猪圆环病毒Ⅱ型感染3D4/2细胞的转录组学分析

【目的】通过转录组测序筛选猪圆环病毒Ⅱ型(Porcine circovirus typeⅡ,PCV2)感染猪肺泡巨噬细胞系(3D4/2)差异表达基因,为了解PCV2感染宿主免疫细胞机制和抗PCV2感染药物研发奠定基础。【方法】用感染复数(multiplicity of infection, MOI)为1的PCV2 NJ2002株处理3D4/2细胞,利用Illumina NovaSeq 6000测序平台进行转录组测序。使用DeSeq 2.0软件进行差异表达基因分析,并对差异表达基因进行基因本体论(GO)、京都基因与基因组百科全书(KEGG)功能分析及转录因子靶向分析,选取免疫及凋亡相关基因进行实时荧光定量PCR验证,用Western blotting技术检测细胞内磷脂酰肌醇激酶(PI3K)及磷酸化胞内磷脂酰肌醇激酶(p-PI3K)、蛋白激酶B(Akt)和磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)蛋白表达水平。【结果】转录组测序结果显示,与对照组相比,PCV2感染组共获得713个差异表达基因,其中313个上调,400个下调。GO功能和KEGG通路富集分析显示,差异表达基因与免疫应答等相关,主要富集在细胞外基质受体互作通路、新陈代谢通路、HIF-1信号通路、病毒致癌作用、PI3K-Akt等信号通路。实时荧光定量PCR结果与转录组测序的基因表达水平保持一致。Western blotting检测结果显示,PCV2感染3D4/2细胞24 h后PI3K和Akt蛋白磷酸化水平显著升高(P<0.05)。转录因子靶向分析表明,差异表达基因与核转录因子Y亚基β(NFYB)和ETS转录因子(ELK4)联系紧密。【结论】PCV2可能通过PI3K-Akt信号通路影响下游炎症信号通路和凋亡信号通路增强自身复制能力。NFYB和ELK4转录因子在PCV2感染过程中可能发挥重要作用,可考虑作为抗PCV2药物靶点。研究结果为深入了解PCV2感染宿主免疫细胞机制和相关药物开发提供了理论基础。

一例猪圆环病毒Ⅱ型感染的实验室诊断报告

山东省某养猪场6~9周龄仔猪出现消瘦、黄疸、断续腹泻等症状,有的甚至陆续死亡。本研究通过对送检的死亡仔猪进行临床剖检观察,发现仔猪淋巴结肿大,呈现出猪圆环病毒病的典型特征。随后通过PCR鉴定和遗传进化分析确认病原,并通过ELISA方法检测仔猪群整体的抗体水平。结果显示,PCR鉴定结果为阳性,确认感染为猪圆环病毒Ⅱ型。进化树分析显示,该毒株与猪圆环病毒Ⅱ型浙江分离株的同源性高达99.43%,亲缘关系最近。对20份仔猪血清样品的ELISA检测结果表明,抗体水平离散度较大,提示可能存在野毒感染。综合分析上述结果,该猪群确诊感染了猪圆环病毒Ⅱ型。

四川省西昌市中小规模猪场圆环病毒Ⅱ型定殖情况调查与分析

[目的]了解猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)在四川省西昌市中小规模生猪养殖场中的流行情况,为制订综合防控策略提供依据。[方法]查阅中国知网数据库2012年以来有关西昌市PCV2流行病学监测的文献资料,分析PCV2的流行趋势。2023年5-9月,对西昌市部分中小规模生猪养殖场进行了生猪养殖现状调查,采用PCR检测方法对环境拭子进行圆环病毒Ⅱ型检测。[结果]文献资料显示,西昌市2008-2019年PCV2感染情况严重。检测结果显示,西昌市中小规模生猪养殖场圆环病毒Ⅱ型的环境定殖率为17.91%,环境易传播时间在6月和9月,规模较大的养猪场对环境安全的控制措施较好,通过氢氧化钠等进行环境消毒可以做好猪圆环病毒Ⅱ型的防控。[结论]西昌市圆环病毒Ⅱ型在环境中定殖情况较严重,动物疫病预防控制机构和生猪养殖者需有针对性地制定综合防控策略。

