腺病毒携带EGFP基因经完整圆窗膜转导豚鼠耳蜗的实验研究

目的研究腺病毒携带目的基因经完整圆窗膜途径耳蜗转导的可行性及安全性,为内耳基因治疗提供实验基础和理论依据。方法20只白色红目豚鼠,术前及术后分别行听性脑干反应(ABR)检查。实验组(12只)以重组腺病毒携带的增强型绿色荧光蛋白基因(enhanced green fluorescent protein,EGFP),对照组(8只)以人工外淋巴液注入豚鼠圆窗龛内。分别于术后5天、14天取双侧耳蜗标本做基底膜铺片,耳蜗冰冻切片观察。结果于圆窗龛内注入腺病毒携带目的基因的转导方法对听力无明显影响。转染耳蜗及对侧耳蜗内目的基因呈广泛表达。5天组表达产物最高,14天组逐渐降低。对照组耳蜗未见EPFP表达。结论于圆窗龛内注入腺病毒携带目的基因转导的方法对耳蜗无明显毒害作用,且能够将目的基因成功转导至双侧耳蜗组织并广泛表达。

耳后入路圆窗膜显微注射小鼠耳蜗基因转染新途径的研究

目的研究腺病毒携带目的基因经小鼠耳后入路圆窗膜显微注射途径耳蜗转导的可行性,为以小鼠作为动物模型的内耳基因治疗提供实验基础和解剖学依据。方法12只C57BL/6J小鼠分为2组,实验组(8只)以重组腺病毒携带的增强型绿色荧光蛋白基因(enhanced green fluorescent protein,EGFP)、对照组(4只)以人工外淋巴液经耳后入路圆窗膜显微注射注入耳蜗内。分别于术后5、14天取双侧耳蜗标本做基底膜铺片,在激光共聚焦显微镜下观察GFP表达。结果术后动物存活10只(每组死亡1只)。实验组转染后耳蜗底回基底膜及螺旋神经节上目的基因有表达,14天组强于5天组。对照组耳蜗未见荧光表达。结论耳后入路操作简单、损伤小、易于暴露圆窗龛。耳后入路圆窗膜显微注射腺病毒携带目的基因转导的方法能够将目的基因成功转导至耳蜗组织并表达。

经完整圆窗膜途径EGFP基因在大鼠耳蜗中的表达

目的 研究经完整圆窗膜途径进行耳蜗基因转导的可行性及安全性 ,为内耳基因治疗提供实验基础和理论依据。方法 2 4只SD大鼠术前及术后分别行听性脑干反应 (ABR)检查。实验组 ( 18只 )用阳离子脂质体携带的增强型绿色荧光蛋白 (enhancedgreenfluorescentprotein ,EGFP)基因 ,对照组 ( 6只 )用生理盐水 ,注入置于圆窗龛处的明胶海绵内。分别于术后 3、7、14天取双侧耳蜗标本做基底膜铺片观察。结果 于圆窗龛处放置明胶海绵的转导方法对听力无明显影响。转染耳蜗呈明显的绿色荧光。 3天组表达产物最高 ,7天组逐渐降低 ,14天组更弱。对侧及对照组耳蜗均未见荧光表达。结论 于圆窗龛处放置明胶海绵进行基因转导的方法对听力没有影响 ,且能够成功转染耳蜗组织 。

