圆红冬孢酵母突变株利用糖蜜生产类胡萝卜素

糖蜜是制糖工业在滤清、浓缩和结晶甘蔗汁后所留下的废料,富含蔗糖、葡萄糖及多种微量元素。圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)是一种能高产油脂和类胡萝卜素的非模式酵母。以甘蔗糖蜜为唯一碳源,通过定向驯化筛选,获得了耐受高浓度糖蜜的R.toruloides驯化株MM10、MM14、MM18。在YNL、TM和MNL培养基中,这3株突变菌株能高效生产圆酵母红素、圆酵母素和β-胡萝卜素等类胡萝卜素。结果表明,用甘蔗糖蜜作为唯一营养源培养R.toruloides,摇瓶培养MM10突变株最终分别收获了质量浓度为3.54 mg·L^(-1)圆酵母红素、2.94 mg·L^(-1)圆酵母素和4.10 mg·L^(-1)β-胡萝卜素,可为甘蔗糖蜜的再利用和基于R.toruloides来源的类胡萝卜素原料生产提供了新思路。

植物源神经酸在圆红冬孢酵母中的异源表达

文章以产油酵母圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)为宿主,测试来源于文冠果(Xanthoceras Sorbifolium)脂肪酸延长酶相关基因的异源表达。围绕文冠果的神经酸合成系统在R.toruloides中的重构可行性,调取文冠果的神经酸合成基因,并根据R.toruloides的密码子偏好性加以优化,构建表达载体。通过农杆菌介导将表达载体转化至R.toruloides单倍体菌株NP11中,并从表型、基因型及蛋白水平等方面入手验证脂肪酸延长酶FAE基因的表达。

圆红冬孢酵母利用废糖蜜合成微生物油脂及类胡萝卜素

圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)具有底物谱广、性能稳定和细胞含油量高等优点,是优良的微生物油脂生产工厂,而且具有高产类胡萝卜素的能力,极具开发潜力。为提高微生物的油脂和类胡萝卜素产量并降低成本,通过糖蜜与葡萄糖共添加的双糖策略、不外源添加有机氮源、限制磷酸盐的方式,成功开发R.toruloides Z11利用廉价碳源糖蜜高产微生物油脂和类胡萝卜素的新型发酵方式。与单一葡萄糖作为碳源发酵培养相比,结合多种发酵策略,可使R.toruloides Z11生物量(OD_(600))提升至379.0±0.3,提高了2.72倍,油脂质量分数达到68.9%、类胡萝卜素含量达到2.58 mg/g。

圆红冬孢酵母发酵菊芋块茎产油脂的研究

研究了圆红冬孢酵母Y4发酵菊芋块茎,菊芋品种及其处理方法对发酵产油的影响。结果表明,菊芋浸提汁、酸水解液或菊芋浆均可直接被圆红冬孢酵母Y4利用,发酵积累油脂,但白皮菊芋比紫皮菊芋更有利于油脂发酵。发酵菊芋浸提汁或酸水解液时,无需添加外源营养物,干菌体油脂含量可达到40%(w/w);发酵菊芋浆时,白皮菊芋转化率达到12.1g油/100g去皮干菊芋。菊芋油脂发酵产品主要以16碳和18碳系脂肪酸为主,与常规植物油的脂肪酸组成相似,可作为制备生物柴油的新型替代原料。

圆红冬孢酵母菌发酵产油脂培养基及发酵条件的优化研究

采用均匀设计和单因子试验法,系统考察了圆红冬孢酵母菌(Rhodosporidiumtoruloides)在不同碳氮比条件下产油发酵情况以及添加无机盐对产油发酵的影响,通过均匀设计软件对二次多项回归方程求解及单因素分析得知在培养基组成分别为葡萄糖70g/L,硫酸铵0.1g/L,酵母粉0.75g/L,磷酸二氢钾0.4g/L,七水硫酸镁1.5g/L,初始pH6.0,在灭菌(121℃15min)后添加ZnSO41.91×10-6mmol/L、CaCl21.50mmol/L、MnCl21.22×10-4mmol/L、CuSO41.00×10-4mmol/L。发酵摇瓶装液量为250mL三角瓶装培养基50mL,接种量为10%(种龄28h)。在上述条件下,30℃振荡(200r/min)培养120h,所得菌体油脂含量高达76.1%,脂肪得率系数可达22.7。

