圈卷产色链霉菌分化及其特性的研究

链霉菌分化的分子生物学研究是一个饶有兴趣并富有挑战性的世界前沿研究课题.在原核生物的分化研究中,主要以枯草杆菌(Bacillus subtilis)作为模式系统,但枯草杆菌的生命周期尤其是分化过程远比链霉菌简单,不象链霉菌有基质菌丝、气生菌丝、菌丝螺旋和孢子分隔那样的发育分化过程[1].在真核生物中也有分化研究的报道,如构巢曲霉、酵母等.由于真核生物的基因结构比原核生物复杂得多,弄清分化中基因调控的关系就更加困难.因此,选用链霉菌作分化研究的材料有其独一无二的优越性.国际上有关链霉菌的分子生物学研究,近年来主要以链霉菌的抗生素生物合成基因和链霉菌的分化基因两个大的方面作为研究的热点和主攻方向,并展开了一些开拓性的研究.

圈卷产色链霉菌尼可霉素生物合成基因——sanH和sanI的研究

通过反向遗传学方法克隆到圈卷产色链霉菌尼可霉素生物合成基因簇中约 7 0kb的DNA片段。该片段除含有尼可霉素生物合成基因sanF外 ,对sanF上游约 2 2kb的BglⅡDNA片段进行序列测定及分析表明 ,还含有两个完整的开放阅读框 (ORF)。ORF1由 1 2 33个核苷酸组成 ,ORF2由 1 95个核苷酸组成 ,它们分别编码由 41 0个氨基酸残基和 64个氨基酸残基组成的蛋白质 ,依次命名为sanH和sanI。蛋白序列数据库比较结果表明 ,SanH和SanI与浅灰链霉菌 (Streptomycesgriseolus)中共转录的细胞色素P450 (cytochromeP450 )和铁氧还蛋白 (ferredoxin)有较高的同源性 ,一致性分别为 46%和 56% ,相似性分别为 62 %和70 %。基因功能研究表明 ,sanH基因的破坏虽不影响圈卷产色链霉菌产生的尼可霉素的生物活性 ,但该基因可能参与了尼可霉素羟基化反应的生物合成。

圈卷产色链霉菌尼可霉素生物合成基因—sanL的结构与功能

利用染色体步移策略 ,以尼可霉素生物合成相关的基因片段为探针 ,从圈卷产色链霉菌中克隆到了一个大约 1 0kb的DNA片段。序列分析表明此片段中除含有sanK外 ,在sanK的上游还有一个完整开放阅读框———sanL。sanL与sanK的转录方向相同 ,具有 1 2 81个核苷酸 ,起始密码子为 345位的ATG ,终止密码子为 1 62 3位的TGA。利用Blastx程序进行的分析揭示 ,此基因可能编码一个赖氨酸 2 氨基转移酶。基因功能研究表明 ,该基因是圈卷产色链霉菌尼可霉素生物合成所必需的。

圈卷产色链霉菌尼可霉素生物合成基因──sanJ的克隆及功能研究

以尼可霉素生物合成相关的基因片段为探针，从圈卷产色链霉菌cosmid基因文库中筛选到1个大约7.5kb的DNA片 段，将此DNA片段克隆到载体pBluescripM13-的Kpn I位点，得到了重组质粒pNL2200。对pNL2200中外源DNA片段进行了一系列的亚克隆及部分核苷酸序列分析，结果表明，2.3kb的Sal I-BamH DNA片段中含有1个完整的开放阅读框，起始密码子为271位的GTG，终止密码子为1954位的TGA，该基因的大小为1 686bp，编码1个大小为561个氨基酸的蛋白质产物。利用blastx程序在蛋白质数据库中进行同源比较，结果揭示此基因产物与腺苷酸形成酶超家族的连接酶有44%的一致性。此外，该基因的破坏导致圈卷产色链霉菌尼可霉素生物合成能力的丧失，证明它是尼可霉素生物合成所必需的，命名其为sanJ。

圈卷产色链霉菌尼可霉素生物合成基因-sanK的克隆及功能研究

利用染色体步移策略 ,以尼可霉素生物合成相关的基因片段为探针 ,从圈卷产色链霉菌中克隆到了一个大约 10kb的DNA片段。对其中 1 8kb的PvuII SacII片段进行了序列分析 ,结果表明 :此片段中含有一个具有1170个核苷酸的完整开放阅读框 ,起始密码子为 44 7位的ATG ,终止密码子为 16 14位的TGA ,推测其编码一个389个氨基酸的蛋白质产物。利用BLASTX程序进行的分析揭示 ,此基因编码一个肌氨酸单体氧化酶。基因功能研究结果表明 ,此基因与圈卷产色链霉菌尼可霉素生物合成直接相关 ,命名为sanK。

圈卷产色链霉菌分化相关基因——saw1的结构和功能

用双脱氧链终止法进行了分化基因——saw1的双链测序.结果表明在1500bp的DNA片段中有一个完整的开读框架(ORF),其编码区是在419bp至1252bp处.其产物与已知的天蓝色链霉菌whiG的氨基酸序列有89%的同源性.当把1500bp的saw1DNA片段插入到链霉菌表达质粒载体pIJ702后,构建的重组质粒转化天蓝色链霉菌孢子形成缺陷突变株C71,可使C71形成孢子和灰色色素.用基因破坏的策略进一步研究了该基因的生物学功能,结果表明saw1在圈卷产色链霉菌气生菌丝到孢子形成的发育转变中有重要作用,是分化中控制孢子发育起始的一个重要基因.