明胶海绵和透明质酸在地塞米松圆窗灌注中对豚鼠圆窗膜形态及功能的影响

目的圆窗分别放置明胶海绵与透明质酸,观察地塞米松圆窗灌注对豚鼠圆窗膜形态及功能影响。方法①36只豚鼠随机分为3组,Ⅰ组圆窗龛放置明胶海绵并在圆窗置管;Ⅱ组圆窗龛放置含2%透明质酸明胶海绵置管,Ⅲ组圆窗龛放置明胶海绵置管,Ⅱ组和Ⅲ组经圆窗置管向圆窗灌注地塞米松7d后。用光学显微镜和扫描电镜观察圆窗膜变化。36只豚鼠中随机取6只左耳作为正常对照(Ⅳ组)。②另取18只豚鼠,按给药时间分为1、4、7d3组,每组各取3只分为实验组和对照组,实验组圆窗放置透明质酸明胶海绵,对照组圆窗放置明胶海绵。各组经圆窗置管圆窗灌注地塞米松后,用LC-6A高效液相色谱仪测定外淋巴液中地塞米松浓度。结果光镜和扫描电镜检查发现Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ组圆窗膜厚度和形态与正常对照Ⅳ组比较无明显差异(P>0.05);圆窗放置透明质酸明胶海绵后豚鼠外淋巴液中地塞米松含量明显高于明胶海绵组(P<0.01)。结论①圆窗放置明胶海绵和透明质酸对豚鼠圆窗膜形态无明显影响。②透明质酸明胶海绵能提高地塞米松的圆窗膜通透性。

经大鼠圆窗膜bFGF基因转导防治爆震性聋的实验研究

目的以阳离子脂质体介导bFGF(basic fibroblast growth factor,碱性成纤维细胞生长因子)基因,经完整圆窗膜途径转染爆震后的大鼠耳蜗,观察bFGF的表达及其对爆震性聋的防治作用。方法 SD大鼠30只,随机分为四组:空白对照组(n=6),仅接受155dB SPL脉冲噪声暴露20次;EGFP(enhanced green fluorescent protein,增强型绿色荧光蛋白)对照组(n=8),噪声暴露后即刻导入EGFP/阳离子脂质体复合物;bFGF治疗组(n=8),噪声暴露后即刻导入EGFP-bFGF/阳离子脂质体复合物;bFGF保护组(n=8),噪声暴露前3天导入EGFP-bFGF/阳离子脂质体复合物。各组动物分别于噪声暴露前及噪声暴露后1天、3天、7天、14天行ABR阈值测试。噪声暴露后14天耳蜗取材做基底膜铺片,荧光显微镜观察,并做bFGF免疫荧光染色验证bFGF的表达。结果爆震后1天,bFGF保护组ABR阈值低于空白对照组及EGFP对照组,且差异均有显著性意义(P<0.05)。爆震后3天、7天和14天,bFGF治疗组及bFGF保护组ABR阈值均低于两个对照组,且差异有显著性意义(P<0.05)。而爆震前及爆震后bFGF治疗组和bFGF保护组间的ABR阈值差异均无显著性意义(P>0.05)。术后14天,荧光显微镜直接观察及bFGF免疫荧光染色均检测到毛细胞内有bFGF的定位表达。结论将阳离子脂质体介导的bFGF基因经圆窗膜导入大鼠耳蜗能够表达,表达产生的bFGF对爆震所致的耳蜗损害有一定的保护作用,它能够减轻爆震后听。

圆窗膜和圆窗龛膜的显微外科解剖及其临床意义

圆窗膜是中耳和内耳的屏障,具有维持耳蜗正常生理功能的作用,对许多耳科疾病如中耳炎、耳硬化症、耳外伤、先天性发育不全、突发性聋等都很重要。自膜破裂作为一种疾病提出后,Gacek提出单孔神经切断治疗位置性眩晕及经圆窗行耳蜗埋植术的开展,从而引起人们对圆窗膜的注意。在圆窗龛区有两个膜,一个是圆窗膜(Round Window Membrane,RWM),另一个是圆窗龛膜(Round Window NicheMembrane,RWNM),后者在手术时多数情况下易识别,但可能与RWM混淆。本文从临床角度观察人的圆窗膜、圆窗龛膜及邻近解剖关系,并讨论其临床意义。