大孔树脂分离纯化粘性红圆酵母产β-胡萝卜素

利用大孔树脂对粘性红圆酵母RM-1产β-胡萝卜素进行分离纯化,得到最佳的吸附和解吸条件。结果表明,最佳吸附树脂为X-5树脂,最佳洗脱剂为乙醚,最佳分离纯化工艺参数为上样质量浓度111.82μg/mL、吸附流速1mL/min、洗脱流速0.5mL/min。经纯化,β-胡萝卜素纯度达到33.29%,与未纯化相比,提高了6.87倍。

圆红冬孢酵母在酒精废水中发酵产油

高浓度有机废水大量排放,是造成我国水体污染的主要原因。面临石油储量的不断减少,能源需求的不断增长,需要发展可再生能源。生物柴油具有可再生、环保性以及可替代现有石化柴油的特点,引起了世界许多国家的高度重视,成为最受欢迎的石化柴油替代品。废水微生物产油,一方面能够处理废水起到保护环境的作用;另一方面因为能够生产油脂而解决人类资源短缺的问题。对圆红冬孢AS 2.1389进行研究,结果表明适宜处理条件为:进水COD浓度为废水原液的1/2,pH值不调节,发酵时间为96 h,接种量为5%。该条件下可使酒精废水COD的去除率达72.3%,菌体油脂含量为31.9%,油脂成分主要为C15(十五酸)～C18(硬脂酸、油酸和亚油酸等)的脂肪酸,适合生产生物柴油。对圆红冬孢酵母进行驯化,驯化后废水COD降解率达到(75.9±0.8)%,菌体油脂含量达到(39.8±4.4)%。

响应面法优化产油圆红冬孢酵母发酵培养基的研究

采用部分因子设计筛选出影响产油圆红冬孢酵母生物量积累的主要因素为葡萄糖、酵母粉和硫酸铵。在此基础上利用响应面实验设计对主要影响因素进行分析,并预测出圆红冬孢酵母生物量产量最优的培养基组成。最后确定的最佳发酵培养基组成为(g/L):葡萄糖71.1,酵母粉2.19,硫酸铵2.83,磷酸二氢钾1,硫酸镁1,此时圆红冬孢酵母生物量为6.67g/L,与预测值6.62g/L非常接近,证实了该模型是合理的。

圆红冬孢酵母类胡萝卜素代谢流的阻遏及走向

以野生型的圆红冬孢酵母为出发菌株,利用常压室温等离子体(ARTP)进行诱变,筛选获得4株类胡萝卜素缺陷型圆红冬孢酵母突变株。对圆红冬孢酵母的野生型及类胡萝卜素缺陷型菌株进行发酵,并对其生物量、类胡萝卜素含量、油脂含量、脂肪酸组成及有机酸含量进行测定。结果表明,利用ARTP技术能够有效实现对类胡萝卜素代谢流的阻遏,突变株类胡萝卜素质量浓度较野生型菌株降低了70%。碳流代谢走向分析结果表明,类胡萝卜素代谢途径的阻断并未导致油脂合成途径的加强,反而造成圆红冬孢酵母生物量和油脂合成能力的分别下降48%和40%,对胞内脂肪酸组成也有较为显著的影响,其中突变株W-4所产硬脂酸、亚油酸及油酸质量分数较野生型菌株分别下降了60%、42%和77%。类胡萝卜素合成途径阻断后,碳流主要指向有机酸合成,其中乙醛酸、乳酸、苹果酸及琥珀酸变化较为显著。类胡萝卜素缺陷型突变株中大量积累的类胡萝卜素合成前体主要流入了有机酸合成途径中。

金属膜在圆红冬孢酵母发酵液菌体分离中的应用

针对产油微生物细胞采收难度大,能耗高的问题,采用金属超滤膜系统对圆红冬孢酵母发酵液进行浓缩和膜污染后通量恢复研究。结果表明在过滤时间2h、过滤温度35℃、p H 6.3、膜面流速5m/s、系统压力0.4MPa时,圆红冬孢酵母分离效果最佳,在此条件下进行过滤,平均膜通量达120L/m2·h,与之前相比提高了20-37%。膜污染后先使用添加1%Na OH和0.5%EDTA的碱溶液清洗,然后使用清水洗至中性,再使用添加0.5%HNO3的酸溶液清洗,能够使金属膜通量恢复率达到99%以上。以上结果表明,金属膜可以应用于圆红冬孢酵母发酵液的浓缩,能够简化操作步骤、提高生产效率。