圈卷产色链霉菌分化关键基因——saw1的克隆及酶切分析

链霉菌是现代生物学研究中一种重要的微生物,它有两个突出的特征:其一,有无与伦比的合成次生代谢产物的能力,世界上所知数千种抗生素的70％由其产生。其二,有一个复杂的发育分化的生命周期,是微生物分化研究的一个最好的模式材料。链霉菌分化主要为形态分化和生理分化,两者彼此独立又相互关联,构成复杂的分化调控网络,研究分化基因的调控不但有重要的理论意义,而且可用于控制抗生素的生物合成,因此弄清合成途径的分子机制,也有潜在的应用价值。

Tn4560在圈卷产色链霉菌中的转座及其在尼可霉素生物合成相关基因克隆中的应用

采用常规转化方法用来自天蓝色链霉菌J1 5 0 1的质粒pUC1 1 6 9(pMT6 6 0∷Tn45 5 6∷vph)多次转化尼可霉素产生菌圈卷产色链霉菌野生型 71 0 0的原生质体 ,均未得到转化子。采用限制性热衰减法于 5 0℃ ,3 0min溶菌制备 71 0 0的原生质体 ,获得了转化子 ,但转化频率极低 ,只有 0 4个转化子 μgDNA。用来自 71 0 0的pUC1 1 6 9再转化不含pUC1 1 6 9的 71 0 0原生质体 ,转化频率提高 1 0 3 ～ 1 0 4 倍。于 3 9℃ ,MM Vio条件下培养携带有pUC1 1 6 9的 71 0 0孢子 ,Tn45 6 0发生转座 ,筛选到 40 6 8个转座菌落 ,并从中得到 8株尼可霉素阻断突变株 ;对这 8株突变株的总DNA进行Southern杂交分析表明 ,Tn45 6 0至少在 4个不同的位点插入到 71 0 0的染色体上。用实验室已获得的与尼可霉素生物合成有关的 3 0kbDNA片段为探针和经不同酶切的 8株突变株的总DNA进行Southern杂交 ,结果表明 ,除阻断突变株Nik5有杂交信号且杂交信号大小均同野生型 71 0 0外 ,其余 7株突变株均无任何杂交信号。HPLC分析表明 ,8株突变株在产生尼可霉素方面可分为两种类型 ,Nik5为 1种类型 ,其余 7株为另一种类型。初步推测这 7株突变株基因组DNA与尼可霉素生物合成有关的部分发生了大片断的缺失。以Tn45 6 0为探针 ,构建Nik5的部分?

圈卷产色链霉菌硝基烷类氧化酶的分离纯化及酶学性质

圈卷产色链霉菌硝基烷类氧化酶基因naoA在大肠杆菌中获得了成功表达 ,从含有重组质粒pNA1 0 1 (pET2 3b∷naoA)的工程菌株BL2 1 (DE3 )中分离纯化了硝基烷类氧化酶 ,SDS PAGE检测为均一。对纯酶进行了酶学性质及动力学研究。底物为 1 硝基丙烷、2 硝基丙烷和硝基乙烷时 ,在 0 4mol L的磷酸缓冲液中 ,酶的最适反应pH值为 7～ 8,最适反应温度为48℃～ 5 6℃。室温保存 6d后 ,酶的活性保持了 43 3 % ,但对 6 0℃以上的高温敏感。硫醇化合物如巯基乙醇、还原型谷胱甘肽不同程度地抑制酶活性 ,特别是NADH ,其浓度为 1mmol L时 ,酶活性几乎全部丧失。以 1 硝基丙烷为底物时 ,NaoA的Km 为 3 5 7mmol L ,Vmax 为0 1 99μmol (μg .min) 。

圈卷产色链霉菌lon基因的克隆及酶切分析

圈卷产色链霉菌是从我国东北土壤中筛选的一株Nkkomycin产生菌。在固体基本培养基上具有典型的链霉菌发育分化特征。经诱变得到不产孢子的白色突变株和不能形成气生菌丝的光秃型突变株。部分白色突变株和全部光秃型突变株在形态分化受阻的同时,也失去了产生Nikkomycin的能力。表明在圈卷产色链霉菌中,参与形态分化的基因与抗生素生物合成基因可能密切相关。