四川地区腹泻仔猪群猪圆环病毒Ⅱ型分子流行病学调查

为了解四川地区腹泻仔猪群中猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)的感染情况,本实验采用PCR方法对病料样品进行PCV2检测,并对分离的病毒DNA进行测序及生物信息学分析。结果显示PCV2感染率为71.6%(312/436),阳性结果中肠系膜淋巴结检出率为100%(312/312)。将扩增并测序的19条PCV2序列与Gene Bank中23株参考序列比较分析,构建了系统进化树,结果表明四川省腹泻仔猪群感染PCV2基因型主要为PCV2b、PCV2d基因型。针对PCV2高频突变ORF2基因编码的Cap蛋白氨基酸序列进行生物信息学分析,结果显示主要抗原表位氨基酸位点存在替换,进而引起抗原漂移,这可能促使PCV2免疫原性发生改变。本研究为四川地区PCV2的防制奠定了基础。

江苏省及周边地区猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)分子流行病学调查

为了解中国江苏省及周边地区猪圆环病毒Ⅱ型（ PCV2）的分子流行病学以及毒株的遗传变异情况，本研究运用PCR技术对来源于不同地区、不同猪场且PCV2检测为阳性的样品进行全基因组序列的扩增和测序，共获得18株PCV2全基因序列，并对所得到的毒株进行遗传变异分析。结果表明，18株毒株与国内外的参考毒株同源性为93．5％～99？7％，而ORF2核苷酸及其推导的氨基酸序列同源性分别为87．1％～99？9％和84．2％～99？6％，说明毒株存在一定程度的变异。系统进化树分析结果显示18株毒株中有5株PCV2a，7株PCV2b，6株PCV2d，其中20150429YC全长为1766 bp，与（HM038031．1 PCV2d等）参考毒株的同源性为100？0％，未发现PCV2c。同时，Cap蛋白的抗原表位和抗原性也发生了变化。说明，目前江苏省及周边地区猪群中PCV2感染较为普遍，PCV2的流行毒株以PCV2b基因型为主，PCV2d次之。

用PCR方法检测猪圆环病毒Ⅱ型

建立了一种能特异性地扩增猪圆环病毒 型 (porcine circovirus type 2 ,PCV- 2 )核酸片段的 PCR方法 ,从疑似断奶猪多系统衰竭综合征 (PMWS)的感染病例的淋巴结和脾脏中扩增出了预期长度的 PCV- 2 DNA片段 ,用限制性内切酶 Eco R 酶切鉴定了 PCR产物的特异性。 PCR产物的核苷酸序列分析表明 ,与已报道的 PCV- 2 (Gen Bank Ac-cession num ber AF0 2 72 17)相关区域的核苷酸序列同源性均大于 96 %。首次证实了我国猪群中存在 PCV- 2感染的PMWS。

猪圆环病毒Ⅱ型ORF3基因缺失突变毒株对仔猪的致病性及免疫原性研究

15头28～30日龄健康仔猪分成A、B、C3组（5头／组），分别肌注接种PCV2ORF3基因缺失突变毒株mPCV2-C、亲本毒株PCV2-CD以及生理盐水。用PCR-RFLP和PCR方法，分别从A组和B组屠宰仔猪的腹股沟淋巴结中特异性检测到mPCV2-C和PCV2-CDDNA，发现mPCV2-C能够在仔猪体内复制增殖。组织病理学结果表明；A组和B组腹股沟淋巴结、肝细胞及肺泡壁上皮细胞呈现病变，其中B组病变较严重，证实ORF3基因缺失未改变PCV2的组织嗜性。外周血T淋巴细胞亚群含量动态检测结果表明：与C组相比，A组、B组外周血CD3^＋、CD4^＋细胞百分含量降低，而A组CD8^＋细胞于免疫后第14天回升，高于B组和C组，表明ORF3基因缺失使病毒对T淋巴细胞亚群的影响有所减弱，并有诱导仔猪细胞免疫应答的趋势。上述结果提示ORF3缺失致使病毒的致病力有降低的趋势。PCV2抗体动态检测发现：mPCV2-C明显诱导了仔猪的体液免疫，具有良好的免疫原性。mPCV2-C可作为PCV2基因缺失疫苗候选毒株。

