【目的】辣椒脉斑驳病毒(Chilli veinal mottle virus,ChiVMV)是辣椒生产上危害严重的病毒,也是口岸检疫的重要病毒之一。本文旨在建立一种快速检测ChiVMV的多基因联合检测方法,实现ChiVMV的快速、准确鉴定。【方法】利用DAS-ELISA、RT-PCR方法对印度进境辣椒进行检测以确定是否携带有ChiVMV。根据ChiVMV外壳蛋白(coat protein,CP)和圆柱状内含体蛋白(cytoplasmic inclusion protein,CI)保守区域分别设计引物,筛选两个基因(CP和CI)的特异性引物组合,通过设定不同的引物用量组合以及对退火温度等条件进行优化,探索最佳的反应条件,建立多基因联合检测方法。利用建立的多基因联合检测体系对包含ChiVMV在内的辣椒病毒进行检测,以验证该体系特异性。同时对ChiVMV阳性样品的不同浓度cDNA进行扩增,测定其检测灵敏度。此外,对田间辣椒样本进行检测,以验证体系的实际应用效果。【结果】通过对印度进境辣椒的DAS-ELISA检测,发现样品提取液与ChiVMV呈阳性反应;利用CP861-F/CP861-R特异性引物对进行RT-PCR,扩增出与预期大小相一致的特异性片段,确认该批辣椒样品携带有ChiVMV。多基因联合检测体系中,应用引物对CP337-F/CP337-R、CI655-F/CI655-R分别扩增出长度为337、655 bp的特异性目的片段。经优化后的反应体系和程序为cDNA 2μL、CP337-F/CP337-R各0.625μL(10μmol·L-1)、CI655-F/CI655-R各1.375μL(10μmol·L-1)、2×PCR Master Mix12.5μL、ddH2O 6.5μL,退火温度50℃,共35个循环。建立的多基因联合检测方法具有良好的特异性和灵敏度,两个基因检测灵敏度均为10-4数量级。实际应用检测结果表明,该方法可从感染ChiVMV的样品中同时扩增出CP和CI的特异性目的片段。【结论】建立的多基因联合检测方法具有特异性强、灵敏度高、重复性好的特点,可为辣椒脉斑驳病毒的快速检测提供可靠的技术支持。

含弓形虫ROP1基因真核表达重组质粒DNA免疫小鼠的研究 IV.免疫鼠血清细胞因子IFN-γ、IL-2及NO的测定

目的 用 pc- ROP1重组质粒免疫小鼠 ,观察其对细胞因子 IFN-γ、IL - 2及 NO的影响。方法 碱裂解法大量制备 pc- ROP1质粒 DNA,经肌肉注射免疫 BAL B/ c小鼠 ,每只鼠注射 10 0μg,两周后同量加强免疫一次 ,以 pc DNA 3空质粒及生理盐水组为对照。分别于免疫后第 30天、5 0天、70天共三次用双夹心 EL ISA测定血清细胞因子 IFN-γ、IL - 2含量 ;酶法测定NO活性。结果 三次检测免疫组 IFN-γ、IL - 2及 NO含量均显著高于对照组 ,随着免疫时间的延长有增高趋势。结论 pc-ROP1重组质粒 DNA免疫小鼠 ,可刺激细胞因子 IFN-γ、IL - 2产生 。

弓形虫ROP2基因的克隆及原核表达

应用PCR技术从刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)RH株的基因组DNA中扩增编码棒状体蛋白ROP2(rhpotry protein 2)的部分基因,构建pGEX-KG-ROP2重组表达质粒,经酶切、PCR及DNA测序鉴定后,将阳性质粒转入E.coli BL21CodonPlus中,在IPTG诱导下表达,表达产物用SDS-PAGE和Western-blot分析鉴定。结果表明,扩增的ROP2基因与GenBank上发表的相应基因序列的同源性达99.9%,该基因可以在大肠杆菌中高效表达,表达的ROP2融合蛋白表观相对分子质量约为64000,可被兔抗弓形虫免疫血清识别。