圆红冬孢酵母α-亚麻酸高产菌株的选育

利用LiCl和紫外线诱变圆红冬孢酵母AS 2.1389,以红四氮唑(TTC)为显色剂通过96孔板进行初筛;通过气相色谱(GC)进行复筛,得到突变株D2。与原始菌株相比,D2的脂肪酸含量提高了72%,α-亚麻酸(GLA)含量提高了259%,达到0.508g/L。经传代培养,其GLA产量稳定。

圆红冬孢酵母类胡萝卜素合成突变菌株的筛选

利用等离子体诱变与亚硝基胍诱变的方法,构建油脂合成缺陷型菌株或类胡萝卜素合成突变菌株。通过乙酰辅酶A流量的分配,验证油脂合成途径是否为乙酰辅酶A节点处优势分支途径。利用等离子体与亚硝基胍进行复合诱变,等离子体诱变的致死率为95%,亚硝基胍诱变的致死率为90%时,筛选得到圆红冬孢酵母颜色突变株XP-1、XO-3、XY-4和XR-2。突变株的油脂含量、脂肪酸的成分和类胡萝卜素的含量测定结果显示,XP-1、XO-3、XY-4等3个菌株的类胡萝卜含量低于出发菌株NP11,类胡萝卜素的代谢途径受到一定破坏,但类胡萝卜素的降低并没有促进油脂合成的增加。XR-2菌株的油脂含量下降,类胡萝卜素含量相应升高,最高达到0.77μg/g。结果表明,乙酰辅酶A是一个弱刚性节点,油脂合成途径为此节点的优势分支途径,其产物的减少可有效增加类胡萝卜素合成的增加。

圆红冬孢酵母高效电转化条件的优化

【目的】建立圆红冬孢酵母的高效电转化方法,为利用圆红冬孢酵母重组表达功能性基因提供方法基础。【方法】以圆红冬孢酵母作为受体菌,将具有潮霉素抗性标记的改造质粒p CAMBIA1301-KCS通过电转化的方式导入到受体菌中,研究酵母细胞培养时间(2、8、14、20、26 h)、电击电压(1、1.5、2.0、2.5、3.0 kV)、前处理剂种类(DTT、LiAc、CaCl2、H2O)对转化效率的影响。【结果】当培养时间为20 h [培养液D(600 nm)约为1.6]、电击电压为2.0 kV、前处理试剂为DTT时,该系统转化率最高可达到20.8×104 cfu/μg。【结论】采用电击法将环状质粒转化入圆红冬孢酵母,能够成功实现外源基因的遗传转化,采用优化的转化条件可以获得较高的转化效率,是过去相关报道最高转化率的100倍。

粘性红圆酵母XJU-1产β-胡萝卜素的研究

目的:从粘性红圆酵母Rhodotorula mucilaginosaXJU-1中提取β-胡萝卜素并对其特性加以研究。方法:采用酸热法对发酵产物破壁,用丙酮∶石油醚(1∶1)萃取β-胡萝卜素,采用GB/T 5009.83-2003的HPLC方法测定β-胡萝卜素含量,以448nm波长的紫外分光光度吸收值计算出色素损失率来探讨β-胡萝卜素的稳定性。结果:该菌株在液体发酵培养基中生长72hβ-胡萝卜素含量高达389.2μg/g干重,经实验确定,葡萄糖是最有利于β-胡萝卜素生成的碳源;蛋白胨是生产β-胡萝卜素的最佳氮源。提取的β-胡萝卜素耐热性较好,需置于暗处保存。结论:该菌种β-胡萝卜素产率明显高于国内外已报道的,有很好的开发前景。

碱热法辅助提取圆红冬孢酵母油脂

文章采用圆红冬孢酵母进行油脂发酵,并研究以其湿菌泥为原料,采用NaOH热辅助破壁进行油脂提取的方法。研究结果表明:当NaOH添加量为0.2 g/g时,样品经过78℃水浴处理3 h并用乙酸乙酯萃取,油脂提取率可达到99.3%;碱热法所得油脂的脂肪酸组成和中性脂含量与酸热法无显著差异。因此,碱热法是一种以湿菌泥为原料直接进行油脂提取的新方法,具有良好的应用前景。