圈卷产色链霉菌7100分化相关基因——sawE的结构与功能

以天蓝色链霉菌的whiB基因为探针 ,从圈卷产色链霉菌 71 0 0的总DNA部分文库中克隆了含有whiB同源序列的 2 8kbDNA片段 ,并对其中的 1 4kb片段进行了序列测定。序列分析表明 ,该片段含有一个完整的开放阅读框—sawE。预测的蛋白质结构及同源性分析显示 ,sawE与天蓝色链霉菌孢子形成早期的关键基因whiB高度同源 ,编码产物为一个调控蛋白。sawE的破坏使圈卷产色链霉菌 71 0 0的分化终止在气生菌丝阶段 ,在延长培养时间的情况下仍保持白色的表型 ,菌丝不能分隔 ,不能形成成熟的灰色孢子 ,结果表明sawE基因是一个与圈卷产色链霉菌分化有关的重要基因。

圈卷产色链霉菌尼可霉素生物合成基因sanB的克隆、结构和功能

从圈卷产色链霉菌 ７１００中克隆到 ６ ｋｂ与尼可霉素合成有关的 ＤＮＡ片段，对其中的部分片段进行了序列分析，其中 １．９ ｋｂ的 Ｔｔｈｌ１１１Ｉ片段含有一个 １７４０ ｂｐ的完整可读框，起始密码子为１００ ｂｐ处的 ＧＴＧ，终止密码子为 １８４０ ｂｐ处的 ＴＧＡ，编码一个由 ５８０个氨基酸残基组成的蛋白质该基因命名为ｓａｎＢ．蛋白序列数据库同源性比较结果表明，ｓａｎＢ的编码产物与天蓝色链霉菌中组氨酸磷酸氨基转移酶有３１％的一致性和４７％的相似性．采用基因破坏策略研究了ｓａｎＢ的功能，发现ｓａｎＢ基因的破坏导致野生型菌株失去合成尼可霉素的能力，结果揭示ｓａｎＢ是尼可霉素生物合成中一个新的重要基因．

圈卷产色链霉菌san7324和san7324L基因阻断对形态分化和尼可霉素产生的影响

【目的】圈卷产色链霉菌全局性调控基因wblA阻断突变后,尼可霉素不再产生。RNA-seq和转录分析表明san7324基因在野生型菌株中可以正常转录,而在wblA阻断突变株(ΔwblA)中不能转录,为此本文旨在揭示san7324与尼可霉素产生的关系。【方法】利用同源双交换策略对san7324进行基因阻断,而后通过基因遗传回补及对尼可霉素生物合成相关基因的转录分析等方法研究san7324的功能。【结果】在相同培养条件下,阻断突变株Δsan7324与野生型菌株相比失去了合成尼可霉素的能力。我们通过同源比对发现圈卷产色链霉菌中还存在一个与san7324同源的基因san7324L,该基因的阻断导致尼可霉素产量降低。当san7324和san7324L两个基因同时被阻断后,得到的突变株Δsan7324-san7324L生长稀疏而且不能正常发育分化形成灰色表型的孢子或孢子链,只能形成白色表型的气生菌丝,同时也丧失了合成尼可霉素的能力。当这两个基因(san7324-san7324L)回补双突变株后,则恢复了野生型的表型(能形成孢子链并恢复尼可霉素的产生)。进一步的研究初步表明san7324和san7324L的阻断主要影响了尼可霉素生物合成基因簇中途径特异性调控基因sanG的转录水平,从而影响圈卷产色链霉菌的发育分化和尼可霉素的产生。【结论】该结果为链霉菌形态分化与生理代谢关系的研究提供了更多的证据,同时为多效调控基因wblA作用机制的阐明奠定了基础。

尼可霉素生物合成基因簇的改造及其异源表达

【目的】异源表达尼可霉素生物合成基因簇,为尼可霉素核苷和肽基缩合机制研究以及尼可霉素与其它核苷类抗生素的组合生物合成奠定基础。【方法】以含有尼可霉素生物合成基因簇的pNIK为出发质粒,通过PCR-targeting的方法,将基因簇中san G和san F的启动子替换为组成型hrd B启动子,构建重组质粒pNIKm。通过接合转移的方法分别将pNIK和pNIKm导入天蓝色链霉菌M1146中,获得异源表达菌株M1146-NIK和M1146-NIKm,并通过RT-PCR检测基因簇的表达情况。最后通过抗菌活性实验和产物的分离鉴定,比较M1146-NIK和M1146-NIKm的抗菌活性和尼可霉素的产生情况。【结果】pNIK和pNIKm在异源宿主天蓝色链霉菌M1146成功表达;M1146-NIK和M1146-NIKm均有明显的抗菌活性;M1146-NIK和M1146-NIKm均能产生少量的尼可霉素X、Z和假尼可霉素Z;M1146-NIK大量积累尿苷,而M1146-NIKm大量积累尿苷、核糖基-4-甲酰-4-咪唑-2-酮和吡啶同型苏氨酸。【结论】尼可霉素生物合成基因簇成功异源表达,并分离鉴定了尼可霉素产物及其生物合成中间体。本研究将为尼可霉素核苷和肽基缩合的酶学机制研究以及尼可霉素与其它核苷类抗生素组合合成新型杂合抗生素提供理论依据和指导。