人工耳蜗术中圆窗膜与圆窗龛电诱发听性脑干反应比较分析

目的探讨人工耳蜗植入术中不同刺激位置对电诱发听觉脑干反应(EABR)波形的影响。方法选取CT,MRI影像耳蜗形态正常的双侧感音神经性耳聋患30例,均为单侧植入。植入术中先后电刺激术耳圆窗龛与圆窗膜,比较分析刺激强度在1.0-3.0mA之间时2种不同位置处EABR阈值以及Ⅲ波、Ⅴ波引出率、潜伏期和波间期的差别。结果①EABR阈值在圆窗龛刺激中为1.745±0.09692 m A,圆窗膜刺激中为1.275±0.1160 m A(P<0.05)。②EABRⅢ波检出率圆窗龛刺激为66.667%,圆窗膜刺激为93.333%(P<0.05)。③Ⅲ波潜伏期圆窗龛刺激为2.215±0.04600ms,圆窗膜刺激为2.180±0.03566ms。④EABRⅤ波圆窗龛刺激检出率为50%,圆窗膜刺激检出率为93.333%(P<0.05)。⑤EABRⅤ波潜伏期圆窗龛刺激为4.059±0.08122ms,圆窗膜刺激为3.951±0.06329 ms。⑥EABRⅢ-Ⅴ间期圆窗龛刺激为1.880±0.06285 ms,圆窗膜刺激为1.807±0.04218 ms。结论圆窗膜刺激EABR波形稳定,可重复性强,受肌电反应干扰小,引出率高,以较小的刺激强度能取得较好的波形,对听觉传导通路的评估更为准确。

体外圆窗膜实验装置的建立与质量控制

目的制备体外圆窗通透实验装置,并进行质量控制,为经中耳-内耳间跨膜药理学研究提供技术基础。方法模拟中耳腔及鼓阶外淋巴腔环境,构建由活体豚鼠的圆窗膜组织、Franz扩散池(玻璃/聚乙烯组件)组成的体外圆窗通透实验装置;检测该装置有无渗漏;以亚甲基蓝为模型药物,检测3 h内的药物通透量。结果本研究设计并构建的圆窗通透实验装置符合药理学实验的基本要求,检测该装置性能良好、无渗漏。经连续3 h观察,亚甲基蓝的累积释放量符合零级释放方程。结论成功构建的体外圆窗通透实验装置符合药学实验质控标准。本装置的建立为中耳-内耳之间的跨膜给药研究提供了实验基础。

9型腺相关病毒经圆窗膜转导小鼠耳蜗两种方式的对比研究

目的通过圆窗膜显微注射和完整圆窗膜途径转导小鼠内耳携带GFP的9型腺相关病毒(adeno-asso-ciated virus,AAV),比较两种方式的可行性、转染效率以及对听力的影响。方法 18只C57BL/6小鼠,随机分为圆窗膜显微注射组和完整圆窗膜途径组,术前均行听性脑干反应(auditory brain response, ABR)测听,术后两周行ABR测听后取双侧耳蜗基底膜铺片及冰冻切片观察GFP表达情况。结果两种转导方法对小鼠听力均无显著影响,圆窗膜显微注射组转染耳蜗内毛细胞GFP可见表达,转染效率由底转到顶转逐渐降低,无毛细胞损伤,经完整圆窗膜途径转染耳蜗未见GFP表达。结论 9型AAV难以通过完整圆窗膜,通过显微注射方式能够将目的基因高效转导内耳,对内毛细胞有选择特异性,且对听力影响较小,是一种安全有效的内耳转导方式。

圆窗膜的解剖结构、生理功能及临床意义

圆窗膜是位于中耳与内耳之间的唯一的膜性结构 ,被称之为第二鼓膜。圆窗膜由三层膜结构组成外层为中耳粘骨膜延续的上皮细胞 ,中间层为胶原纤维和弹力纤维 ,内层为被覆鼓阶的细胞层延续 ,其在维持正常听力中起着重要的作用。圆窗膜破裂后对听力会产生一定的影响。尽管圆窗膜具有三层结构 ,其仍具有半透膜性质 。

胎儿圆窗膜超微结构的观察

圆窗膜是中耳与内耳间联系的重要结构,但至今未见到有关胎儿圆窗膜超微结构及其胚胎发育规律的报道,本文旨在填补此项空白并探讨其生理功能。取水囊引产正常新鲜胎儿圆窗膜11例(16侧),胎龄为第四至第九个月。圆窗膜经4%戊二醛固定后制成超薄切片,透射电镜观察。第五至第九个月胎儿圆窗膜分三层:1.外上皮层面对鼓室,有1~3层鳞状细胞,游离面有微绒毛,细胞间以指状突相嵌合,桥粒丰富,基膜完整。