表达透明颤菌血红蛋白对圆红冬孢酵母油脂积累的影响

产油酵母的油脂合成是高度耗氧的生物过程,为提高油脂合成过程中细胞利用氧气的能力,将透明颤菌的血红蛋白基因vgb整合到油脂高产菌株圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides,R.toruloides)的染色体中。首先构建了透明颤菌血红蛋白基因vgb表达载体pZPK-PPGK-hyg-TNOS-PGPD-vgb-THSP,再通过农杆菌介导转化的方法将其转化至R.toruloides NP11中,获得重组菌株。Western blot和CO差异光谱分析表明,透明颤菌血红蛋白在R.toruloides NP11中成功表达并且具有生物活性。摇瓶发酵结果表明:与出发菌株相比,在氧气充足条件下,重组菌株NG-21的油脂产量提高了18%;在氧气不足条件下,重组菌株NG-22的油脂产量提高了28%;在限氧和不限氧的条件下,透明颤菌血红蛋白均能够促进圆红冬孢酵母的油脂积累。

响应面法优化球磨破碎圆红冬孢酵母细胞工艺条件

为探究工业条件成熟的物理球磨法对圆红冬孢酵母细胞的破碎效果,采用油脂得率为评价指标,考察了研磨介质、研磨时间、球磨机转速、介质添加量4个关键性因素的影响。在单因素试验的基础上,利用响应面法确定了最佳的细胞破碎工艺条件。结果表明:最佳细胞破碎工艺条件为研磨介质为硅酸锆珠、研磨时间2. 5 h、球磨机转速360 r/min、介质添加量(以酵母液体积计) 41%,在此工艺条件下油脂得率为57. 32%。

圆红冬孢酵母脂肪酸合酶的生物信息学分析

对圆红冬孢酵母脂肪酸合酶进行生物信息学分析并构建系统进化树。利用MEGA7.0软件构建出系统进化树,应用ProtParam,ProtScal,TMHMM,SigalP,Kinasephos,PredictNLS,NPSA和SMART等生物信息学方法,分别对蛋白质的理化性质、跨膜区、信号肽,以及核输出信号、二级结构和结构域进行预测。结果表明,该脂肪酸合酶在进化过程中相对比较保守,是亲水性蛋白;它存在跨膜结构;它没有信号肽但有核输出信号;它的二级结构有多个α-螺旋与延伸链;它有6个保守结构域。

重金属Cd^(2+)对圆红冬孢酵母菌的氧化胁迫机制研究

以圆红冬孢酵母菌为实验材料,探究重金属Cd^(2+)对圆红冬孢酵母菌生理生长的影响及氧化胁迫损伤机制。主要包括在不同浓度的重金属Cd^(2+)胁迫下圆红冬孢酵母菌的葡萄糖消耗与生长情况、pH值的变化,并研究半致死胁迫浓度200umol/L下体内主要抗氧化酶SOD、CAT的活性变化以及脂质过氧化产物MDA、类胡萝卜素随时间的含量变化。结果表明:不同浓度的重金属Cd^(2+)对圆红冬孢酵母的生长有不同程度的影响,低浓度重金属Cd^(2+)对酵母的生长没有抑制作用,而有一定促进作用,当浓度高于5umol/L时酵母菌的生长均受到抑制;PH逐渐升高;Cd^(2+)处理下脂质过氧化产物MDA含量显著提高,SOD活性升高,CAT与类胡萝卜素主要在对数时期起到清除自由基的作用。

重金属Cd^(2+)与圆红冬孢酵母菌相互作用研究

本文研究了在不同浓度的重金属Cd^(2+)胁迫下圆红冬孢酵母菌的生长情况、Cd^(2+)吸附量以及油脂变化。结果表明:不同浓度的重金属Cd^(2+)对圆红冬孢酵母菌的生长情况有不同程度的影响,Cd^(2+)浓度越大,抑制生长越明显;圆红冬孢酵母菌对不同浓度的Cd^(2+)均有吸附,在48 h处达到吸附平衡,吸附量为4～6 mg;在培养到72 h时,各浓度下油脂含量达到最高,依次是85%、76%、57%、43%、38%。