ORF3基因缺失对猪圆环病毒Ⅱ型感染复制能力的影响

设计1对特异性引物AF-P1/AF-P2,从疑似PCV2感染的病料中扩增获得1 767 bp的PCV2全基因组(命名为PCV2-CD),克隆至pMD18-T Simple载体构建重组质粒pTS-PCV2-CD。序列分析表明:PCV2-CD与GenBank中公布的12个PCV2毒株间的同源性高达95.0%~100%。用NcoⅠ酶切pTS-PCV2-CD获得4 459 bp线性目的DNA片段,补平CATG 4个碱基、连接环化构建ORF3基因插入缺失重组质粒pTS-PCV2-CD-C并测序。用SacⅡ酶切pTS-PCV2-CD-C,回收1 771 bp线性目的片段,体外连接环化构建了ORF3基因缺失突变毒株mPCV2-C。PCR-RFLP检测表明,在脂质体转染法转染mPCV2-C、培养并盲传4代的IBRS-2细胞中(PCV1阴性),特异性检测到mPCV2-C的DNA;电镜观察发现,在盲传6代的IBRS-2细胞胞核内观察到突变毒株的病毒颗粒。试验结果表明:ORF3基因缺失突变毒株mPCV2-C具有感染性,能够在IBRS-2细胞中复制增殖,证实ORF3基因不是PCV2复制的必需基因。

猪圆环病毒Ⅱ型Rep基因在PK15细胞中的表达及特性

为研究猪圆环病毒型(PCV2)Rep基因在PK15细胞中的表达特性,通过PCR方法克隆了PCV2杭州株(HZ0201)Rep基因全长945bp片段,与真核表达载体pCI-neo构建为重组质粒pCI-PCV2-Rep。pCI-PCV2-Rep质粒转染PK15细胞后48h,通过RT-PCR可检测到PCV2RepmRNA的转录;用猪PCV2多抗血清作间接免疫荧光试验,可检测到Rep基因表达产物。在表达量低的细胞中,PCV2Rep蛋白主要位于PK15的细胞浆,在表达量高的细胞中,细胞浆和细胞核中均含有大量的Rep蛋白,表明Rep对PK15细胞的细胞浆和细胞核的亲嗜性没有明显差别。

猪圆环病毒Ⅱ型TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

【目的】建立一种能在临床上快速、准确检测猪圆环病毒Ⅱ型(PCV-2)的TaqMan实时荧光定量PCR方法。【方法】根据GenBank中已公布的PCV-2陕西分离株的全基因序列,在PCV-2的ORF2核苷酸序列的保守区域,设计合成1条TaqMan探针和1对特异性引物;利用设计的引物扩增ORF2部分基因并鉴定后,回收PCR扩增产物,连接pMD19-T载体,转化DH5α大肠杆菌,涂布Amp+琼脂平板,挑取阳性克隆进行PCR及测序鉴定后提取质粒,作为荧光定量PCR的标准品;以标准品为模板建立检测PCV-2的TaqMan实时荧光定量PCR方法,并对该方法的灵敏度、稳定性和特异性进行评价;用建立的荧光定量方法对56份临床样品进行检测,并将检测结果与传统PCR方法进行比较。【结果】建立了PCV-2的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,其标准曲线的斜率为-3.383,R2=0.998,具有良好的线性关系;重复性试验结果表明,该方法循环数阈值Ct的变异系数(CV)为0.86%～1.02%,具有良好的稳定性;敏感性检测结果表明,该方法的最低检测限度为5.06copies/μL;特异性检测结果显示,该方法对猪圆环病毒Ⅰ型(PCV-1)、伪狂犬病病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪瘟病毒(CSFV)的检测结果均为阴性,对PCV-2标准品的检测结果为阳性,说明该方法具有较好的特异性。临床样品的检测中,所建立的Taq-Man实时荧光定量PCR检测方法的检出阳性率较传统PCR方法高14.3%。【结论】成功建立了PCV-2的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,该方法可用于临床上对PCV-2的检测。

9株猪圆环病毒Ⅱ型流行毒株全基因组克隆及序列分析

参考GenBank上发表的猪圆环病毒Ⅱ型（porcine circovirus2，PCV2）全基因组序列，设计一对引物，通过反向PCR技术扩增出9株PCV2流行株的全基因，并进行了序列测定与分析，结果表明：9株PCV2的基因组全长为1768bp或1767bp，同源性比较发现，本研究的9株PCV2之间的核苷酸同源性为95．6％～100％，与GenBank上已发表的PCV2分离株之间的同源性为95．1％～99．8％，与法国和新西兰代表株的亲缘关系较近，与美国、加拿大和澳大利亚代表株的亲缘关系较远。所得9株PCV2的ORF2核苷酸及其所推导的氨基酸序列同源性分别为93．1％～100％和91．8％～99．6％，存在较大的变异。