人胎儿圆窗膜超微结构的观察

本研究用透射电镜观察16侧第4~9个月胎儿圆窗膜的超微结构。圆窗膜分3层:1.外上皮层面对鼓室,为鳞状上皮,4个月胎儿无上皮层;2.中层为结缔组织;3.内层面对鼓阶,由间皮细胞组成。随着胎龄增加,上皮层变薄;成纤维细胞转变为纤维细胞;胶原纤维和弹力纤维明显增多。8个月胎儿圆窗膜基本上具有成人的形态结构,起屏障作用,阻止鼓室内物质任意经过圆窗膜;具有抗压力以及作为外淋巴缓冲结构等重要听觉生理功能。

经圆窗膜鼓阶显微注射腺相关病毒转染小鼠耳蜗的研究

目的探讨经圆窗膜鼓阶显微注射携带绿色荧光蛋白基因的重组腺相关病毒AAV2/9-GFP转染小鼠耳蜗的可行性,为应用腺相关病毒治疗遗传性聋提供实验基础。方法将24只野生型C57BL/6J小鼠随机分为三组:实验组(12只)和人工外淋巴液组(6只)分别经耳后径路通过圆窗膜向鼓阶内注射2μl AAV2/9-GFP或人工外淋巴液;空白对照组(6只)正常饲养,不做任何处理。于术后21 d进行ABR测试,之后取耳蜗基底膜行免疫荧光染色,激光共聚焦显微镜观察。结果术后实验组和人工外淋巴液组术侧耳ABR各频率反应阈均不同程度升高,与空白对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05),实验组与人工外淋巴液组比较差异无统计学意义(P>0.05)。实验组转染AAV2/9-GFP后可见基底膜底回至顶回均有GFP表达,转染阳性细胞呈逐渐减少的趋势,底回、中回及顶回的内毛细胞平均转染效率分别为82.7%、75.0%、44.7%,底回与顶回、中回与顶回转染效率比较差异均有统计学意义(P<0.05),底回与中回比较差异无统计学意义(P>0.05)。AAV2/9-GFP主要转染内毛细胞,外毛细胞未见GFP表达;实验组对侧耳、人工外淋巴液组及空白对照组均未见GFP表达。结论携带目的基因的腺相关病毒载体可通过经圆窗膜鼓阶显微注射的方法转染至小鼠耳蜗内毛细胞并表达。

豚鼠圆窗膜破裂对耳蜗功能的影响及组织愈合过程

用脑干诱发电位的Click音观察豚鼠圆窗膜损伤前后听力的变化,并观察了豚鼠圆窗膜的正常组织结构及损伤后的组织愈合过程。结果发现,圆窗膜由内中外三层构成。破裂后听阈提高了9.34dB,7～9天基本恢复正常,14天后完全恢复,与圆窗膜组织愈合过程一致。

离体圆窗膜对地塞米松不同制剂的通透性

为制备离体圆窗膜试验模型，分析海藻酸钠（alginate sodium，ALG）、羧甲基甲壳胺（carboxymethyled chitosan，CHI）2种缓释剂对地塞米松（dexamethasone，DXM）透膜释放的效力。模拟中耳及外淋巴腔环境，设计圆窗膜离体试验模型；制备不同浓度的海藻酸钠和羧甲基甲壳胺的地塞米松磷酸钠组。利用圆窗膜离体试验模型，于9h内的不同时间点采样，用高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法测定浓度，计算地塞米松对圆窗膜的累积通透量并进行方程模拟。发现对照组在给药后3h内迅速通透圆窗膜，3h后接近平衡；25g／L海藻酸钠分别与4g／L或6g／L羧甲基甲壳胺的配方缓释作用最强（P〈0．01）；单独应用25g／L海藻酸钠的缓释作用次之；单独应用4g／L羧甲基甲壳胺仅具有微小促渗作用。

人圆窗膜超微结构研究

该文报告7例14耳圆窗膜用透射和扫描电镜观察的结果,人圆窗膜有三层,外层上皮衬于中耳腔,中间为结缔组织,内层上皮贴近内耳。有形态学证据提示,这些层次参予内耳物质的吸收和分泌活动。圆窗膜平均厚度70μm,不随年龄变化而改变。