福州市猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)流行病学调查

对福州地区12个规模化养猪场的发病猪群进行了系统的流行病学调查,共采集64份组织病料,采用PCR方法进行圆环病毒Ⅱ型(PCV2)检测。现场调查发现共有7个场的猪群有圆环病毒Ⅱ型感染所致的特征性临床症状及病理变化;PCR检测31份病料呈阳性,阳性率46.9%;12个养殖场中7个为阳性,阳性率58.3%。根据临床及实验室检测结果证实福州市养猪场存在PCV2感染。

猪圆环病毒Ⅱ型Cap蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

以纯化复性的猪圆环病毒Ⅱ型（PCV2）Cap重组蛋白作为免疫原，按常规方法免疫BALB／c小鼠，取其脾细胞与SP2／0细胞融合，经间接ELISA筛选，获得了3株分泌PCV2-Cap蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞，分别命名为1C7A4、4F3F5和4G8F7，其染色体平均数为98～103，间接ELISA检测3株细胞培养上清效价分别为1：3125、1：3125、1：15625，小鼠腹水效价分别为1：390000、1：390000、1：1950000。ELISA结果显示，1C7A4、4F3F5和4G87F仅与融合表达的PCV2-Cap蛋白反应，而与PET-32a载体表达的蛋白不反应。相加ELISA结果显示3株单克隆抗体对应两个不同的病毒抗原位点。间接免疫荧光结果显示，1C7A4、4F3F5和4G8F7能与PCV2发生反应，而不与PCV1发生交叉反应。结果表明所获得的3株单抗是PCV2型特异性的，为PCV1和PCV2鉴别诊断方法的建立奠定了基础。

猪圆环病毒Ⅱ型在育肥猪机体内的残留时间检测

为弄清猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)对其正常生长及繁殖性能的影响,采用ELISA及PCR检测方法,对1例感染PCV病毒的长白猪进行PCV2的抗体水平检测及其在猪机体的残留时间研究。结果表明:ELISA检测,2月龄、4月龄、6月龄和8月龄的血清抗体值分别为0.445、0.522、0.396和0.225,PCV2抗体水平呈先增高后降低的趋势;PCR检测诊断,不同时期的检测结果均为阳性,但病情逐渐恢复到正常状态,生产性能有所下降。该猪感染PCV2后患病猪病情即使逐渐好转,但PCV2仍在机体内长期存留,使猪群长期不断地向外界排毒,给周围的环境造成严重危害。

猪圆环病毒Ⅱ型和巨噬细胞对体外培养仔猪淋巴细胞白介素-6和白介素-10及其受体表达的影响

选取5头猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)血清抗体阴性的普通断奶仔猪,无菌取其脾脏制成单细胞悬液后,分设淋巴细胞(L组)、淋巴细胞+PCV2(L+V组)、淋巴细胞+巨噬细胞(L+M组)和淋巴细胞+巨噬细胞+PCV2(L+M+V组)4组进行体外培养。分别在培养后0 h、6 h、12 h和24 h收获淋巴细胞及其上清液。用ELISA检测上清液中猪淋巴细胞白介素-6(IL-6)和白介素-10(IL-10)的含量,用RT-PCR检测淋巴细胞中IL-6、IL-6R、IL-10和IL-10RmRNA的表达。结果显示:与L组相比,L+V组中IL-6的含量在攻毒后24 h显著升高(P<0.05);PCV2在攻毒后12 h对IL-6RmRNA的表达呈显著抑制(P<0.05);PCV2在攻毒后6 h显著促进IL-10的表达(P<0.05)。上述结果表明,PCV2能促进淋巴细胞中IL-6和IL-10的表达;而巨噬细胞能抑制PCV2对淋巴细胞中IL-6表达的上调作用,同时协同PCV2促进淋巴细胞中IL-10及其受体持续性高表达,导致持续的免疫抑制,在PCV2的致病过程中扮演重要角色。

猪圆环病毒Ⅱ型和伪狂犬病弱毒疫苗体外共接种对猪外周血单个核细胞调节性细胞因子mRNA表达的影响

为分析猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)对伪狂犬病弱毒苗(PRV)免疫反应的影响。用Real-time PCR技术检测了仔猪外周血单个核细胞(PBMC)体外单接种和共接种PCV2与PRV后调节性细胞因子IL-4、IL-10、IL-12p40及IFN-γ的mRNA表达水平。结果表明:PRV能引起IL-4、IL-12p40与IFN-γ的mRNA表达上调,PCV2能引起IL-4、IL-10与IL-12p40的mRNA表达上调;而且,PCV2能抑制PRV诱导IL-4、IL-12p40及IFN-γ的mRNA表达上调,其中对IFN-γmRNA表达的抑制效果最为显著(P<0.05),提示PCV2可能会对PRV的细胞免疫反应产生不利影响。

猪圆环病毒Ⅱ型单克隆抗体的制备及应用

【目的】制备猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)Cap蛋白单克隆抗体,并对其进行鉴定和应用。【方法】以超离纯化的猪圆环病毒Ⅱ型作为免疫原,按常规方法免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)融合,经间接ELISA筛选获得了2株分泌PCV2-Cap蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞,分别命名为8-60和10-48,对其生物学特性进行鉴定,并将其作为一抗,建立了间接免疫荧光诊断方法。【结果】8-60和10-48的染色体数平均为98～105对,间接ELISA检测其细胞培养上清液效价分别为1∶16和1∶32,小鼠腹水效价分别为1∶3×212和1∶3×213,抗体的免疫球蛋白亚型均为IgM。间接免疫荧光结果显示,8-60和10-48能与PCV2发生反应;利用这种特性,建立了能诊断PCV2病原的间接免疫荧光诊断方法,实际应用结果表明,其诊断结果与PCR方法诊断结果基本一致,阳性和阴性的符合率分别为93.75%和100%。【结论】以制备的猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)Cap蛋白单克隆抗体为一抗,建立了间接免疫荧光诊断方法。

猪圆环病毒Ⅱ型SC株ORF3基因克隆及其编码蛋白的生物信息学分析

本研究根据GenBank登录的猪圆环病毒基因组序列(DQ180392.1)来设计引物,用PCR法扩增出PCV-2四川株(PCV-2SC)ORF3基因,并克隆到PMD19-T载体进行测序,同时利用在线生物信息学软件及数据库对ORF3基因及其编码蛋白进行生物信息学分析。研究结果表明,成功构建了命名为P-S-PCV-2SCORF3的重组质粒;测序结果得知PCV-2SCORF3基因全长315bp,共编码104个氨基酸;BLAST比对发现该基因与GenBank中国内外参考毒株核苷酸同源性在98%~100%之间。利用在线生物信息学软件对PCV-2SCORF3编码蛋白结构特征进行分析,发现该蛋白含有12个潜在的磷酸化位点,ORF3成熟蛋白有4个主要的抗原位点;亚细胞定位分析结果表明,编码蛋白主要存在于线粒体中和细胞核中并各占43.5%和34.8%,这证实了PCV-2SCORF3编码蛋白属于胞质蛋白,抗原区位集中于胞膜,有向胞核移动的趋势,功能强大,可能与细胞凋亡有关。疏水性分析发现,该编码蛋白具有一定的疏水性,与该蛋白的表面抗原决定族和膜蛋白中穿越膜的肽片段及该蛋白的高级结构的形成有关,预示其高疏水性区又与膜蛋白的跨膜区有...

猪圆环病毒Ⅱ型核酸诊断方法的建立和初步应用

根据Genebank上已发表的猪圆环病毒Ⅱ型(PCV-2)序列设计1对引物PL1/PL2,通过对反应条件的优化,建立了有效的猪圆环病毒Ⅱ型的PCR诊断方法,并对沪郊1株PCV-2分离毒进行了检测和测序鉴定,结果显示此株分离毒为PCV-2病毒。结果显示:新建立的PCV-2的PCR诊断方法具有快速、准确等优点。

猪圆环病毒Ⅱ型特异抗体检测间接ELISA法的建立

利用巴斯德毕赤酵母表达的猪圆环病毒2型株Cap蛋白为包被抗原,成功地建立了一种检测血清中PCV-2特异抗体的间接ELISA方法.确定了血清样品阴、阳性判定标准.临床检测结果表明,自建ELISA试剂盒具有较高的敏感性和特异性.